沒食子提取物對IgA腎病模型大鼠的治療作用

李靜，劉衍杰，桑曉紅，王婷，劉健

（1.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腎病科，新疆烏魯木齊830054；2.山東省淄博市中心醫(yī)院泌尿內科，山東淄博255036；3.新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院腎病科，新疆烏魯木齊830000）

沒食子提取物對IgA腎病模型大鼠的治療作用

李靜1，劉衍杰2，桑曉紅1，王婷3，劉健1

（1.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腎病科，新疆烏魯木齊830054；2.山東省淄博市中心醫(yī)院泌尿內科，山東淄博255036；3.新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院腎病科，新疆烏魯木齊830000）

目的 研究沒食子提取物（TGE）對IgA腎?。↖gAN）模型大鼠血清、尿液及腎組織IgA表達的影響。方法50只健康雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為正常對照組、IgAN模型組、TGE 75，150和300 mg·kg-1治療組，每組10只。除正常對照組外，其余各組采用牛血清白蛋白（BSA）+脂多糖（LPS）+四氯化碳（CCl4）聯(lián)合造模，持續(xù)12周。從第13周開始，ig給予TGE，正常對照組及IgAN模型組給予等量生理鹽水，持續(xù)4周。第12周末及第16周末用BCA法測定24 h尿蛋白；第16周末，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定血清及尿液IgA水平，全自動生化分析儀檢測血清肌酐（SCr）和尿素氮（BUN）水平，按牛津分型對腎組織病理進行評分，免疫熒光法測定腎組織IgA免疫復合物沉積。結果 與正常對照組相比，IgAN造模大鼠在12周末24 h尿蛋白升高（P＜0.05）；在16周末，IgAN模型組大鼠24 h尿蛋白、血清和尿液IgA水平、血清SCr和BUN水平、腎組織牛津病理評分和IgA沉積均較正常對照組升高（P＜0.05）；與IgAN模型組相比，TGE各給藥組大鼠24 h尿蛋白、血清和尿液IgA水平以及血清SCr水平降低（P＜0.05），TGE 150和300 mg·kg-1組血清BUN水平和腎組織IgA含量下降（P＜0.05），僅TGE 300 mg·kg-1組牛津病理評分中有明顯減少。結論TGE可減少IgAN模型大鼠血清、尿液及腎組織IgA水平，對IgAN具有一定程度的治療作用。

沒食子提取物；IgA腎??；IgA

IgA腎?。↖gA nephropathy，IgAN）的發(fā)病機制尚未明確，與感染、免疫反應、炎癥介質和遺傳等多種因素有關［1］。目前，國內外對IgAN發(fā)病機制的研究主要圍繞在各種原因引起異常糖基化IgA1的產生及其在腎小球系膜區(qū)的沉積，刺激系膜細胞和中性粒細胞等增殖，并產生釋放多種細胞因子及炎癥介質，進而引發(fā)炎癥和腎小球損傷［2-3］。長期隨訪研究結果 表明，IgAN的發(fā)展過程成慢性進展性［4］，免疫球蛋白IgA在其發(fā)病機制和發(fā)展中起到關鍵作用，有50%～70%的成人IgAN患者血清IgA水平升高［5-6］。因此，減少IgA表達沉積可能對延緩IgAN進展有一定意義。

沒食子是新疆維吾爾常用藥，具有收斂、消炎、止血和固澀作用［7-8］，抑制主要致齲菌［9］和清除自由基等作用［10］。但是沒食子提取物（Turkish galls extract，TGE）對IgAN的療效觀察及機制研究尚未見報道。本研究旨在探討TGE是否可減輕IgA免疫復合物在腎小球系膜區(qū)的沉積。

1 材料與方法

1.1 藥材、試劑和主要儀器

沒食子（新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)院），常規(guī)粉碎［11］，過200目篩，CMC-Na稀釋，配制成25 g·L-1濃度的混懸液，質量分數為1%，備用。牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（美國MPBIO公司）；四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）（蘇州百與化工有限公司）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（美國Sigma公司）；BCA蛋白定量試劑盒〔天根生化科技（北京）有限公司〕；IgA ELISA試劑盒（武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司）；FITC標記的兔抗大鼠IgA多抗（美國Dako公司）。

Lx.20型全自動生化分析儀（美國Beckman公司）；Motic Med 6.0A型全自動顯微鏡（德國Motic公司）；DS-425型電子稱（上海寺岡電子公司）；MDF-382 E型超低溫冰箱（-80℃）（日本SANYO公司）；KDC-40型低速離心機（科大創(chuàng)新股份中佳分公司）；AF100 AS-E型制冰機（意大利Scotsman公司）；TGL213型高速臺式離心機（上海安亭）；DENVER型電子天平（北京賽多利斯儀器公司）；GSP-9080MBE型隔水式恒溫培養(yǎng)箱、GZX-9070型鼓風干燥箱（上海博迅醫(yī)療設備公司）；Galanz型微波爐（順德格蘭仕電器）；Model 550型Bio-Rad酶標儀（美國Bio-Rad公司）；MM-2型微量振蕩器（江蘇賽普）。

1.2 動物、模型制備、分組和給藥

健康雄性Sprague-Dawley大鼠50只，12周齡，體質量180～220 g，（新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心），合格證編號：SOXK（新）2011-0001。按SPF級飼養(yǎng)及管理，相對濕度40%～70%，室溫20～24℃，適應性飼養(yǎng)1周，自由飲水攝食。

參考張靜等［12］IgAN造模方法，運用BSA+ LPS+CCl4聯(lián)合造模法制備IgAN大鼠模型。將BSA以蒸餾水配成濃度100 g·L-1，劑量600 mg·kg-1，隔天ig給予，持續(xù)12周；蓖麻油0.3 mL+CCl40.10 mL，每周sc給予1次，持續(xù)12周；其間于第8周，0.2 mL LPS 0.25 g·L-1（生理鹽水配制）經尾iv給藥1次。

參考TGE對小鼠的LD50［13］，等效劑量比值換算為大鼠的LD50，取大鼠LD50的1/40，1/20和1/10劑量，即75，150和300 mg·kg-1分別作為TGE的干預劑量。將40只IgAN模型大鼠，隨機分為IgAN模型組及TGE 75，150和300 mg·kg-1給藥組；同時設正常對照組。TGE組每天ig給藥1次，持續(xù)給藥4周，IgAN模型組和正常對照組ig給予等量生理鹽水。

1.3 BCA法測定24 h尿蛋白

分別于第12周及第16周末，禁食12 h，不限飲水，放代謝籠收集24 h尿液，806×g離心10 min，取上清液，BCA法測定24 h尿蛋白含量。

1.4 ELISA法測定血清和尿液IgA含量

第16周末，將各組大鼠ip麻醉，腹主動脈取血。采集全血1.0 mL，806×g離心10 min，分離血清。按1.3收集第16周末尿液。ELISA法測定血清和尿液IgA含量。

1.5 血肌酐（serum creatinine，SCr）和尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）的檢測

第16周末，利用全自動生化分析儀檢測1.4中血液和尿液標本中SCr（μmol·L-1）和BUN（mmol·L-1）的含量。

1.6 HE染色檢測腎組織病理變化

第16周末，腹主動脈取血后，摘雙腎，冠狀面切5 mm厚的腎組織于4%甲醛中固定，用于HE染色，其余腎組織用于冰凍切片制備。按照牛津病理分型標準，由2名研究人員盲法進行評分［14］。

系膜細胞增生（M）評分方法：＜4個系膜細胞（1個系膜區(qū)）為0分，4～5個為1分，6～7個為2分，＞8個為3分，系膜細胞增殖積分取所有腎小球的平均值，M0≤0.5，M1＞0.5。

毛細血管內皮細胞增生（E）評分方法：腎小球毛細血管內皮細胞增殖致袢腔狹窄。E0：無；E1：有。

腎小球節(jié)段硬化（S）評分方法：任何不同程度的袢受累，但不包括全球受累或粘連。S0：無；S1：有。

小管萎縮/間充質纖維化（T）評分方法：0%～25%為T0，26%～50%為T1，＞50%為T2。

1.7 免疫熒光檢測腎組織IgA沉積

取1.6腎組織制備冰凍切片，丙酮固定，滴加FITC標記的兔抗大鼠IgA多抗（1∶100），4℃暗盒過夜，封片。采用國際通用5級半定量法［12］評價IgA沉積強度：即低倍鏡下不顯示熒光、高倍鏡下似乎可見為“-”，低倍鏡下似乎可見、高倍鏡下可見為“+”，低倍鏡下可見、高倍鏡下清晰可見為“++”，低倍鏡下可見、高倍鏡下耀眼為"+++"，高倍鏡下刺眼為"++++"。由2位研究人員盲法閱片，每張切片至少觀察20個腎小球。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 TGE對IgAN模型大鼠一般情況的影響

與正常對照組相比，IgAN模型大鼠多數出現毛發(fā)蓬亂、食欲不振和精神萎靡，但無死亡。與IgAN模型組相比，TGE干預1周后，各劑量組部分大鼠出現精神不振、活動減少等不適，約2周后逐漸恢復正常。干預第4周末，TGE 300 mg·kg-1組大鼠死亡1只。

2.2 TGE對IgAN模型大鼠24 h尿蛋白量的影響

24 h尿蛋白檢測結果 （圖1）顯示，第12周末，與正常對照組相比，IgAN模型組大鼠出現明顯蛋白尿（P＜0.05），提示IgAN建模成功。第16周末，與IgAN模型組比較，3個TGE劑量組大鼠24 h尿蛋白均有不同程度下降（P＜0.05），提示不同劑量TGE均可減少IgAN模型大鼠蛋白尿（P＜0.05）。

Fig.1 Effect of Turkish galls extract（TGE）on 24 h urinary protein of IgAN model rats.The IgAN model of rats was estabilished with BSA 600 mg·kg-1（ig，once 2 d），castor oil 0.30 mL+CCl40.10 mL（sc，once a week）for 12 weeks，injection of LPS on the 8thweek（iv，only once）.From the 13thweek，rats were ig administered with TGE，once a day for 4 weeks，normal control group and IgAN model group were ig administered with normal saline.x±s，n=10（9，TGE 300 mg·kg-1group）.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with model group.

2.3 TGE對IgAN大鼠血清和尿液IgA含量的影響

血清和尿液IgA含量檢測結果 （表1）顯示，第16周末，與正常對照組相比，IgAN模型組大鼠血清和尿液IgA含量升高（P＜0.05），符合IgAN的疾病特征。與IgAN模型組相比，TGE各組血清和尿液IgA含量降低（P＜0.05），提示TGE可減輕IgA在血清及尿液中的表達。

Tab.1 Effect of TGE on IgA levels in urine and serum of IgAN model rats

2.4 TGE對IgAN模型大鼠血肌酐和尿素氮含量的影響

血清SCr和BUN含量檢測結果 （表2）顯示，與正常對照組相比，IgAN模型組大鼠血清SCr和BUN水平升高（P＜0.05）。與IgAN模型組相比，TGE各劑量組血清SCr水平下降（P＜0.05），TGE 150和300 mg·kg-1組BUN水平下降（P＜0.05）。

Tab.2 Effect of TGE on content of SCr and BUN in serum of IgAN model rats

2.5 TGE對IgAN模型大鼠腎組織病理變化的影響

Fig.2 Effect of TGE on pathological changes in renal tissue in IgAN model rats（HE staining）.See Fig.1 for the rat treatment.Red arrows represent glomerular sclerosis，blue ones are for glomerular and renal capsule adhesion，and black ones are for mesangial cell and endothelial cell proliferation.

腎組織病理結果 （圖2及表3）顯示，與正常對照組相比，IgAN模型組大鼠腎小球結構形態(tài)出現不同程度的系膜細胞和毛細血管內皮細胞增生，腎小球節(jié)段硬化和小管萎縮或間充質纖維化。對各組大鼠腎組織病變進行牛津分型評分后可見，各組大鼠在E分型上差異無統(tǒng)計學意義，提示各組大鼠內皮細胞增生改變較為普遍。在S1T1/2病變分型中，與正常對照組相比，IgAN模型組S1T1/2所占比例明顯增多（P＜0.05）；與IgAN模型組相比，不同劑量TGE組大鼠發(fā)生S1T1/2病變的比例并無顯著減少。而在M分型中，與正常對照組相比，IgAN模型組發(fā)生比例增加（P＜0.05）；與IgAN模型組相比，TGE 300 mg·kg-1組M1所占比例明顯減少（P＜0.05），提示TGE 300 mg·kg-1可明顯減輕IgAN模型大鼠系膜細胞增生。

2.6 TGE對IgAN模型大鼠腎組織IgA沉積的影響

免疫熒光結果 （圖3，表4）顯示，正常對照組大鼠腎小球無熒光，IgAN模型組大鼠腎小球可見綠色熒光沉積。與IgAN模型組相比，TGE 150和300 mg·kg-1組熒光較弱，熒光半定量評分降低（Z=-3.207，P＜0.01；Z=-3.345，P＜0.01），TGE 75 mg·kg-1組熒光強度無顯著變化。上述結果 提示，TGE 150和300 mg·kg-1可減輕IgA在大鼠腎組織中的沉積。

Tab.3 Pathological types and scores in Oxford classification of renal tissue in IgAN model rats

Fig.3 Effect of TGE on IgA deposition of renal tissue in IgAN model rats by immunofluorescence.See Fig.1 for the rat treatment.

Tab.4 Effect of TGE on renal immunofluorescence scores in IgAN model rats

3 討論

本研究結果 提示，不同劑量TGE可減少尿蛋白，減輕血清、尿液及腎組織IgA的表達。而蛋白尿及IgA的沉積程度可很大程度上影響疾病的預后。TGE可能通過減少IgA的形成和（或）抑制IgA在系膜區(qū)的積聚，延緩IgAN的發(fā)展并改善其預后。王婷等［15］同樣發(fā)現了TGE減少尿蛋白的作用。因為病理性蛋白尿的產生與腎小球濾過屏障及腎小管重吸收有關，故推測TGE有改善腎小球濾過屏障及腎小管功能并延緩損傷的作用。

本研究發(fā)現，IgAN模型大鼠牛津病理分型特點以M1E0S1T0多見。各組大鼠在E分型中差異無統(tǒng)計學意義，提示TGE對內皮細胞增生狀況無明顯改善。因內皮細胞增生在牛津分型四大病變中是影響IgAN預后最弱的指標［16］，故其病變的嚴重程度及改善程度對IgAN的預后影響較弱。而在M分型中，IgAN模型大鼠發(fā)生系膜細胞增生病變的概率明顯升高；TGE干預后，TGE 300 mg·kg-1組大鼠發(fā)生系膜細胞增生的比例明顯減少。在ST分型中，TGE 150和300 mg·kg-1組大鼠較正常對照組所發(fā)生的比例增加不明顯，提示TGE對腎小球節(jié)段硬化及小管間充質纖維化可起到一定程度改善作用。因ST是影響IgAN預后的重要因素，因此TGE150和300 mg·kg-1對改善IgAN預后起重要作用。

TGE干預大鼠過程中，TGE 300 mg·kg-1組死亡大鼠經解剖后發(fā)現胃腸道擴張、肝結節(jié)病變，考慮與TGE具有一定胃腸道毒性有關［7］。

綜上所述，TGE可間接延緩IgAN進展，改善預后。其具體作用機制及長期大量使用TGE引起的毒副作用尚需進一步研究。

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Therapeutic effect of Turkish galls extract on IgA nephropathy model rats

LI Jing1,LIU Yan-jie2,SANG Xiao-hong1,WANG Ting3,LIU Jian1
(1.Department of Nephropathy,the First Afiliated Hospital,Xinjiang Medical University,Urumqi 830054, China;2.Department of Nephropathy,Zibo Central Hospital of Shandong Province,Zibo 255036, China;3.Department of Nephropathy,the TCM Affiliated Hospital,Xinjiang Medical University, Urumqi 830000,China)

OBJECTIVETo investigate the effect of Turkish galls extract(TGE)on the expression of IgA in serum,urine and renal tissue of IgA nephropathy(IgAN)model rats.METHODSFifty healthy male Sprague Dawley rats were randomly divided into normal control group,IgAN model group,and TGE 75,150 and 300 mg·kg-1groups,10 rats per group.The model of IgAN rats was established with bovine serum albumin(BSA)+lipopolysaccharide(LPS)+carbon tetrachlorid(CCl4)for 12 weeks.From the 13thweek,TGE was ig administrated once a day for 4 weeks.At the end of the 12thand 16thweeks, 24 h urine protein was measured by BCA method.At the end of the 16thweek,serum and urinary IgA levels were measured by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA),serum creatinine(SCR)and blood urea nitrogen(BUN)were detected by an automatic biochemical analyzer,and the renal pathological changes were evaluated with an Oxford classification scoring system.The deposition of IgA immune complex in the kidney was observed by immunofluorescence assay.RESULTSAt the end of 12thweek,24 h urine protein increased in all IgAN groups(P＜0.05),compared with normal control group.At the end of 16thweek,24 h urine protein,IgA content in serum and urine,SCr and BUN content in serum,score in Oxford classification of renal tissue and deposition of IgA immune complex in the kidney in IgAN model group were all higher than in normal control group(P＜0.05).Compared with IgAN model group,24 h urine protein,IgA content in serum and urine and SCr content in serum were decreased in all TGE groups(P＜0.05),and BUN content in serum and deposition of IgA immune complex in the kidney decreased in TGE 150 and 300 mg·kg-1groups(P＜0.05).The score in Oxford classification of renal tissue was decreased in TGE 300 mg·kg-1group only.CONCLUSIONTGE has curative effect on IgAN model rats by reducing serum and urinary IgA and decreasing IgA immune complex deposition.

Turkish galls extract;IgA nephropathy;IgA

The project supported by National Natural Science Foundation of China(81660127)

LIU Jian,Tel:13609937228,E-mail:jianliu@medmail.com.cn

R285

A

1000-3002-（2017）06-0547-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.06.008

2016-01-05接受日期：2017-05-10）

（本文編輯：賀云霞）

國家自然科學基金（81660127）

李靜，女，副主任醫(yī)師，主要從事慢性腎小球腎炎的研究，E-mail：jingdoctor0803@163.com；劉健，男，主任醫(yī)師，主要從事慢性腎臟病與腎移植的研究。

劉健，E-mail：jianliu@medmail.com.cn，Tel: 13609937228