HPLC測定新疆紫草不同部位中8種羥基萘醌的含量

昝珂+鄭凰雅+劉杰+過立農(nóng)+鄭健+馬雙成

[摘要] 建立同時測定新疆紫草Arnebia euchroma不同部位中左旋紫草素、β-羥基異戊酰紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、去氧紫草素、異丁酰紫草素、β， β′-二甲基丙烯酰阿卡寧和異戊酰紫草素等8種羥基萘醌含量的高效液相色譜法。采用Waters Xbridge C₁₈色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相乙腈-0.05%甲酸水溶液（70∶30），檢測波長275 nm，流速1 mL·min^-1，柱溫30 ℃。定量結(jié)果顯示，新疆紫草各部位中主要成分含量差異較大，根皮含量最高，其次是根，再次是莖殘基，根木質(zhì)部和地上部分含量較低。本研究為確定紫草藥用部位提供科學(xué)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 新疆紫草；高效液相色譜；不同部位；含量測定；羥基萘醌；β-羥基異戊酰紫草素；β， β′-二甲基丙烯酰阿卡寧；異戊酰紫草素

[Abstract] This present study is to develop an HPLC method for simultaneous determination of eight hydroxyl naphthoquinones， shikonin， β-hydroxy-isovalerylshikonin， acetylshikonin， β-acetoxy-isovalerylshikonin， deoxyshikonin， isobutyrylshikonin， β，β′-dimethylacrylshikonin and isovalerylshikonin. The eight constituents were measured on a Waters Xbridge C18 column （4.6 mm×250 mm，5 μm） with isocratic elution of acetonitrile-0.05% formic acid solution （70∶30） at a flow rate of 1.0 mL·min^-1. The detection wavelength was 275 nm and the column temperature was 30 ℃. The results of content determination indicated that significant differences of the eight compounds exist in every part of Arnebia euchroma，in which the highest part was the root bark， followed with the root， then the stem residues. The content of the xylem of root and aerial part was lower than the above parts. The results provided scientific basis for the medicinal parts of A. euchroma.

[Key words] Arnebia euchroma；HPLC；different parts；content determination；hydroxyl naphthoquinones；β-hydroxy-isovalerylshikonin；β， β′-dimethylacrylshikonin；isovalerylshikonin

紫草為常用藥材，最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，歷代本草均有收載。新疆紫草是1990年到2015年版《中國藥典》[1-6]中收錄的紫草藥材之一，來源于軟紫草屬的新疆紫草Arnebia euchroma （Royle） Johnst的干燥根，具有清熱涼血，活血解毒，透疹消斑，用于血熱毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、瘡瘍、濕疹、水火燙傷。

市場上銷售的新疆紫草不同批次的藥材性狀差別較大，2015年版《中國藥典》一部規(guī)定新疆紫草表面紫紅色或紫褐色，皮部疏松，常10余層重疊，易剝落，頂端常有較大的莖殘基，木部較小，黃白色或黃色。市售新疆紫草藥材有的批次僅有根皮，有的批次帶有較大莖殘基部分，甚至帶有綠色的莖葉等地上部分；根的木部大小不一，小的圓形直徑1～3 mm，大的半月形或圓柱形，直徑超過1 cm。

紫草中化學(xué)成分報道較多，主要活性成分為紫草素及其衍生物等羥基萘醌等紫色成分[7]。關(guān)于紫草藥材的含量測定報道已有多篇[8-10]，主要集中在紫草根的含量測定，最多同時測定7種主要成分。周健等[11]采用HPLC測定了新疆紫草的根和莖殘基中的β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧和紫草素的含量，根中含量高于莖殘基2倍以上。但未見有采用高效液相色譜法同時測定地上部分以及根木質(zhì)部中化學(xué)成分的文獻報道。紫草各部位差別較大，根的木部以及地上非紫色部分中含羥基萘醌類成分較低。不同部位在藥材中的比例將直接影響藥材的質(zhì)量，有必要對紫草各部位有效成分的含量進行系統(tǒng)研究。本實驗選擇左旋紫草素、β-羥基異戊酰紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、去氧紫草素、異丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧和異戊酰紫草素等8種羥基萘醌類成分為指標(biāo)，建立HPLC法對新疆紫草藥材以及根皮、木部、莖殘基以及地上部分（主要是莖葉等非紫色部分）進行了含量測定。本研究通過比較紫草不同部位8種活性成分含量，可進一步控制市售藥材紫草的質(zhì)量，并為確定紫草藥用部位提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

安捷倫1260型高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測器、四元泵、自動進樣器），QUINTIX313-1CN型1/1萬電子天平（Sartorius公司），MSE125S型1/10萬電子天平（Sartorius公司），純水儀（Millipore公司），超聲波清洗器（KQ-300G型，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

左旋紫草素（批號110769-200405），β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧（批號111689-201504）由中國食品藥品檢定研究院提供；β-羥基異戊酰紫草素（批號 PEL2204）由日本和光純藥工業(yè)株式會社提供；乙酰紫草素（批號 15062715）由上海士鋒生物技術(shù)有限公司提供；去氧紫草素（批號 AB52-LSEG）由日本化成工業(yè)株式會社提供；β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧（批號 P20N6FC331），異丁酰紫草素（批號 02D6Z6828），異戊酰紫草素（批號 Z1357B20931）由上海源葉生物技術(shù)有限公司提供。甲酸、甲醇和乙腈為色譜純，由Fisher公司提供，石油醚（60～90 ℃）由國藥集團化學(xué)試劑公司提供，水為Milli-Q超純水。

1.3 藥材

樣品采自新疆維吾爾族自治區(qū)博爾塔拉州、伊犁州和巴音郭楞州等地，經(jīng)中檢院民族藥室鄭健研究員鑒定為紫草科軟紫草屬新疆紫草A. euchroma的全株，60 ℃低溫烘干后，每批樣品經(jīng)分離得到根、根皮、根木部、莖殘基以及地上部分共5個部位。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱Waters Xbridge C₁₈色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.05%甲酸水溶液 （70∶30）；檢測波長275 nm；流速1 mL·min^-1，柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

2.2 混合對照品溶液的制備

取左旋紫草素、β-羥基異戊酰紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、去氧紫草素、異丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧、異戊酰紫草素各約10 mg，精密稱定，分別置10 mL量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，即得各對照品單標(biāo)儲備液。分別取各對照品儲備液適量置同一個10 mL量瓶中，加乙腈配制成上述8種成分分別為51.55，20.12，98.10，50.25，19.88，49.90，100.3，50.35 mg·L^-1的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品粉末（過4號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入石油醚（60～90 ℃）25 mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz） 30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用石油醚（60～90 ℃）補足失重，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10 mL，蒸干，殘渣加乙腈溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。對照品溶液及供試品溶液的色譜圖，見圖1。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取各對照品儲備液0.1，0.2，0.5，1.0 mL分別置于4個10 mL量瓶中，加乙腈定容至刻度，搖勻，即得2～5號混合對照品溶液。精密吸取2號混合對照品溶液1 mL置于10 mL量瓶中，加乙腈定容至刻度，搖勻，即得1號混合對照品溶液。分別精密吸取1～5號混合對照品溶液及各單個對照品溶液（因樣品中成分含量差異較大，混合對照品溶液無法滿足線性范圍，最高濃度采用單標(biāo)試驗）各10 μL，注入液相色譜儀，測定，以各對照品質(zhì)量濃度（mg·L^-1）為X軸，以峰面積為Y軸，進行線性回歸，各對照品回歸方程和線性范圍見表1。

結(jié)果表明，各對照品線性關(guān)系良好。

2.4.2 檢測限與定量限 將2.2項的混合對照品溶液用乙腈逐級稀釋后，按信噪比（S/N）約為3的對照品溶液濃度為檢測限（LOD），以信噪比（S/N）約為10的對照品溶液濃度為定量限（LOQ），結(jié)果見表1。

2.4.3 精密度試驗 精密吸取2.2項對照品混合溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果左旋紫草素、β-羥基異戊酰紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、去氧紫草素、異丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧和異戊酰紫草素的峰面積的RSD分別為0.94%，0.64%，0.35%，0.34%，0.28%，0.45%，0.55%，0.65%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性考察 取樣品粉末（樣品4的根部）6份，分別按照2.3項方法制備供試品溶液，按2.1項色譜方法測定，記錄峰面積，計算含量。結(jié)果各份供試品溶液的左旋紫草素、β-羥基異戊酰紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、去氧紫草素、異丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧和異戊酰紫草素的測定結(jié)果RSD （n=6）分別為2.2%，1.6%，2.0%，1.8%，1.3%，1.7%，1.9%，2.0%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.4.5 溶液穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液（樣品4的根部），室溫下分別放置0，2，4，8，12，24 h后進樣測定。結(jié)果左旋紫草素、β-羥基異戊酰紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、去氧紫草素、異丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧和異戊酰紫草素的峰面積的RSD （n=6）分別為1.9%，1.1%，0.63%，0.77%，0.88%，0.94%，0.51%，0.43%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 加樣回收率試驗 分別取左旋紫草素、β-羥基異戊酰紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、去氧紫草素、異丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧和異戊酰紫草素適量，精密稱定，置量瓶中，加乙腈溶解配制成質(zhì)量濃度分別為0.142 5，0.055 2，2.512，1.212，0.030 5，0.402 5，1.518，3.506 g·L^-1的對照品溶液。取已知含量的供試品粉末（樣品4的根部）6份，每份各約0.25 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，分別精密加入上述8種對照品溶液各1.0 mL，再精密加入石油醚（60～90 ℃）17 mL，之后操作參照2.3項方法平行制備供試品溶液，進樣分析，計算回收率，結(jié)果見表2，表明該方法加樣回收試驗結(jié)果良好。

2.5 樣品含量測定

精密稱取紫草藥材及其各部位藥材粉末0.5 g，分別按2.3項方法制備供試品溶液。精密吸取各供試品溶液10 μL，按2.1項色譜條件進行測定，用外標(biāo)法計算出左旋紫草素、β-羥基異戊酰紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、去氧紫草素、異丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧和異戊酰紫草素的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

本文色譜條件和溶液制備方法參考2015年版《中國藥典》一部含量測定項下優(yōu)化而成。羥基萘醌類成分極性較小，由于乙腈-0.05%甲酸水溶液（70∶30）為流動相，樣品采用石油醚（60～90 ℃）提取后，殘渣用乙腈溶解制備供試品溶液；對照品溶液亦采用乙腈溶解制備。

4 結(jié)論

從各部位含量測定結(jié)果分析，所測8批藥材中藥典指標(biāo)性成分β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧均符合《中國藥典》2015年版一部規(guī)定。從所測8種羥基萘醌總量看，根皮中總含量最高，其次是根，再次是莖殘基，根木部和地上部分中含量較低，見圖2。由于新疆紫草各部位中有效成分含量差別較大，加工藥材時應(yīng)控制莖殘基的比例，地上部分和根木部能否藥用，尚需進一步研究。

本文首次建立新疆紫草中8種羥基萘醌的含量測定方法，其中β-羥基異戊酰紫草素的含量測定為首次報道，并對新疆紫草不同部位進行了含量測定研究，對全面控制紫草藥材的質(zhì)量具有較好的參考意義。

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[責(zé)任編輯 丁廣治]