生、醋莪術對大鼠免疫性肝纖維化及HSC—T6增殖和α—SMA，ProcollagenⅠ表達的影響

張季+宋嬿+王巧晗+李林+季德+顧薇+郝敏+陸兔林+毛春芹

[摘要] 比較生、醋莪術對豬血清所致大鼠免疫性肝纖維化及對活化的肝星狀細胞（HSC-T6）增殖和α-SMA，ProcollagenⅠ表達的影響。采用腹腔注射豬血清0.5 mL/只，每周2次，共14周制備大鼠免疫性肝纖維化模型。觀察生、醋莪術（0.95，1.90 g·kg^-1）對大鼠血清ALT，AST，PC-Ⅲ，IV-C，LN，HA和肝組織HYP，MDA的表達水平；采用HE染色觀察大鼠肝組織病理改變情況，Masson染色和天狼猩紅染色觀察大鼠肝組織中膠原表達情況；體外培養(yǎng)HSC-T6細胞，MTT法測定不同濃度生、醋莪術含藥血清作用12，24，36，48 h對HSC-T6增殖的影響；采用Real-time PCR法檢測各組α-SMA和ProcollagenⅠ表達情況。結果顯示，給藥生、醋莪術后，大鼠血清ALT，AST，PC-Ⅲ，IV-C，LN，HA表達水平均下降，與生莪術組相比，醋莪術組作用效果優(yōu)于生莪術組；生、醋莪術含藥血清各劑量組均能抑制HSC-T6的增殖，呈現(xiàn)一定的量效和時效關系；各給藥組作用24 h后，HSC-T6中α-SMA和Procollagen Ⅰ表達水平降低，且醋莪術組降低更顯著。生、醋莪術均能不同程度減輕肝纖維化，其抗肝纖維化機制可能與抑制HSC-T6增殖，減少細胞外基質的生成并促進其降解有關。

[關鍵詞] 莪術；醋莪術；肝纖維化；肝星狀細胞；Real-time PCR；α-平滑肌肌動蛋白；Procollagen Ⅰ

[Abstract] To compare the effects of Curcumae Rhizoma/vinegar-processed Curcumae Rhizomaon immune hepatic fibrosis， proliferation of HSC-T6， and expressions of α-SMA and Procollagen I. The immunological liver fibrosis model was prepared through intraperitoneal injection with porcine serum 0.5 mL in each rat， twice a week， for 14 weeks. Expressions of serum ALT， AST， PC-Ⅲ， IV-C， LN， HA and HYP， MDA in liver tissues were observed after administration of Curcumae Rhizoma/vinegar-processed Curcumae Rhizoma （0.95， 1.90 g · kg^-1）. The pathological changes in liver tissues were observed by HE staining. Masson staining and Sirius red staining were used to observe the expression of collagen in rat liver. HSC-T6 was cultured， and the proliferation of HSC-T6 was determined by MTT assay at different concentrations in 12， 24， 36， 48 h. The expressions of α-SMA and Procollagen I were detected by Real-time PCR. The results showed that expressions of serum ALT， AST， PC-Ⅲ， IV-C， LN and HA in Curcumae Rhizoma/vinegar-processed Curcumae Rhizoma groups （0.95， 1.90 g·kg^-1） were significantly lower than model group；in terms of effect， vinegar-processed Curcumae Rhizoma group was superior to Curcumae Rhizoma group. Curcumae Rhizoma/vinegar-processed Curcumae Rhizoma containing serum could inhibit the proliferation of HSC-T6 in a dose-effect and time-effect manner. Expressions of α-SMA and Procollagen I in HSC-T6 were decreased after 24 h， especially in 20% vinegar-processed Curcumae Rhizoma containing serum group （P<0.01）. Both Curcumae Rhizoma/vinegar-processed Curcumae Rhizoma could reduce immune hepatic fibrosis to varying extent. Their anti-hepatic fibrosis mechanism may be correlated with inhibition of the proliferation of HSC-T6， and reduction of the formation of extracellular matrix and promotion of its degradation.

[Key words] Curcumae Rhizoma；vinegar-processed Curcumae Rhizoma；hepatic fibrosis；hepatic stellate cell；Real-time PCR；α-smooth muscle actin；Procollagen I

肝纖維化是多種原因引起的慢性肝損害，其特征在于膠原等細胞外基質的產生和降解失衡，致使細胞外基質過度沉積，使得肝臟的正常結構和功能受到破壞[1]。而活化的肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）是纖維化肝臟中細胞外基質（extracellular matrix，ECM）成分的主要來源。肝臟受到損傷時，HSC增殖活化并轉變?yōu)榧〕衫w維細胞，導致細胞外基質過度生成并遷移至肝臟受損區(qū)域，引起肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展[2-3]。肝纖維化發(fā)生機制復雜，中醫(yī)解釋其病因為肝失疏泄，影響了氣的運行和臟腑經絡功能，氣行則血行，氣滯則血瘀，大多數(shù)中醫(yī)學者將肝纖維化歸屬于中醫(yī)血瘀證的范疇，在治則上多以活血化瘀為主，兼以益氣補虛、養(yǎng)血柔肝或滋補肝腎等法[4]。

莪術為姜科植物蓬莪術Curcuma phaeocaulis Val.、廣西莪術C. kwangsiensis S.G. Lee et C.F.Liang或溫郁金C. wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根莖。后者習稱“溫莪術”。莪術性溫，味苦、辛。具行氣破血，消積止痛，活血化瘀的功效，是臨床常用的活血化瘀藥。已有研究表明，莪術具有抗肝纖維化、抗腫瘤、抗炎的作用[5-8]。在臨床上莪術常和其他中藥組方用來治療肝病[9] 。莪術抗肝纖維化既有中醫(yī)理論的基礎，又有臨床研究以及實驗研究的支持。課題組前期研究證實莪術具有抗復合因素所致大鼠肝纖維化作用，且醋制后增強[10]。肝纖維化研究的動物模型多樣，一種模型并不能完全解釋莪術抗肝纖維化效應及機制，為進一步研究生、醋莪術抗肝纖維化效應及機制，本實驗研究生、醋莪術對豬血清所致大鼠免疫性肝纖維化及其對HSC-T6的調控作用，以期在一定程度上闡釋莪術治療肝纖維化的作用機制。

1 材料

1.1 儀器

TDZ4B-WS臺式低速自動平衡離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；DK-S24電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；SW-CF-1FD超凈工作臺（蘇州凈化公司）；SL-16R多功能冷凍離心機（美國Thermo Scientific公司）；NU4950E CO₂恒溫培養(yǎng)箱（美國NUAIRE公司）；DFC-259倒置相差顯微鏡（德國Leica公司）；spectramax M5多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）；高速冷凍離心機（Sigma）；紫外分光光度計（Beckman）；恒溫金屬?。▏a）；CFX384多重實時熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad）。

1.2 試劑

豬血清，平睿生物科技（北京）有限公司（無菌過濾，未經滅活；批號20140904）。甲醛（西隴化工股份有限公司，批號1305082）；水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司）；丙氨酸轉氨酶（ALT）試劑盒（批號20150819）；天冬氨酸轉氨酶（AST）試劑盒（批號20150813）；丙二醛（MDA）測試盒（批號20150813）；羥脯氨酸（HYP）試劑盒（批號20150813）；大鼠層連蛋白/板層素（LN）試劑盒（185110632 R）；大鼠Ⅳ型膠原（IV-C）試劑盒（230511793R）；大鼠Ⅲ型前膠原試劑盒（PC-Ⅲ）（463211053R）；大鼠透明質酸（HA）試劑盒（080411805R）；不完全DMEM（高糖）培養(yǎng)基（含雙抗）（KGM 12800-500，江蘇凱基生物技術股份有限公司）；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（PBS）（KGY0012，江蘇凱基生物技術股份有限公司）；1×PBS（0.01 mol·L^-1，pH 7.4）（KGB5001，江蘇凱基生物技術股份有限公司）；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號150228）；二甲基亞砜（DMSO）（上海久億化學試劑有限公司，20150314）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）（ST316，碧云天生物技術）；75%醫(yī)用酒精（上海凌峰化學試劑有限公司）；TRIzol Plus RNA Purification Kit （Invitrogen，貨號12183-555）；RNase-Free DNase Set（Qiagen，貨號79254）；SuperScript^TMIII First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR（Invitrogen，貨號11752-050）。

1.3 試藥

莪術藥材購自主產地浙江，經南京中醫(yī)藥大學藥學院陸兔林教授鑒定為姜科植物溫郁金C. wenyujin的干燥根莖。秋水仙堿片（批號20150201），廣東彼迪藥業(yè)有限公司，用蒸餾水制成混懸液。

1.4 動物和細胞

SPF級SD大鼠，雄性，體重180～220 g，由上海杰思捷實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（滬）2013-0006。給予標準光照周期（14 h光照、10 h黑夜），室內溫度維持（25±1） ℃，相對濕度維持70%左右，給予普通飼料，自由飲水，適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。HSC-T6細胞系購自江蘇凱基生物技術股份有限公司（Cat：KG313，Lot：20160225）。

2 方法

2.1 給藥樣品制備

2.1.1 生、醋莪術提取物的制備 參照2010年版《中國藥典》一部莪術炮制項下要求，取莪術，除去雜質，略泡，洗凈，蒸軟，切厚片，干燥即得生莪術飲片。參照2010年版《中國藥典》一部莪術炮制項下要求，取凈莪術，照醋煮法（附錄ⅡD）煮至透心，取出，稍涼，切厚片，干燥即得醋莪術飲片。每100 kg待炮制品，用米醋20 kg。分別將生莪術、醋莪術飲片用15倍量的90%乙醇加熱回流1.5 h，提取2次，藥渣加10倍量的水提取1.5 h，合并以上提取液，減壓濃縮至生藥1.0 g·mL^-1（效應實驗），1.5 g·mL^-1（含藥血清制備實驗）。

2.1.2 含藥血清制備 SPF級雄性SD大鼠18只，分成空白組、生莪術組（14.25 g·kg^-1）和醋莪術組（14.25 g·kg^-1），每組6只，空白組給等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥7 d，于末次給藥后2 h腹主動脈采血，室溫放置1 h后，離心，分離血清，56 ℃滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜過濾，分裝，-20 ℃保存，用于后續(xù)實驗。根據(jù)實驗需要，用空白組血清稀釋成不同濃度。

2.2 動物分組及免疫性肝纖維化模型建立

2.2.1 大鼠免疫性肝纖維化模型建立及給藥 根據(jù)實驗室前期研究確定給藥劑量，將大鼠分為正常對照組、模型組、陽性藥組（秋水仙堿0.2 mg·kg^-1）、生莪術低、高劑量組（0.95，1.90 g·kg^-1）、醋莪術低、高劑量組（0.95，1.90 g·kg^-1），除正常對照組外，其余各組大鼠腹腔注射豬血清0.5 mL，每周2次，至第14周結束，病理組織學檢查造模情況。于造模第7周開始，各給藥組分別灌服相應的受試藥物，正常組、模型組灌服等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)9周。

2.2.2 標本采集 末次給藥后所有大鼠禁食不禁水12 h，稱重，腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL·kg^-1）麻醉，腹主動脈采血，室溫靜置1 h后，3 000 r·min^-1，離心5 min，取上清，-20 ℃保存，用于檢測ALT，AST，PC-Ⅲ，IV-C，LN，HA的水平。分離肝臟，生理鹽水清洗，取下肝右葉濾紙吸干、稱重，制備10%肝組織勻漿，用于HYP，MDA的測定。取肝左葉同一部位肝組織約1 cm³大小，固定于10%甲醛溶液，用于肝組織病理切片檢查。

2.2.3 指標觀察 觀察動物的一般狀態(tài)，包括毛發(fā)光澤度、活動情況、精神狀態(tài)等；肝臟形態(tài)學觀察：包括外形、色澤、質地等；檢測血清肝功能指標ALT，AST的水平；血清肝纖維化指標PC-Ⅲ，IV-C，LN，HA；肝組織HYP，MDA的水平。各指標測定按照試劑盒說明進行。HE染色觀察肝臟病理學改變，Masson染色和天狼猩紅染色觀察肝纖維化程度。

2.3 生、醋莪術含藥血清對HSC-T6增殖的影響

將HSC-T6細胞置于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃，5%CO₂恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，必要時換液，待細胞貼壁生長至80%左右時傳代，傳代3～4次后取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

2.3.1 給藥濃度的確定 取處于對數(shù)生長期的HSC-T6細胞，以2×10⁴個/mL的濃度接種于96孔板中，置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁生長后，加入100 μL不同濃度的含藥血清（空白血清組，1%，2%，5%，8%，10%，12%，15%，20%含藥血清組），并用不完全培養(yǎng)液設置調零組，每組設置6個復孔，于恒溫箱中培養(yǎng)24 h。每孔加入5 g·L^-1的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心，吸出液體，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩5 min，用酶標儀在490 nm波長處檢測各孔A。根據(jù)不同給藥濃度的抑制率，繪出濃度-抑制率曲線。

2.3.2 各給藥組對HSC-T6細胞增殖的影響 根據(jù)上述實驗確定合適的給藥濃度為5%，10%，15%，20%含藥血清，細胞分為空白血清對照組，5%，10%，15%，20%生莪術含藥血清組、醋莪術含藥血清組，常規(guī)培養(yǎng)，種板，待細胞貼壁生長后，棄去原培養(yǎng)液，加入100 μL不同濃度的含藥血清，并用不完全培養(yǎng)液設置調零組，每組設置6個復孔，于恒溫箱中培養(yǎng)12，24，36，48 h。每孔加入5 g·L^-1的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心，吸出液體，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩5 min，用酶標儀在490 nm波長處檢測各孔A，計算不同給藥組的抑制率。

2.4 Real-time PCR法檢測α-SMA 和Procollagen Ⅰ mRNA的表達

細胞分為空白血清對照組（Control）、5%（S1）、10%（S2）、20%（S3）生莪術含藥血清組、5%（C1）、10%（C2）、20%（C3）醋莪術含藥血清組，接種于6孔板中，培養(yǎng)以及給藥方法同2.3.2項。用TRIzol提取細胞中總RNA。用核酸蛋白測定儀測定RNA提取細的含量和純度。將總RNA用RNase-Free Water稀釋至100 mg·L^-1，作為逆轉錄模板進行逆轉錄。擴增條件為95 ℃，1 min；共反應40個循環(huán)（95 ℃15 s，59 ℃25 s，收集熒光）熔點曲線分析：55～95 ℃，引物序列見表1。

2.5 統(tǒng)計學處理

采用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)整理，通過SPSS 16.0軟件進行方差分析，數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 大鼠一般情況

造模過程中正常組大鼠一般情況良好，精神狀態(tài)好，動作敏捷，體重增加較快，毛質光滑，無死亡。模型組大鼠體重增長緩慢，毛發(fā)偏黃、光澤度差。其余各組大鼠均有不同程度的精神萎靡，動作遲鈍現(xiàn)象，尤以醋莪術高劑量組大鼠狀態(tài)較佳。

3.2 對免疫性肝纖維化大鼠血清ALT，AST的影響

與正常組相比，大鼠經腹腔注射豬血清后，模型組血清中ALT，AST水平顯著升高（P<0.01），經生、醋莪術給藥后均不同程度降低（P<0.01，P<0.05），但效果均弱于等劑量醋莪術組（P<0.01，P<0.05），見表2。

3.3 對免疫性肝纖維化大鼠血清肝纖維化指標的影響

與正常組相比，大鼠經腹腔注射豬血清后，模型組血清中PC-Ⅲ，IV-C，LN，HA水平顯著升高（P<0.01），經生、醋莪術給藥后均不同程度降低（P<0.01，P<0.05），但醋莪術組效果更顯著（P<0.05），見表2。

3.4 對免疫性肝纖維化大鼠肝組織HYP，MDA水平的影響

與正常組相比，大鼠經腹腔注射豬血清后，模型組血清中HYP，MDA水平顯著升高（P<0.01），說明模型成功。經生、醋莪術給藥后不同程度降低（P<0.01，P<0.05），醋莪術高劑量組改善程度更顯著，且優(yōu)于生莪術組（P<0.01，P<0.05），見表3。

3.5 各組大鼠肝組織病理學變化觀察

HE染色結果顯示：空白組大鼠肝組織結構正常，匯管區(qū)無擴大，肝小葉結構完整，無假小葉生成，未見明顯炎細胞浸潤；模型組大鼠肝組織正常結構被破壞，肝細胞水腫，脂肪變性，淋巴細胞浸潤，見點狀壞死，纖維間隔進一步伸入并分割肝小葉，形成假小葉；與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織病理改變均有所改善，以秋水仙堿和醋莪術高劑量組肝組織病變程度最輕，見圖1。

Masson染色結果顯示：空白組大鼠肝組織鏡下結構正常，膠原纖維僅見于匯管區(qū)及中央靜脈管壁；模型組膠原增生明顯，大量纖維組織向小葉內伸展，分割包繞肝組織，形成假小葉；各給藥組大鼠肝組織膠原沉積均有所改善，匯管區(qū)膠原有所減少，以秋水仙堿和醋莪術高劑量組肝纖維化改善程度最明顯，見圖2。

天狼猩紅染色結果顯示：正常組大鼠肝臟Ⅰ型膠原較少，為紅色；模型組大鼠肝臟Ⅰ型膠原顯著增多，變粗、為紅色，可見大量紅色膠原纖維穿插于肝小葉內，破壞了肝小葉的正常結構。各組給藥治療后有一定的改善，以陽性藥秋水仙堿組、醋莪術高劑量組改善最明顯，膠原顯著減少，僅在中央靜脈周圍有少量膠原，見圖3。

3.6 含藥血清給藥濃度的確定

當含藥血清濃度低于12%時，抑制率與血清濃度曲線呈線性增長，當含藥血清濃度高于12%時，抑制率增長緩慢。根據(jù)不同濃度與抑制率的實驗選出合適的濃度用于后續(xù)實驗（5%，10%，15%，20%），見圖4。

3.7 不同給藥濃度對HSC-T6增殖的影響

生、醋莪術含藥血清給藥12 h，生、醋組相比沒有差異；給藥24 h，在5%，10%，20%時，醋莪術的抑制率高于生莪術，且有顯著差異（P<0.01，P<0.05）。給藥36 h，在15%時，醋莪術的抑制率高于生莪術，且有顯著差異（P<0.05）；給藥48 h，在5%，10%，20%時，醋莪術的抑制率高于生莪術，且均有顯著差異（P<0.05）。總體來說，醋莪術含藥血清各劑量組在不同時間段對HSC-T6的抑制率要優(yōu)于等劑量的生莪術含藥血清組，見圖5。

3.8 各給藥組對α-SMA 和Procollagen Ⅰ mRNA表達的影響

實驗結果顯示，與空白血清組相比，20%生莪術含藥血清組和各劑量的醋莪術組均能抑制α-SMA的表達（P<0.01）。且醋莪術組要優(yōu)于等劑量的生莪術組（P<0.05）。各給藥組Procollagen Ⅰ表達水平均顯著下降（P<0.01），以醋莪術高劑量組尤為明顯，且與等劑量的生莪術組相比有顯著差異（P<0.05），見圖6。

4 結論

肝纖維化是指機體對各種有害因素包括病毒、酒精、藥物、自身代謝缺陷以及自身免疫性疾病等因素長期作用于肝臟引起肝臟炎癥、壞死等組織損傷的一種修復反應，是多種慢性肝病發(fā)展至肝硬化或肝癌共有的病理改變，是有可能被逆轉的階段[11]。實驗室前期研究顯示莪術可以治療復合因素所致大鼠肝纖維化，因肝纖維化動物模型多樣，本實驗選擇豬血清所致大鼠免疫性的肝纖維化進一步研究，與常見的化學性模型相比，免疫性肝纖維化模型具有損傷小、成模率高、死亡率低等優(yōu)點[12]，該模型會引起機體免疫調節(jié)紊亂，在肝臟匯管區(qū)形成免疫復合物，將肝星狀細胞轉變?yōu)榧〕衫w維細胞，分泌膠原，使得細胞外基質過度沉積同時會引起血管炎和血管周圍炎，導致肝細胞壞死及組織損傷，最終進展為肝纖維化，該模型與臨床上的慢性肝炎在發(fā)病機制上更加接近[13]。而細胞外基質由膠原、多糖、層黏連蛋白等組成，PC-Ⅲ，IV-C，LN，HA，Hyp作為細胞外基質的組成成分，其水平能夠反映肝纖維化的程度，本實驗中莪術醋制后能夠顯著降低PC-Ⅲ，IV-C，LN，HA，Hyp表達水平，且Masson染色和天狼猩紅染色結果也顯示莪術經醋制后肝組織中膠原表達減少，進一步說明莪術經醋制后能夠抑制膠原等ECM的合成并促進其降解，從而發(fā)揮治療肝纖維化的作用。在肝纖維化形成過程中，ALT和AST能夠反映肝細胞的受損程度，本實驗結果顯示莪術經醋制后能夠顯著降低ALT和AST的表達水平，提示莪術經醋制后對肝細胞起保護作用。丙二醛能夠反映體內脂質氧化水平，莪術經醋制后能夠改善脂質過氧化，這可能與炮制輔料醋的抗氧化活性有關[14]，炮制輔料對于藥物作用的影響值得進一步關注。

Friedman[15]提出肝纖維化的形成過程中HSC的活化起到關鍵作用?；罨腍SC能夠合成和分泌ECM，并表達α-平滑肌激動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）。本實驗選擇的HSC-T6細胞系是活化的肝星狀細胞，在體外培養(yǎng)自動活化，經生、醋莪術含藥血清給藥后，均能抑制其增殖，且不同程度的抑制α-SMA和Procollagen Ⅰ的表達，醋莪術含藥血清組更顯著。

綜合體內外實驗分析，莪術治療肝纖維化可能與其抑制肝星狀細胞的增殖、減少膠原的形成、提高抗氧化活性有關。HSC的活化與細胞因子網(wǎng)絡密切相關，主要包括轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、血小板源生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）等。HSC不僅可以通過旁分泌機制對內環(huán)境中的刺激因子發(fā)生反應，而且可通過自分泌形式作用于本身，通過細胞因子的級聯(lián)反應而活化[16]。課題組在后期實驗中將重點研究HSC中一系列細胞因子，以期闡釋莪術醋制增強抗肝纖維化機制，為臨床合理用藥提供參考。

[參考文獻]

[1] Jiao J， Friedman S L， Aloman C. Hepatic fibrosis[J]. Curr Opin Gastroenterol， 2009， 25（3）：223.

[2] Mann J， Mann D A. Transcriptional regulation of hepatic stellate cells [J]. Adv Drug Deliv Rev， 2009， 61（7/8）：497.

[3] Blaner W S， O′Byrne S M， Wongsiriroj N， et al. Hepatic stellate cell lipid droplets： a specialized lipid droplet for retinoid storage[J]. Biochim Biophys Acta， 2008， 1791（6）：467.

[4] 王家瓏，李紹白. 肝臟病學[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社， 2013：627.

[5] 孔一凡，史克莉.莪術研究概述[J].湖北中醫(yī)藥大學學報，2011，13（1）：47.

[6] 彭炳先，周欣，石京山，等.蓬莪術揮發(fā)油及其中3種成分抗肝癌和子宮內膜癌的研究[J].華西藥學雜志，2007，22（3）：312.

[7] 李萍，謝金鮮，江海燕，等. 廣西莪術5種不同炮制品抗腫瘤作用研究[J]. 中國實驗方劑學雜志， 2010， 16（9）： 155.

[8] 宋坤，陸兔林，李林. 莪術不同炮制品鎮(zhèn)痛抗炎作用研究[J]. 中醫(yī)藥學刊，2005，23（3）：443.

[9] 江遠， 熊麗.莪術治療肝病的研究進展[J].中西醫(yī)結合肝病雜志， 2005， 15（2）： 127.

[10] 李金慈，陸兔林，毛春芹，等.莪術醋制前后抗復合因素致大鼠肝纖維化作用的比較研究[J]. 中草藥， 2013， 44（19）：2710.

[11] Friedman S L. Liver fibrosis-from bench to bedside[J]. J Hepatol， 2003， 38（1）：S38.

[12] Zhang L，Peng X，Zhang Z，et al. Subcellular proteome analysis unraveled annexin A2 related to immune liver fibrosis[J]. J Cell Biochem， 2010， 110（1）：219.

[13] 李生財，李彤.肝纖維化動物模型的造模原理及應用[J].中華中醫(yī)藥學刊， 2006， 24（12）：2267.

[14] 付琴琴，王岸娜，吳立根.食醋抗氧化活性的研究進展[J].河南工業(yè)大學學報：自然科學版， 2012， 33（1）：88.

[15] Friedman S L. Hepatic fibrosis-overview[J]. Toxicology， 2008， 254（3）：120.

[16] 楊悅杰，黃芬. 肝星狀細胞及相關細胞因子在肝纖維化形成中的作用[J].世界華人消化雜志，2007，15（27）：2885.

[責任編輯 張寧寧]