正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化酒石酸提取黑豆皮花色苷工藝

丁 潔,陳 靜,沙 芮,牛 犇,梁 寧,洪 霞

(甘肅省商業(yè)科技研究所,甘肅蘭州 730020)

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正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化酒石酸提取黑豆皮花色苷工藝

丁 潔,陳 靜,沙 芮,牛 犇*,梁 寧,洪 霞

(甘肅省商業(yè)科技研究所,甘肅蘭州 730020)

目的:優(yōu)化酒石酸提取黑豆皮花色苷的工藝。方法:以黑豆皮為原料,黑豆皮花色苷含量為指標(biāo),在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化酒石酸提取黑豆皮花色苷的工藝。結(jié)果:酒石酸提取黑豆皮花色苷最佳提取工藝為酒石酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%,料液比1∶30 g/mL,加熱溫度60 ℃,加熱時(shí)間150 min。花色苷含量14.32 mg/g。優(yōu)選工藝條件下，黑豆皮花色苷含量14.32 mg/g。結(jié)論：結(jié)果穩(wěn)定,具有生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。

黑豆皮種皮,花色苷,L-酒石酸,正交實(shí)驗(yàn)法

花色苷是一種水溶性天然食用色素,安全、無(wú)毒、資源豐富[1]。花色苷的苷元為花色素,但是花色素在自然狀態(tài)下不穩(wěn)定。因此,在植物中花色苷是由花色素與糖以糖苷鍵結(jié)合而成的一類多酚類化合物[2-3],廣泛存在于植物的花、果實(shí)、莖、葉和根器官的細(xì)胞液中。同時(shí)還具有抗氧化、抗癌、保護(hù)視力緩解眼部疲勞、延緩衰老、降壓等功效[4]。近年來(lái),除了利用花色苷良好的著色性,開發(fā)了一些天然色素外,其潛在的生物和藥理保健作用也受到人們廣泛的關(guān)注,流行病學(xué)研究表明,食用花色苷或富含花色苷的食物可以降低患心血管疾病、糖尿病[5]。因此花色苷已逐步向功能性健康食品方向發(fā)展。目前在日本、韓國(guó)就已有以花色苷為主要成分的產(chǎn)品,用于緩解電腦誘發(fā)的眼疲勞等癥狀[6]。在美國(guó),花色苷的建議攝入量為180～215 mg/d,用于抗氧化營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑,產(chǎn)品有片劑,每片含花色苷50 mg[7]?；ㄉ諒V泛存在于黑色谷物中,作為黑色谷物之一的黑豆,富含花色苷,并具有藥食兩用性。黑豆皮花色苷類化合物具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)血脂及抑制腫瘤等一系列促進(jìn)人類健康和預(yù)防疾病的生理功能,具有較強(qiáng)清除自由基和抗氧化的能力,是一種不可多得的具有保健功效的天然食用資源。隨著黑豆皮花色苷抗氧化、減肥等功效的確定,均可適用于開發(fā)成保健美容減肥的健康食品[8]。目前提取黑豆皮中的花色苷主要使用鹽酸,而花色苷未來(lái)多應(yīng)用于食品,酒石酸本身既是食品添加劑又是藥物工業(yè)原料。鑒于目前尚未見(jiàn)到酒石酸提取黑豆皮花色苷的相關(guān)報(bào)道,只有酒石酸提取陰香花色苷的報(bào)道[9]。本文以黑豆皮為原料,研究酒石酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、溫度、提取時(shí)間四個(gè)因素對(duì)黑豆皮花色苷含量的影響,運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化酒石酸提取黑豆皮花色苷的工藝,旨在為開發(fā)黑豆皮花色苷功能性食品藥品提供參考依據(jù)。矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(cyaniding-3-O-glucoside,C3G)是自然界中存在的最普遍、最典型、比較穩(wěn)定、易于獲得的花色苷或矢車菊素,它在水果蔬菜中的含量區(qū)別較大,在21種常見(jiàn)水果中,C3G分布最為普遍[10]。C3G又是黑豆皮花色苷中的主要活性成分[11],本實(shí)驗(yàn)通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定C3G含量,旨在為開發(fā)黑豆皮花色苷功能性食品藥品提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑豆皮 購(gòu)自蘭州市糧油市場(chǎng);純水 自制,pH6.82,電導(dǎo)率15 μs/cm(27 ℃);L-酒石酸 北京化工廠,批號(hào)830905;矢車菊素-3-O-葡萄糖苷 上海安普公司,純度99.05%,批號(hào)Z0210010。

XS225A型電子分析天平 普利塞斯,瑞士;優(yōu)普UPT-I-20L落地式純水機(jī)四川優(yōu)普超純科技;UV2300Ⅱ型雙光束紫外可見(jiàn)光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑豆皮花色苷的提取工藝 黑豆浸泡2 h以上，取黑豆皮，烘干，粉碎，準(zhǔn)確稱取黑豆種皮粉末1.000 g,加入一定體積的酒石酸溶液,在一定溫度下加熱、振蕩、抽濾、定容[12]。

1.2.2 花色苷含量的測(cè)定 通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定,以C3G作為對(duì)照品,采用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算法計(jì)算,花色苷含量以C3G計(jì)[13-16]。

花色苷的含量(mg/g)=n×V×f/M

式中，n-樣品濃度(mg/mL),V-樣品體積(mL),f-稀釋倍數(shù)，M-黑豆皮質(zhì)量(g)。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 固定酒石酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%,黑豆種皮與酒石酸溶液料液比1∶30 g/mL、溫度30 ℃、提取60 min的情況下,改變其他因素水平,酒石酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)(g/mL)10%,20%,30%,40%,50%;料液比1∶10,1∶20,1∶30,1∶40,1∶50 g/mL;溫度30,40,50,60,70 ℃;提取時(shí)間30,60,90,120,150 min;進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),以花色苷含量為指標(biāo),選擇較優(yōu)參數(shù)。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用SPSS 19.0軟件,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置水平,以酒石酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素的3個(gè)水平設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)L9(34)優(yōu)化酒石酸提取黑豆皮花色苷工藝。

1.2.5 黑豆皮中花色苷含量測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制:準(zhǔn)確稱取C3G標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.05%)0.00506 g(精確到0.0001 g)。置于5 mL容量瓶中,加入甲醇制成含C3G 1.0024 mg·mL-1的儲(chǔ)備液溶液。樣品溶液配制:準(zhǔn)確吸取按照1.2.1方法下制備的樣品1 mL,置于10 mL容量瓶中,加入甲醇,待測(cè)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(M±SE)表示,對(duì)各組結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)Duncan檢驗(yàn)比較差異,以不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Orthogonal factor table

2 結(jié)果與分析

2.1 花色苷含量測(cè)定

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取C3G標(biāo)準(zhǔn)品溶液,進(jìn)行紫外掃描,由圖1可知，C3G在可見(jiàn)光區(qū)域520 nm處有最大吸收,可見(jiàn)光區(qū)域520 nm處為其特征吸收,所以本實(shí)驗(yàn)在520 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)C3G的含量。

圖1 全波長(zhǎng)掃描Fig.1 Full wavelength scanning

2.1.2 線性關(guān)系考察 分別取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0,0.1,0.2,0.4,0.6 mL,置于10 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容,進(jìn)行紫外分光測(cè)定。以吸光度y對(duì)C3G的質(zhì)量濃度x(mg/mL)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示C3G在0～0.06 mg范圍內(nèi)與吸光度相關(guān)性較好,回歸方程為:y=28.266x-0.0397,R2=0.9958。C3G的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1 酒石酸濃度對(duì)黑豆皮花色苷含量的影響 圖3結(jié)果顯示,其他條件不變時(shí),黑豆皮花色苷含量隨酒石酸濃度的增加而增加。在酒石酸濃度達(dá)40%時(shí),花色苷含量最大,這是因?yàn)榛ㄉ赵谒嵝詶l件下呈穩(wěn)定的紅色,溶出率較高,酒石酸濃度較小時(shí),花色苷提取不充分;當(dāng)酒石酸濃度過(guò)大,花色苷含量有所降低,由于酸性較強(qiáng)引起花色苷水解,導(dǎo)致含量下將[9]。在保證花色苷提取率高的前提下,還應(yīng)考慮其穩(wěn)定性。因此選擇30%～50%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的酒石酸為正交實(shí)驗(yàn)因素水平。

圖3 酒石酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)花色苷含量的影響Fig.3 Effect of the quality fraction of acid on the extraction rate of anthocyanin content注:不同小寫字母表示差異顯著p<0.05,圖4～圖6同。

2.2.2 料液比對(duì)黑豆皮花色苷含量的影響 由圖4可知,花色苷得率隨著料液比提高而增加,且差異顯著。當(dāng)料液比為1∶10 g/mL時(shí),由于黑豆皮粉末在吸水溶脹后沒(méi)有多余提取液,使花色苷溶解不完全,對(duì)花色苷含量有影響。當(dāng)料液比從1∶10 g/mL提高至1∶20 g/mL,花色苷含量大幅提高,說(shuō)明花色苷由黑豆皮向提取液擴(kuò)散速率變快,充分溶解,溶解量增大。而當(dāng)料液比繼續(xù)增加,花色苷含量變化不大,料液比超過(guò)1∶40 g/mL含量基本不變,說(shuō)明花色苷溶解速率達(dá)到平衡,因此實(shí)驗(yàn)選擇1∶30～1∶50 g/mL為料液比的正交實(shí)驗(yàn)因素水平。

圖4 料液比對(duì)花色苷含量影響Fig.4 Effect of material-to-liquid on anthocyanin content

2.2.3 提取溫度對(duì)花色苷含量的影響 由圖5看出,花色苷含量隨著提取溫度的增長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)。30～60 ℃時(shí),溫度升至60 ℃時(shí),粗提液中花色苷含量最高,隨著溫度進(jìn)一步升高,花色苷含量出現(xiàn)明顯下降。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是溫度低,花色苷溶出的不完全,導(dǎo)致含量較低,然而花色苷是熱敏性色素,在高溫下不穩(wěn)定,結(jié)構(gòu)容易發(fā)生改變[16],升高到一定溫度,使部分花色苷發(fā)生分解,花色苷含量降低。因此實(shí)驗(yàn)選擇50～70 ℃為料液比的正交實(shí)驗(yàn)因素水平。

圖5 提取溫度對(duì)花色苷含量的影響Fig.5 Effect of temperature on anthocyanin content

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)花色苷含量的影響 由圖6看出,隨著提取時(shí)間延長(zhǎng),花色苷含量呈上升趨勢(shì),在30～90 min內(nèi)花色苷增加較快,且差異顯著,超過(guò)120 min花色苷含量不再上升,說(shuō)明120 min左右花色苷提取達(dá)到平臺(tái)期。隨著提取時(shí)間增加,花色苷被分解,花色苷含量略有下降。因此實(shí)驗(yàn)選擇90～150 min為花色苷提取的正交實(shí)驗(yàn)因素水平。

圖6 提取時(shí)間對(duì)花色苷含量的影響Fig.6 Effect of extraction time on anthocyanin content

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇4個(gè)影響因素的3個(gè)水平設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)L9(34)優(yōu)化酒石酸提取黑豆皮花色苷工藝,正交實(shí)驗(yàn)因素表見(jiàn)表1?？疾熘笜?biāo)為花色苷含量,正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2,方差分析見(jiàn)表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal design results

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

注:F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00。

從表3結(jié)果可見(jiàn),酒石酸提取黑豆皮中花色苷的影響因素中加熱溫度和酒石酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響極其顯著,料液比和加熱回流時(shí)間影響不顯著。表2正交實(shí)驗(yàn)中直觀分析和極差分析結(jié)果中得出的最佳工藝方案是均是A2B1C2D3。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在酒石酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%,料液比1∶30 (g/mL),加熱溫度60 ℃,加熱時(shí)間150 min條件下進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),計(jì)算花色苷,重復(fù)6次,花色苷含量為14.32 mg/g,RSD=0.58%(n=6)。

3 結(jié)論

本文在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化了酒石酸提取黑豆皮花色苷工藝條件。在正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所選條件范圍內(nèi),加熱時(shí)間對(duì)黑豆皮花色苷含量的影響最大,其次為酒石酸質(zhì)量分?jǐn)?shù),然后是料液比,加熱回流時(shí)間影響最小。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定酒石酸提取花色苷的最佳工藝參數(shù)為:酒石酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%,料液比1∶30 (g/mL),加熱溫度60 ℃,加熱時(shí)間150 min?；ㄉ蘸?4.32 mg/g。

黑豆皮中花色苷主要作為食品藥品中間體,提取多采用鹽酸、冰乙酸等溶劑提取[17-18]。本實(shí)驗(yàn)在前期小試實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)無(wú)機(jī)酸的弊端在于會(huì)增加后期食品中的灰分。冰乙酸氣味刺激性較大，對(duì)食品口感影響較大。酒石酸作為食品添加劑且無(wú)色無(wú)味,對(duì)后期花色苷的應(yīng)用影響較小,以本實(shí)驗(yàn)采用酒石酸作為新的提取溶劑,旨在為黑豆皮花色苷資源的開發(fā)和利用提供新方法。目前對(duì)花色苷測(cè)定多采用pH示差法[13-14],本實(shí)驗(yàn)以C3G為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照,采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)花色苷含量,C3G在紫外分光測(cè)試中在520 nm下有最大吸收波長(zhǎng)。結(jié)果顯示該方法準(zhǔn)確度、靈敏度及穩(wěn)定性均較好,為課題組下一步對(duì)于花色苷單一成分質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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Optimization of tartaric acid extraction of anthocyaninsfrom soybean hulls by orthogonal experiment

DING Jie,CHEN Jing,SHA Rui,NIU Ben*,LIANG Ning,HONG Xia

(Commercial Technology Institute of Gansu Province,Lanzhou 730020,China)

Objective:Optimization of tartaric acid extraction of anthocyanin from black soybean hulls. Methods:Black soybean hulls and black soybean anthocyanin content were used as raw materials and the index,the process optimization of tartaric acid extraction of black soybean anthocyanin were investigated by orthogonal experimental design. Results:The best extraction process of tartaric acid extraction of anthocyanins from black soybean hulls was the tartaric acid concentration of 40%,solid-liquid ratio 1∶30 g/mL,extraction temperature of 60 ℃,extraction time of 150 min.According to the optimal process conditions of black soybean hulls,anthocyanin yield was 14.32 mg/g. Conclusion:The result of the experiment proves that the result is stable and has the value of production and application.

black soybean hulls;anthocyanin;L-tartaric acid;orthogonal experiment

2016-12-23

丁潔(1986-)，碩士，工程師，從事天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)工作， E-mail：dingjie860118@163.com。

*通訊作者:牛犇(1967-)，大學(xué)，正高級(jí)工程師，從事天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)工作， E-mail：lzniuben@163.com。

甘肅省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(1207TTCA011);甘肅省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專項(xiàng)(1606RTSA337)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)13-0163-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.030