自發(fā)性糖尿病小鼠腎小球細(xì)胞Nampt和骨形態(tài)發(fā)生蛋白7的表達(dá)及煙酰胺單核苷酸在高糖條件下對大鼠腎小球系膜HBZY-1細(xì)胞纖維化的影響

陳葉，蔡聰捷，韋日明，喬偉，胡婷婷，王平，馮樂平

（桂林醫(yī)學(xué)院1.公共衛(wèi)生學(xué)院，2.生物技術(shù)學(xué)院，3.藥學(xué)院，廣西桂林541004）

自發(fā)性糖尿病小鼠腎小球細(xì)胞Nampt和骨形態(tài)發(fā)生蛋白7的表達(dá)及煙酰胺單核苷酸在高糖條件下對大鼠腎小球系膜HBZY-1細(xì)胞纖維化的影響

陳葉1，蔡聰捷1，韋日明2，喬偉3，胡婷婷2，王平1，馮樂平1

（桂林醫(yī)學(xué)院1.公共衛(wèi)生學(xué)院，2.生物技術(shù)學(xué)院，3.藥學(xué)院，廣西桂林541004）

目的 探討糖尿病腎小球細(xì)胞煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（Nampt）與骨形態(tài)發(fā)生蛋白7（BMP7）表達(dá)的關(guān)系及煙酰胺單核苷酸（NMN）緩解糖尿病腎小球細(xì)胞炎癥纖維化的作用機(jī)制。方法①動物實驗：C57/ BL6自發(fā)性糖尿病小鼠和C57/BL6野生型小鼠，均采取普通飼料喂養(yǎng)，當(dāng)自發(fā)性糖尿病小鼠血糖＞（34.2± 1.9）mmol·L-1并出現(xiàn)明顯腎組織損傷時，取腎組織進(jìn)行病理切片，免疫共聚焦法檢測腎小球細(xì)胞Nampt、核轉(zhuǎn)錄因子κB p65（NF-κB p65）、沉默調(diào)節(jié)蛋白1（SIRT1）和BMP7的表達(dá)。②細(xì)胞實驗：葡萄糖200 mmol·L-1培養(yǎng)大鼠腎小球系膜HBZY-1細(xì)胞，在不同時間（24，48和72 h）以及不同濃度NMN（50，100和200 μmol·L-1）處理24 h時后，免疫印跡法檢測Nampt和BMP7的表達(dá)；葡萄糖200 mmol·L-1處理HBZY-1細(xì)胞96 h，免疫熒光法檢測NF-κB p65和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達(dá)；應(yīng)用NMN 100 μmol·L-1和Nampt特異抑制劑FK866 10 μmol·L-1作用HBZY-1細(xì)胞24 h后，免疫印跡法檢測HBZY-1細(xì)胞Nampt，BMP7和NF-κB p65表達(dá)。結(jié)果 ①動物實驗：自發(fā)性糖尿病小鼠腎小球明顯萎縮，腎小球細(xì)胞Nampt和NF-κB p65的熒光強(qiáng)度比野生型小鼠明顯升高（P＜0.05），而BMP7和SIRT1的熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0.01）。②細(xì)胞實驗：Western蛋白印跡檢測顯示，葡萄糖200 mmol·L-1培養(yǎng)48和72 h，HBZY-1細(xì)胞Nampt表達(dá)增加（P＜0.01），BMP7表達(dá)下降（P＜0.01，P＜0.05）。葡萄糖200 mmol·L-1條件下加NMN 50，100和200 μmol·L-1作用24 h，各組BMP7表達(dá)均增加（P＜0.01）；免疫熒光結(jié)果 顯示，與細(xì)胞對照組比較，葡萄糖200 mmol·L-1處理HBZY-1細(xì)胞，NF-κB p65和α-SMA的熒光強(qiáng)度升高（P＜0.01）；NMN干預(yù)后，與葡萄糖200 mmol·L-1處理組比，Nampt和NF-κB p65表達(dá)降低（P＜0.01），BMP7表達(dá)增加（P＜0.01）；加FK866后，Nampt表達(dá)降低（P＜0.01），NF-κB p65表達(dá)下降，BMP7表達(dá)雖然有上升趨勢，但其表達(dá)增高沒有NMN組明顯。結(jié)論嚴(yán)重糖尿病狀態(tài)下，通過抑制內(nèi)源性Nampt過表達(dá)能夠上調(diào)BMP7，從而緩解腎小球細(xì)胞炎癥纖維化作用，NMN可能通過干預(yù)Nampt影響細(xì)胞BMP7表達(dá)。

糖尿病性腎?。荒I小球纖維化；煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶；p65；沉默調(diào)節(jié)蛋白1；骨形態(tài)發(fā)生蛋白7

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2017.06.009

煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide phosphoribosyl transferases，Nampt）又稱內(nèi)脂素（visfatin），是一種前B細(xì)胞克隆增強(qiáng)因子，在機(jī)體多種組織細(xì)胞內(nèi)，Nampt能夠同時作用于依賴NAD+的組蛋白去乙酰化酶（sirtuin type 1，SIRT1）和核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）兩種信號通路［1-3］。然而，在糖尿病腎病腎小球細(xì)胞內(nèi)，Nampt過度表達(dá)可以激活多種促炎癥纖維化因子，但機(jī)制尚未闡明。骨形態(tài)發(fā)生蛋白7（bone morphogenetic protein 7，BMP7）是轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族中成員之一，在成年動物腎組織高表達(dá)，參與不同細(xì)胞的生長、分化、趨化和凋亡［4］。研究表明，BMP7具有抗腎組織纖維化作用，作為纖維化負(fù)性調(diào)節(jié)因子，BMP7能夠與TGF-β1相互拮抗。增加BMP7表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）降解，減少多種促炎癥因子，對腎纖維化具有預(yù)防和治療作用［5-6］。糖尿病腎病發(fā)病早期主要累及腎小球［7-8］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病小鼠腎小球細(xì)胞內(nèi)源性Nampt過度表達(dá)時，BMP7表達(dá)明顯減少。由此推測，在腎小球細(xì)胞內(nèi)，Nampt可能與BMP7的表達(dá)存在某種內(nèi)在聯(lián)系。本研究應(yīng)用免疫共聚焦、免疫熒光和Western蛋白印跡技術(shù)分別對嚴(yán)重糖尿病小鼠腎小球細(xì)胞和高糖氧化應(yīng)激狀態(tài)下離體細(xì)胞探討Nampt和BMP7表達(dá)的相互關(guān)系，同時對煙酰胺單核苷酸（nicotinamide mononucleotide，NMN）在DN纖維化中的作用進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

含葡萄糖0.56 mmol·L-1的MEM培養(yǎng)液（美國Gibco公司）；10%胎牛血清（美國Gemini公司）；胰蛋白酶（工作液濃度0.25%）及青霉素和鏈霉素（終濃度分別為100 kU·L-1和100 kg·L-1）（中國Solarbio公司）；NMN（美國Sigma公司）；FK866（中國APExBIO公司）；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（中國捷世康公司）；兔抗小鼠Nampt和BMP7單抗（美國Bioword公司）;SIRT1和NF-κB p65單抗（英國Abcam公司）；兔抗大鼠Nampt和α平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）單抗（美國Santa公司）；抗大鼠BMP7單抗（美國Bioword公司）和NF-κB p65單抗（英國Abcam公司）；FITC標(biāo)記的羊抗兔多抗和Cy3標(biāo)記的羊抗兔多抗（美國LIFE公司）。GT-1640血糖檢測儀（日本ARKRAY Inc公司）；Cobas111全自動生化分析儀（美國Roche公司）；LSM700激光共聚焦掃描顯微鏡（德國Zeiss公司）；Mini-PROTEAN 3 CELL 165-3301電泳系統(tǒng)和小型垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 動物、細(xì)胞和分組

1.2.1 實驗動物

C57/LB6胰島素基因突變型糖尿病模型小鼠［9］（美國密歇根大學(xué)糖尿病實驗中心提供），雄性，體質(zhì)量25～30 g，該小鼠作為自發(fā)糖尿病實驗組，以野生型C57/LB6小鼠為對照組。全部動物實驗程序符合密歇根大學(xué)糖尿病實驗中心的倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)。兩組小鼠均采取普通飼料喂養(yǎng)，經(jīng)血糖測定和全自動生化分析儀分析，確定實驗組小鼠血糖≥（34.2±1.9）mmol·L-1和出現(xiàn)明顯血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和血清肌酐（serum creatinine，Scr）異常時，乙醚麻醉小鼠，脊椎脫臼處死，取腎組織進(jìn)行病理分析。

1.2.2 細(xì)胞處理和分組

用含葡萄糖5.6 mmol·L-1的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠腎小球系膜HBZY-1細(xì)胞（購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所），將細(xì)胞置于含5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中適應(yīng)性培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，收集細(xì)胞，按每孔1×106細(xì)胞移至35 cm培養(yǎng)皿中，分組如下：①葡萄糖200 mmol·L-1培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞，在不同時間（0，24，48和72 h）以及不同濃度NMN（0，50，100和200 μmol·L-1）處理24 h時后，免疫印跡法檢測Nampt和BMP7的表達(dá)；②葡萄糖200 mmol·L-1處理HBZY-1細(xì)胞96 h，免疫熒光法檢測NF-κB p65和α-SMA的表達(dá)；③正常對照組（含葡萄糖5.6 mmol·L-1的DMEM培養(yǎng)基）、Nampt特異性抑制劑（FK866）10 μmol·L-1組、NMN 100 μmol·L-1組、葡萄糖200 mmol·L-1組、葡萄糖200 mmol·L-1+FK866組、葡萄糖200 mmol·L-1+ NMN組和葡萄糖200 mmol·L-1+FK866+NMN組；于直徑35 cm培養(yǎng)皿中，每組5復(fù)孔。細(xì)胞干預(yù)至第5天，分別加入FK866（終濃度10 μmol·L-1）和NMN（終濃度100 μmol·L-1）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，蛋白免疫印跡法分別檢測FK866和NMN對細(xì)胞Nampt，NF-κB p65和BMP7表達(dá)的影響。

1.3 全自動生化分析儀檢測小鼠血糖、尿素氮和血清肌酐水平

定期小鼠尾靜脈采血，應(yīng)用血糖檢測儀測定血糖；應(yīng)用全自動生化分析儀檢測BUN和Scr水平。

1.4 HE染色檢測小鼠腎小球組織病理變化

結(jié)合1.3結(jié)果 ，待出現(xiàn)明顯腎損傷后，取腎組織進(jìn)行石蠟包埋切片，HE染色，普通光鏡下觀察腎組織病理變化。

1.5 免疫共聚焦檢測腎小球細(xì)胞Nampt，BMP7，NF-κB p65和SlRT1表達(dá)

4%多聚甲醛固定腎組織，脫水后石蠟包埋并切片，組織切片經(jīng)脫蠟和乙醇梯度脫水，枸櫞酸微波修復(fù)后，加待檢蛋白一抗：抗Nampt（1∶500），BMP7（1∶1000），NF-κB p65（1∶1000）和SIRT1（1∶400）單抗進(jìn)行孵育，4℃冰箱靜置過夜，加入相應(yīng)熒光標(biāo)記二抗（1∶1000），37℃避光孵育1 h；用PBS沖洗3次，DAPI避光染色5 min，N-丙基沒食子酸鹽（N-propyl gallate，NPG）（抗熒光淬滅劑）處理后樹脂膠封片，共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測腎小球細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)待測蛋白的表達(dá)。綠色熒光顯示腎小球細(xì)胞內(nèi)Nampt表達(dá)，紅色熒光分別顯示腎小球細(xì)胞內(nèi)BMP7，NF-κB p65和SIRT1的表達(dá)，用Image J2×軟件計算10個視野單位面積平均熒光強(qiáng)度表示蛋白表達(dá)水平。

1.6 Western蛋白印跡法檢測HBZY-1細(xì)胞Nampt，NF-κ B p65和BMP7蛋白表達(dá)

將1×106細(xì)胞移至直徑35 cm培養(yǎng)皿中，葡萄糖200 mmol·L-1培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞24，48和72 h后，Western蛋白印跡法檢測細(xì)胞Nampt和BMP7表達(dá)；每孔1×106細(xì)胞移至35 cm培養(yǎng)皿中，葡萄糖200 mmol·L-1培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞72 h后，為鑒別Nampt是否對BMP7表達(dá)發(fā)揮作用，在葡萄糖200 mmol·L-1培養(yǎng)的細(xì)胞中加入NMN 0，50，100和200 μmol·L-1，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，Western蛋白印跡法檢測NMN對細(xì)胞BMP7表達(dá)的影響。

為確定Nampt對BMP7的調(diào)控作用，應(yīng)用Nampt特異性抑制劑FK866 10 μmol·L-1作用后檢測BMP7的表達(dá)。于直徑35 cm培養(yǎng)皿中1 mL的1×106細(xì)胞，每組5復(fù)孔。細(xì)胞應(yīng)用葡萄糖200 mmol·L-1連續(xù)干預(yù)，每天換液，至第5天時，分別加入FK866 10 μmol·L-1，NMN 100 μmol·L-1和FK866 10 μmol·L-1+NMN 100 μmol·L-1，繼續(xù)培養(yǎng)24 h收集細(xì)胞，Western蛋白印跡法檢測FK866和NMN對Nampt，NF-κB p65和BMP7表達(dá)的影響。取出培養(yǎng)細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液于Eppendorf離心管中，超聲波粉碎儀裂解蛋白，經(jīng)4℃低溫12 000×g，15 min離心取上清液；蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電壓120 V電泳，PVDF半干式轉(zhuǎn)膜（電壓150V，60 min），封閉，加入待檢蛋白一抗〔Nampt（1∶500），NF-κB p65（1∶200）和BMP7（1∶1000）〕，4℃孵育過夜，次日加入相應(yīng)二抗（1∶2000）后孵育1 h，將PVDF膜置于凝膠成像系統(tǒng)中獲取相應(yīng)蛋白條帶的積分吸光度（integrated absorbance，IA）值，蛋白相對表達(dá)水平用IA目標(biāo)蛋白/IAβ肌動蛋白比值表示。

1.7 免疫熒光檢測HBZY-1細(xì)胞NF-κ B p65和α-SMA蛋白的表達(dá)

按每孔1 mL含1×106細(xì)胞接種于置蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)96 h。取出蓋玻片，加待檢蛋白一抗〔NF-κB p65（1∶500）和α-SMA（1∶400）〕4℃冰箱孵育過夜，加入相應(yīng)熒光標(biāo)記二抗（1∶1000），于37℃避光孵育1 h，DAPI復(fù)染5 min。NF-κB p65和α-SMA分別使用488 nm和558 nm激發(fā)光檢測，用Image J2×軟件計算10個視野單位面積平均熒光強(qiáng)度表示蛋白表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果 數(shù)據(jù)均采用x±s表示，應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用t檢驗進(jìn)行兩組間均數(shù)比較，多組均數(shù)比較采用方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1自發(fā)性糖尿病C57/BL6小鼠發(fā)病后血糖、BUN和Scr水平變化

與野生型C57/BL6小鼠比較，12周后自發(fā)性糖尿病C57/BL6小鼠的血糖濃度達(dá)（34.2±1.9）mmol·L-1，血中非蛋白氮的代表型產(chǎn)物BUN和Scr明顯升高（P＜0.01）（表1）。提示該組小鼠腎組織出現(xiàn)了明顯的病理改變。

Tab.1Concentration of blood glucose，blood urea nitrogen（BUN）and serum creatinin（SCR）in C57/BL6 spontaneous diabetic mice

2.2 自發(fā)性糖尿病C57/BL6小鼠腎小球組織病理改變

當(dāng)自發(fā)性糖尿病小鼠血糖達(dá)（34.2±1.9）mmol·L-1時，取腎組織觀察病理變化。HE染色結(jié)果 顯示，與野生型C57/BL6小鼠比較，自發(fā)性糖尿病C57/BL6小鼠腎小球萎縮，腎小管腔變狹窄，細(xì)胞出現(xiàn)纖維性變趨勢（圖1）。提示糖尿病小鼠已出現(xiàn)腎實質(zhì)病變。

Fig.1 Pathologyical changes of glomeruli in spontaneous diabetic mice detected by HE stainning.The arrows indicate inflammatory cells infiltration and cell arrangement disorder.

2.3 自發(fā)性糖尿病小鼠腎小球細(xì)胞Nampt和BMP7的表達(dá)

免疫共聚焦檢測結(jié)果 （圖2）顯示，與野生型小鼠相比，自發(fā)性糖尿病小鼠腎小球內(nèi)細(xì)胞致密，體積變小，腎實質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Nampt熒光強(qiáng)度增加（P＜0.05），BMP7表達(dá)減少（P＜0.01），提示細(xì)胞內(nèi)Nampt過度表達(dá)。

Fig.2Expression of nicotinamide phosphoribosyl transferases（Nampt）and bone morphogenetic protein 7（BMP7）in renal parenchyma cells of diabetic C57/LB6 mouse by immunefocused fluorescence.Green：Nampt；Red:BMP7；Blue：Nuclei.FI：fluorescence intensity.B was the semi-quantitative result of A.x±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01, compared with wild mice group.

2.4 自發(fā)性糖尿病小鼠腎小球細(xì)胞Nampt和NF-κ B p65的表達(dá)

免疫共聚焦結(jié)果 （圖3）顯示，與野生型小鼠比較，自發(fā)性糖尿病小鼠腎小球內(nèi)源性Nampt（綠色）和NF-κB p65的熒光（紅色）強(qiáng)度明顯增加（P＜0.05）。

Fig.3 Expression of Nampt and NF-κ B p65 in renal parenchyma cells of diabetic C57/BL6 mice by immunefocused fluorescence detection.A：the expression and location of Nampt（green fluorescence），NF-κB p65（red fluorescence）and nuclei（blue fluorescence）in glomerular cells；B was the semi-quantitative result of A.x±s.n=3.＊P＜0.05，compared with wild mice group.

2.5 自發(fā)性糖尿病小鼠腎小球細(xì)胞Nampt和SlRT1表達(dá)

免疫共聚焦結(jié)果 顯示，與野生型小鼠相比，自發(fā)性糖尿病小鼠腎小球細(xì)胞Nampt的熒光強(qiáng)度增加（P＜0.05），SIRT1的熒光（紅色）強(qiáng)度減弱（P＜0.01）（圖4）。提示自發(fā)性糖尿病小鼠腎小球細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Nampt過度表達(dá)。

2.6 葡萄糖200 mmol·L-1對HBZY-1細(xì)胞Nampt和BMP7表達(dá)的影響

Western蛋白印跡檢測結(jié)果 （圖5）顯示，葡萄糖200 mmol·L-1對HBZY-1細(xì)胞進(jìn)行氧化應(yīng)激48和72 h時，細(xì)胞內(nèi)源性Nampt表達(dá)較對照組均明顯增加（P＜0.01）；BMP7明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）。

2.7 NMN對高糖致氧化應(yīng)激HBZY-1細(xì)胞BMP7表達(dá)的影響

Western蛋白印跡檢測結(jié)果 （圖6）顯示，葡萄糖200 mmol·L-1處理72 h后，加NMN 50，100和200 μmol·L-1處理24 h，與對照組（NMN 0 μmol·L-1）比較，各處理組BMP7表達(dá)明顯增加（P＜0.01）。

Fig.4 Expression of Nampt and sirtuin type1（SlRT1）in renal parenchyma cells of diabetic C57/BL6 mice by immunofocused fluorescence detection.A：the expression and location of Nampt（green fluorescence），SIRT1（red fluorescence）and nuclei（blue fluorescence）in glomerular cells FI；B was the semi-quantitative result of A.x±s.n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with wild mice group.

Fig.5 Effect of incubation time on expression of Nampt and BMP7 in glucose 200 mmol·L-1oxidative stressed HBZY-1 cells.IA:integrated absorbance.x±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control（0）group.

Fig.6 Concentration-effect of nicotinamide mononucleotide（NMN）on expression of BMP7 in HBZY-1 cells treated with glucose 200 mmol·L-1.HBZY-1 and cells were cultured in glucose 200 mmol·L-1medium for 72 h and then treated with NMN 50，100 and 200 μmol·L-1for 24 h.x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with control（0）group.

2.8 葡萄糖200 mmol·L-1對HBZY-1細(xì)胞內(nèi)NF-κ B p65和α-SAM表達(dá)的影響

免疫熒光結(jié)果 （圖7）顯示，葡萄糖200 mmol·L-1培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞96 h時，NF-κB p65和α-SMA蛋白表明顯增加（P＜0.01），提示高濃度葡萄糖氧致化應(yīng)激的HBZY-1細(xì)胞已經(jīng)有炎癥因子和前纖維化因子的表達(dá)。

Fig.7 Effect of glucose 200 mmol·L-1on expression of NF-κ B p65 and α-smooth muscle actin（α-SMA）in HBZY-1 cells by immunofluorescence.A:FI represents expression and location of the proteins in HBZY-1 cells，corresponding to the nuclei（blue fluorescence），α-SMA（green fluorescence）and NF-κBp65（red fluorescence）.B was the semiquantitative result of A.x±s.n=3.＊＊P＜0.01 compared with normal cell group.

2.9 NMN對高糖致氧化應(yīng)激HBZY-1細(xì)胞Nampt，NF-κ B p65和BMP7表達(dá)的變化

Western蛋白印跡結(jié)果 （圖8）顯示，NMN對正常濃度葡萄糖（5.6 mmol·L-1）培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)源性BMP7表達(dá)有抑制作用，Nampt和NF-κB p65表達(dá)未見明顯變化。但在高濃度葡萄糖培養(yǎng)的細(xì)胞中，與葡萄糖200 mmol·L-1組比較，NMN干預(yù)后細(xì)胞Nampt和NF-κB p65表達(dá)減少（P＜0.01），BMP7表達(dá)明顯增加（P＜0.01）。與葡萄糖200 mmol·L-1+ NMN組比較，葡萄糖200 mmol·L-1+FK866+NMN組Nampt，NF-κB p65和BMP7表達(dá)未見明顯差異。

Fig.8 Effect of NMN on expression of Nampt，NF-κ B p65 and BMP7 in HBZY-1 cells.1:glucose 5.6 mmol·L-1；2：glucose 5.6 mmol·L-1+KF866；3：glucose 5.6 mmol·L-1+NMN；4：glucose 200 mmol·L-1；5：glucose 200 mmol·L-1+FK866；6：glucose 200 mmol·L-1+NMN 100 μmol·L-1；7：glucose 200 mmol·L-1+ FK866 10 μmol·L-1+NMN 100 μmol·L-1.In all glucose 200 mmol·L-1groups，glucose 200 mmol·L-1intervened cells for 5 d，then add FK866 10 μmol·L-1（final concentration），NMN 100 μmol·L-1（final concentration）alone or combination,respectively.All cells were collected after 24 h culture.x±s.n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with glucose 200 mmol·L-1group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重糖尿病小鼠腎小球細(xì)胞中內(nèi)源性Nampt和NF-κB p65表達(dá)顯著增加，此時SIRT1和BMP7表達(dá)則明顯下降。以往研究表明，Nampt過度表達(dá)能夠激活多種炎癥因子和前纖維化因子，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)［2］。有文獻(xiàn)報道，在一定條件下，BMP7能夠在腎組織細(xì)胞中表達(dá)，并通過多種途徑對腎組織的炎癥纖維化發(fā)揮拮抗作用［10］。同時也有文獻(xiàn)報道，當(dāng)腎損傷（包括糖尿病腎?。r，BMP7表達(dá)減少和活性下降，但機(jī)制仍不清楚［6，11-12］。

體外實驗發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用高濃度葡萄糖（200 mmol·L-1）處理HBZY-1細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的延長，Nampt表達(dá)不斷增加，而BMP7表達(dá)則呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。說明兩者在蛋白表達(dá)方面出現(xiàn)負(fù)增長效應(yīng)。相同糖濃度條件下，應(yīng)用NMN干預(yù)發(fā)現(xiàn)，BMP7的表達(dá)與NMN的濃度有關(guān)，由此進(jìn)一步說明了Nampt和BMP7在細(xì)胞內(nèi)可能存在某種內(nèi)在的聯(lián)系。在高濃度葡萄糖作用下，NF-κB p65和α-SMA表達(dá)增加，說明葡萄糖在200 mmol·L-1時能夠明顯誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥和纖維化因子表達(dá)增加。

為進(jìn)一步驗證Nampt和BMP7之間的內(nèi)在關(guān)系，應(yīng)用Nampt的特異性抑制FK866作用于葡萄糖200 mmol·L-1培養(yǎng)的細(xì)胞，觀察細(xì)胞內(nèi)源性Nampt和BMP7表達(dá)的變化。結(jié)果 顯示，在FK866，NMN和FK866+NMN各組細(xì)胞中，內(nèi)源性Nampt和NF-κB p65表達(dá)均顯著減少，而BMP7表達(dá)明顯增加。說明在NMN干預(yù)細(xì)胞內(nèi)源性Nampt表達(dá)時，BMP7表達(dá)明顯增加。上述研究表明，在機(jī)體糖尿病的氧化應(yīng)激條件下，腎小球細(xì)胞內(nèi)源性Nampt過度表達(dá)，可能會直接或間接影響B(tài)MP7表達(dá)。有文獻(xiàn)報道，在腎纖維化過程中，結(jié)締組織生長因子和TGF-β1等［10，13］也可以通過BMP7/Smads/TGF-β1等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路控制BMP7的表達(dá)和活性［10，13］。在這個過程中，還有相關(guān)因子均與Nampt的過度表達(dá)密切相關(guān)［14］。由此可見，Nampt在糖尿病腎病發(fā)病過程中發(fā)揮著不容忽視的作用，可能作為一個控制糖尿病腎病的新靶點。Nampt是細(xì)胞合成DNA的關(guān)鍵酶，應(yīng)用FK866能夠有效地抑制Nampt表達(dá)，但同時影響了細(xì)胞活性和功能［15］。研究顯示，NMN既是NAD+的前體物質(zhì)，又是Nampt合成的底物。在葡萄糖200 mmol·L-1氧化應(yīng)激條件下，其能夠通過負(fù)反饋抑制內(nèi)源性Nampt表達(dá)，同時也可以通過NAD+促進(jìn)SIRT1和BMP7表達(dá)增加。本研究結(jié)果 提示，細(xì)胞內(nèi)源性Nampt與BMP7在表達(dá)方面可能存在某種關(guān)聯(lián)，NMN及其類似物可能在預(yù)防和治療糖尿病腎病腎小球纖維化中發(fā)揮作用。

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Expression of Nampt and bone morphogenetic protein 7 in spontaneous diabetic mice and effect of nicotinamide mononucleotide on fibrosis of rats′glomerular cells HBZY-1 in high glucose culture

CHEN Ye1,CAI Cong-jie1,WEI Ri-ming2,QIAO Wei3,HU Ting-ting2,WANG Ping1,FENG Le-ping1
(1.Public Health School,2.Biotechnology School,3.Pharmacy School,Guilin Medical University, Guilin 541004,China)

OBJECTlVETo investigate the mechanism of nicotinamide mononucleotide(NMN)on inflammation and fibrosis between endogenous nicotinamide phosphoribosyltransferase(NAMPT)and bone morphogenetic protein 7(BMP-7)in diabetic glomerular cells.METHODS①In vivo,spontaneous diabetic C57/BL6 mice and wild C57/BL6 mice were divided into two groups.When blood glucose was above(34.2±1.9)mmol·L-1,renal histology of diabetic mice became obvious.The protein expressions of Nampt and nuclear transcription factors-kappa B p65(NF-κB p65),silent mating type information regulation 2 homolog 1(SIRT1)and BMP7 were analyzed by lengths of immunofluorescence.②In vitro,rats′glomerular cells HBZY-1 were incubated with glucose 200 mmol·L-1for different lengths of time(0,24, 48 and 72 h)and at different concentrations of NMN(0,50,100 and 200 μmol·L-1).The protein levels of Nampt and BMP7 were detected by Western blotting and the protein expressions of NF-κB p65 and α-SMA were measured by immunofluorescence assay.The protein levels of Nampt,BMP7 and NF-κB p65 were detected by Western blotting after HBZY-1 cells were treated with NMN 100 μmol·L-1and FK866 10 μmol·L-1for 24 h.RESULTS①In vivo,the glomeruli of diabetic C57/BL6 mice showed obvious atrophy.Fluorescence intensity of Nampt was increased(P＜0.05),but that of BMP7 and SIRT1 in renal glomeruli cells was decreased compared with the wild type(P＜0.01).②In vitro,HBZY-1 cells were cultured in glucose 200 mmol·L-1for 48 and 72 h.The protein expression of NAMPT was increased,but that of BMP7 was decreased(P＜0.05,P＜0.01).Expressions of NF-κB p65 and α-SMA were increased (P＜0.01)by immunofluorescence.The expression of BMP7 was increased after treatment with glucose 200 mmol·L-1,followed by NMN 50,100 and 200 μmol·L-1for 24 h(P＜0.01).The expressions of NAMPT and NF-κB p65 were decreased(P＜0.01).The expressions of Nampt and NF-κB p65 in glucose 5.6 mmol·L-1+FK866 and glucose 5.6 mmol·L-1+NMN groups were increased(P＜0.01),but the expression of BMP7 did not change.CONCLUSlONUpregulation of endogenous Nampt obviously intervenes in BMP7 expression in the process of glomerular inflammatory fibrosis in severe diabetes. NMN can affect the protein expression of BMP7 via a special Nampt signaling pathway.

diabetic nephropathy;glomerular fibrosis;nicotinamide phosphoribosyltransferase; p65;silent mating type information regulation 2 homolog 1;bone morphogenetic protein 7

The project supported by National Natural Science Foundation of China(31060161);National Natural Science Foundation of China(81460164);and Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region of China(2015GXNSF)

FENG Le-ping,E-mail:lpfeng1226@163.com,Tel:(0773)5835125

R966

A

1000-3002-（2017）06-0553-08

2016-07-27接受日期：2017-03-20）

（本文編輯：賀云霞）

國家自然科學(xué)基金（31060161）；國家自然科學(xué)基金（81460164）；廣西壯族自治區(qū)自然科學(xué)基金（2015GXNSF）

陳葉，碩士研究生，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制研究；馮樂平，研究生導(dǎo)師，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制研究。

馮樂平，E-mail：lpfeng1226@163.com，Tel：（0773）5835125