響應(yīng)面法優(yōu)化藜麥種皮過氧化物酶固定化條件

范三紅,田賀賀,柴利萍,劉歡歡,李 晨

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006)

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響應(yīng)面法優(yōu)化藜麥種皮過氧化物酶固定化條件

范三紅,田賀賀,柴利萍,劉歡歡,李 晨*

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006)

以從藜麥種皮中提取的過氧化物酶為原材料,利用0.2%聚乙烯醇-3%海藻酸鈉(PVA-CA)為載體,CaCl2溶液作固定劑,采用包埋法對藜麥種皮過氧化物酶進(jìn)行固定。在單因素實驗的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面分析法對藜麥種皮過氧化酶固定化的影響因素進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后得到的最佳固定化條件如下:氯化鈣濃度為7%,固定化時間為26 min,載體與酶液的比例為1.25∶1(mL/mL),在此條件下實際測得固定化酶的活性為416.5 U。實測值與理論值(417.4U)相差較小,充分驗證了所建模型的可靠性。

藜麥種皮,過氧化物酶,響應(yīng)面法,固定化

過氧化物酶(Peroxidase,POD)在植物界廣泛存在,參與生物體中許多重要的生物反應(yīng),發(fā)揮著重要功能。例如參與植物體內(nèi)防御反應(yīng)[1]、分解吲哚乙酸[2]、合成木質(zhì)素等[3]。由于POD來源廣泛,性質(zhì)相對穩(wěn)定,對某些有機(jī)溶劑亦不敏感,POD作為標(biāo)記酶廣泛用于免疫印跡、酶聯(lián)免疫及電鏡等生物技術(shù)。如今,人們逐漸研究出POD的新用途,如在合成燃料中可用作脫色劑[4]、制作新型生物傳感器[5]、處理酚類廢水[6]等。

固定化酶是指通過物理吸附、包埋或化學(xué)結(jié)合、交聯(lián)等方法將酶與不溶于水的目標(biāo)載體相結(jié)合,從而將酶固定在載體上的過程。固定化的酶穩(wěn)定性普遍高于游離酶,且可以重復(fù)使用,酶制劑的價格一般較化學(xué)催化劑高昂,重復(fù)使用的固定化酶有利于節(jié)約生產(chǎn)成本,同時將酶限定在一定的空間內(nèi),可以方便的將酶與反應(yīng)液分離,有利于簡化催化工藝,提高產(chǎn)品的純度和生產(chǎn)效率[7]。目前,固定化酶技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品[8]、環(huán)境保護(hù)[9]、生物工程[10-11]等多個領(lǐng)域。目前已有辣根過氧化物酶[12]、蓮藕過氧化物酶[13]、空心菜過氧化物酶[14]等多種過氧化物酶固定化的報道。

藜麥(Chenopodiumquinoa),屬藜科,為一年生雙子葉植物,是公認(rèn)的全營養(yǎng)谷物。由于種皮皂苷含量高,具有苦味,在藜麥的商業(yè)化生產(chǎn)過程中都要進(jìn)行脫皮處理。目前有關(guān)藜麥的研究大多集中在對其營養(yǎng)成分[15-16]及黃酮類物質(zhì)的分析[17],而對藜麥過氧化物酶的研究鮮有報道。藜麥?zhǔn)欠N糧食作物,與已報道的辣根、蓮藕、空心菜等相比,有產(chǎn)量大的優(yōu)勢,能夠為過氧化物酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供充足原料。另外,藜麥種皮作為一種加工副產(chǎn)品,深入研究開發(fā)其中的生物活性成分,可以提高藜麥的綜合利用價值。因此,生產(chǎn)藜麥過氧化物酶具有來源廣、價格低等優(yōu)勢,藜麥種皮是一種制備廉價過氧化物酶的理想材料。本實驗以從藜麥種皮中提取的過氧化物酶為研究對象,采用物理包埋法對其進(jìn)行固定化,并在單因素實驗的基礎(chǔ)上設(shè)計了Box-Behnken實驗,對藜麥種皮過氧化物酶固定化條件進(jìn)行優(yōu)化,為進(jìn)一步推動藜麥資源的開發(fā)利用提供重要理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藜麥種皮 由山西華青藜麥產(chǎn)品開發(fā)有限公司提供;海藻酸鈉,愈創(chuàng)木酚,聚乙烯醇 購自上海生工;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

UV-1600紫外可見分光光度計 上海析譜儀器有限公司;精密電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;精密pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;高速冷凍離心機(jī) 德國艾本德股份公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藜麥種皮過氧化物酶的制備及固定化 準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的藜麥糠,按1∶10(m/V)加入提取緩沖液(50 mmol/L PBS,pH7.3),4 ℃攪拌提取6 h后12000 r/min離心,取上清,加硫酸銨至80%飽和度,4 ℃鹽析4 h后12000 r/min離心,取沉淀,用少量浸提緩沖液溶解并充分透析后上樣于DEAE-Sepharose層析柱,洗脫液為pH7.3 NaCl-PBS緩沖液,采用線性梯度洗脫,對各洗脫峰進(jìn)行過氧化物酶活性測定,收集活性洗脫峰,濃縮后進(jìn)一步上樣于Superdex 75 10/300 GL層析柱,洗脫液為pH7.3 50 mmol/L PBS緩沖液,內(nèi)含100 mmol/L NaCl。收集活性洗脫峰,脫鹽濃縮后于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

以從藜麥種皮中提取的過氧化物酶作為實驗材料,以聚乙烯醇(PVA)-海藻酸鈉(CA)為載體,采用包埋法固定。海藻酸鈉不僅有良好的生物相容性,而且安全、無毒,價格低廉,材料易得,可以在比較溫和的條件下實現(xiàn)對POD的固定[18];聚乙烯醇機(jī)械強(qiáng)度大,可以彌補(bǔ)海藻酸鈉機(jī)械強(qiáng)度低的缺陷,因此將二者混合使用,以期達(dá)到理想的固定化效果。

配制0.2%聚乙烯醇-3%海藻酸鈉溶液,作為固定POD的載體。將載體溶液與POD酶液混合均勻,用5 mL注射器勻速緩慢滴注到氯化鈣溶液中,在4 ℃下固定。待酶固定后,過濾,洗滌,得球狀固定化藜麥種皮過氧化物酶。

1.2.2 過氧化物酶活性測定 采用愈創(chuàng)木酚法測過氧化酶活性[19]。反應(yīng)體系為3 mL,包括2.5 mL PBS緩沖液(pH7.0)、0.1 mL 1% H2O2,0.4 mL 1%愈創(chuàng)木酚。加入0.1 mL酶液后快速混勻啟動反應(yīng),記錄25 ℃下反應(yīng)液在3 min內(nèi)OD470的變化。在測定條件下,每分鐘內(nèi)使反應(yīng)液OD470改變0.001定義為一個酶活力單位(U)。準(zhǔn)確稱取0.100 g固定化酶,加入3 mL測活反應(yīng)液,反應(yīng)2 min后迅速取出反應(yīng)液測定OD470值,并計算酶活力。重復(fù)三次。

1.2.3 不同因素對固定化效果的影響

1.2.3.1 CaCl2濃度對固定化酶活性的影響 配制濃度為2%,4%,6%,8%,10%的CaCl2溶液,載體和酶液體積之比為2∶1,二者混合均勻,4 ℃靜置30 min后,測定酶活。

1.2.3.2 載體與酶液之比對固定化酶活性的影響 將載體與酶液按照體積比為0.5∶1,1∶1,1.5∶1,2∶1,2.5∶1,混合均勻,與4%的CaCl2溶液混合均勻,4 ℃靜置30 min后,測定酶活。

1.2.3.3 固定化時間對固定化酶活性的影響 將載體與酶液按體積比為2∶1混勻,與4%的CaCl2溶液混合,分別靜置5,15,25,35,45 min后測定酶活性。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化的實驗設(shè)計 根據(jù)單因素實驗所得結(jié)果,設(shè)計了Box-Behnken中心組合實驗,因素水平表見表1。

表1 Box-Behnken實驗因素及水平設(shè)計Table 1 Independence variables and their levels for Box-Behnken design

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析 1.2.3中實驗所得數(shù)據(jù)采用Origin8.5軟件分析作圖,1.2.4響應(yīng)面實驗結(jié)果采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對藜麥種皮過氧化物酶固定化的優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 CaCl2濃度對固定化酶活性的影響 如圖1所示,在 CaCl2濃度為2%～6%濃度范圍內(nèi),酶活力逐漸增加;當(dāng) CaCl2濃度大于6%時,酶活降低。推測是因為Ca2+濃度與形成凝膠球的孔徑有關(guān),當(dāng)Ca2+濃度過高時會使凝膠球的交聯(lián)太過緊密而影響酶促反應(yīng)速率。因此,本實驗中CaCl2的最佳濃度應(yīng)選為6%。

圖1 CaCl2濃度對固定化酶活性的影響Fig.1 Effects of CaCl2 concentration on activity of immobilized enzyme

2.1.2 載體與酶液比例對固定化酶活性的影響 如圖2所示,隨著載體與酶液比例的增加,固定化酶的活力逐漸升高,但是當(dāng)二者之比大于1.5∶1之后,酶活力逐漸降低。分析其原因,是由于載體與酶液比例較低時,載體含量相對不足,不能使過氧化物酶得到充分固定,而二者之比大于1.5∶1之后酶活力降低是因為載體含量過多,導(dǎo)致固定化過程中Ca2+和Na+的置換時間延長,影響固定化酶的量,從而影響酶活性。因此本實驗選用載體與酶液最適合的比例是1.5∶1。

圖2 載體與酶液比例對固定化酶活性的影響Fig.2 Effects of different enzyme amounts on activity of immobilized enzyme

2.1.3 固定化時間對固定化酶活性的影響 如圖3所示,當(dāng)固定化酶時間為25 min時,固定化酶活性最高,之后隨著固定化時間的延長,酶活性逐漸降低。推測在此條件下,25 min左右時海藻酸鈉對酶的包埋便已達(dá)到較充分的狀態(tài),隨著包埋時間的延長,由于酶的損失等引起酶活性下降,因此本實驗中酶的最佳固定化時間選為25 min。

圖3 固定化時間對固定化酶活性的影響Fig.3 Effects of immobilized time on activity of immobilized enzyme

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果及分析

2.2.1 響應(yīng)面實驗的方案設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)單因素實驗的結(jié)果,由Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計分析軟件設(shè)計出實驗方案及實驗結(jié)果,如表2所示。以酶活性為響應(yīng)值,氯化鈣濃度(A)、載體與酶液比例(B)、固定化時間(C)為自變量,建立三因素三水平中心組合實驗設(shè)計,包括17個實驗方案,其中12個為分析實驗點,5個為中心實驗點,用以估計實驗誤差。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及實驗結(jié)果Table 2 Box-Behnken design for independent variables and their corresponding immobilized enzyme activity

2.2.2 回歸方程擬合及方差分析 利用Design Expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,結(jié)果見表3,對各因素進(jìn)行回歸擬合后,得到的多元二次回歸方程為:Y=46.5978+61.9678A+27.8517B+8.4269C+8.4333-0.2778+1.0433BC-4.7436A2-45.4700B2-0.1505C2。

由表3可知,A、B、C、A2、C2對固定化酶活性影響顯著,AB,BC,AC交互作用影響不顯著,表明載體與酶液比例、CaCl2濃度、固定化時間這幾個因素均對固定化藜麥種皮過氧化物酶酶活有顯著影響;A2、C2的影響顯著,說明在固定化過程中CaCl2濃度和固定化時間對固定化酶活性的影響是非線性的。

2.2.3 響應(yīng)面分析條件優(yōu)化 根據(jù)表3實驗結(jié)果,利用軟件繪制響應(yīng)面三維圖,分析AB,AC,BC這3組交互作用對固定化酶的影響,所得實驗結(jié)果如圖4所示。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for the fitted regression equation

圖4 兩因素交互作用對固定化酶活性影響的等高線圖及響應(yīng)面Fig.4 Response surface and contour plots for the interactive effects of immobilized parameters on the activity of enzyme

注:**p<0.01表示差異極顯著;*p<0.05為顯著。由4A等高線可以看出,AC的交互作用對固定化酶活性有一定影響,在氯化鈣濃度為6%～8%、時間為22～30 min條件下,酶活性達(dá)到最高值;圖4B顯示固定化酶活性對載體與酶液比例變化更敏感,酶活性最高值出現(xiàn)在時間為22～30 min、載體與酶液比例為1.0～1.2(mL/mL)條件下;圖4C說明酶活性對氯化鈣濃度的變化較為敏感,在氯化鈣濃度為5.5%～8%、載體與酶液比例為1.0～1.6(mL/mL)時,酶活性最高。由圖4可知,三維曲面在實驗區(qū)域內(nèi)有最高點,表明本實驗所得結(jié)果Y在實驗區(qū)域內(nèi)有最大值。由響應(yīng)面圖可以分析得出,固定化酶活性隨任意兩個因素量的增加呈上升趨勢,當(dāng)兩因素達(dá)到一定水平時,固定化酶活性的增加變得緩慢,最后轉(zhuǎn)為下降趨勢。

依據(jù)響應(yīng)面實驗得到藜麥種皮過氧化物酶的最佳固定化條件為,CaCl2體積分?jǐn)?shù)為6.88%,載體與酶液比1.24∶1(mL/mL),固定化時間25.94 min?？紤]到實驗的可行性,修正了最優(yōu)實驗條件:CaCl2體積分?jǐn)?shù)為7%,載體與酶液比1.25∶1(mL/mL),固定化時間26 min。在此工藝條件下進(jìn)行了三次驗證實驗,所得藜麥過氧化物酶活性的平均值為416.5 U,與模型所得理論值417.4 U相近,偏差較小。表明回歸方程能夠較真實地反映各因素對藜麥種皮過氧化物酶固定化結(jié)果的影響,Box-Behnken實驗設(shè)計得到的模型擬合程度較高,表明本實驗方法可靠,將其用于優(yōu)化藜麥過氧化物酶固定化工藝具有可行性。

3 結(jié)論

響應(yīng)面法是一種考量多因素影響條件的優(yōu)化方法,廣泛應(yīng)用于結(jié)構(gòu)的優(yōu)化設(shè)計,實驗的可靠性分析等。通過固定數(shù)量的實驗次數(shù)可以對實驗因素進(jìn)行連續(xù)分析,并得到直觀的3D曲面圖進(jìn)而評價各因素間的交互作用[20]。

單因素實驗得到過氧化物酶的最優(yōu)提取條件在CaCl2濃度6%、載體與酶液比1.5∶1 (mL/mL)、固定化時間25 min。在此基礎(chǔ)上設(shè)計了響應(yīng)面實驗對藜麥種皮過氧化物酶的固定化條件進(jìn)行優(yōu)化,建立了以固定化酶活性為響應(yīng)值的回歸模型,模型擬合程度較高,表明實驗結(jié)果準(zhǔn)確有效。在該模型下的固定化酶活性最高,此時的固定化條件為CaCl2濃度7%、載體與酶液比1.25∶1 (mL/mL)、固定化時間26 min,此條件下所得的固定化后的藜麥種皮過氧化物酶活性最高。經(jīng)方差分析得知,CaCl2濃度、載體與酶液比例、固定化時間對固定化酶活性的影響都是顯著的,而且是非線性的,但它們的交互影響不顯著。實驗結(jié)果表明,響應(yīng)面分析法可以有效地優(yōu)化藜麥種皮過氧化物酶的固定化條件,這為進(jìn)一步提高藜麥的綜合利用提供了理論依據(jù)。

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Optimization of peroxidase immobilization conditionsfromChenopodiumquinoa bran using response surface methodology

FAN San-hong,TIAN He-he,CHAI Li-ping,LIU Huan-huan,LI Chen*

(College of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

The peroxidase extracted fromChenopodiumquinoa bran were fixed by the method of embedment,using the peroxidase fromChenopodiumquinoa as raw materials,0.2% of polyvinyl alcohol and 3% of sodium alginate as the carrier,CaCl2solution as fixative. On the basis of single factor experiments,the response surface methodology was employed to optimize the related influential immobilization conditions of peroxidase fromChenopodiumquinoa bran. The results of optimum immobilization conditions were as follow:CaCl2concentration of 7%,immobilization time of 26 min,the ratio of carrier to peroxidase of 1.25∶1(mL/mL). With these conditions,the optimum activity of immobilization peroxidase fromChenopodiumquinoa were obtained,and the activity of the peroxidase was 416.5 U. The experimental value was in high agreement with the predicted value(417.4 U),which showed the validity of this response model.

Chenopodiumquinoa bran;peroxidase;response surface;immobilization

2016-12-23

范三紅(1963-)，男，碩士，教授，研究方向：食品活性成分及其功能，E-mail:fsh729@sxu.edu.cn。

*通訊作者:李晨(1981-)，女，博士，副教授，研究方向：蛋白質(zhì)與酶工程，E-mail:lichen@sxu.edu.cn。

山西大學(xué)科研訓(xùn)練項目(2015013225)；山西省青年科學(xué)基金(2015021047)；山西省高?？萍紕?chuàng)新項目(2016116)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)13-0197-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.037