河南省大白菜根腫病菌生理小種鑒定

原玉香，趙艷艷，魏小春，姚秋菊，蔣武生，王志勇，李揚(yáng)，許茜，楊雙娟，張曉偉*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，河南鄭州450002;2.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州450000)

河南省大白菜根腫病菌生理小種鑒定

原玉香1，趙艷艷1，魏小春1，姚秋菊1，蔣武生1，王志勇1，李揚(yáng)2，許茜2，楊雙娟1，張曉偉1*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，河南鄭州450002;2.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州450000)

為了明確河南省大白菜根腫病菌的生理小種類型，從新野縣十字花科蔬菜種植基地采集2份大白菜根腫病菌樣品(XY－1為原始菌，XY－2為新引菌)，采用菌液注射接種法，利用Williams和ECD 2套鑒別系統(tǒng)分別對(duì)其進(jìn)行生理小種鑒定。結(jié)果顯示，采用Williams鑒別系統(tǒng)鑒定的2份大白菜根腫病菌生理小種相同，均為4號(hào)生理小種;采用ECD鑒別系統(tǒng)鑒定的大白菜根腫病菌生理小種明顯不同，原始菌XY－1為ECD16/15/31，新引菌XY－2為ECD21/31/31，后者較前者的致病性更強(qiáng)。以上結(jié)果表明，Willams鑒別系統(tǒng)有一定的局限性，當(dāng)病原菌致病力強(qiáng)于4號(hào)生理小種時(shí)無法區(qū)分，而ECD鑒別系統(tǒng)由于所用寄主數(shù)量及種類較多，可以將4號(hào)生理小種進(jìn)一步區(qū)分為不同的類型，鑒定結(jié)果更為精確。

大白菜;根腫病菌;生理小種;Williams系統(tǒng);ECD鑒別系統(tǒng)

根腫病是由根腫菌目蕓薹根腫菌(Plasmodiophora brassicae Woron.)侵染十字花科植物根部引起植株萎蔫凋亡的一種世界性土傳病害［1］。根腫病菌被歸為原生界根腫菌門［2］，其通過侵染十字花科植物根毛導(dǎo)致根部薄壁細(xì)胞增生而形成腫瘤［3］。該病害分別于18世紀(jì)30年代和19世紀(jì)70年代在地中海西岸(英國)和歐洲南部(前蘇聯(lián)列寧格勒)發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)今全世界多個(gè)國家均有分布［4］。在我國，黃齊望等［5］首次報(bào)道了江西省發(fā)生十字花科根腫病，目前，該病在國內(nèi)27個(gè)省、市、自治區(qū)都有分布［6］。新野縣是河南省最大的十字花科蔬菜種植基地，于2007年在大白菜上發(fā)現(xiàn)根腫病，近年來，該病蔓延非常迅速，發(fā)生面積急劇增加。尤其是2015年8—9月，當(dāng)?shù)夭宿r(nóng)在秋大白菜育苗時(shí)不慎購用了某公司生產(chǎn)的帶有根腫菌的育苗基質(zhì)，致使原本抗當(dāng)?shù)馗[病的大白菜新品種在苗齡20多天時(shí)嚴(yán)重感病，給菜農(nóng)帶來了極大的損失，嚴(yán)重威脅著當(dāng)?shù)厥只剖卟说目沙掷m(xù)生產(chǎn)。

在根腫病菌生理小種分化研究方面，Honig［7］首次證實(shí)該病原菌存在生理小種分化。目前，國際上通用的根腫病菌生理小種鑒別系統(tǒng)有2套:Williams系統(tǒng)和ECD系統(tǒng)(European clubroot differential series，歐洲根腫病菌生理小種鑒別系統(tǒng))［8-9］。Williams鑒別系統(tǒng)由2個(gè)結(jié)球甘藍(lán)和2個(gè)蕪菁甘藍(lán)共4個(gè)鑒別寄主組成，ECD系統(tǒng)由白菜組、甘藍(lán)型油菜組和甘藍(lán)組各5個(gè)鑒別寄主組成［8-9］。目前，全世界已鑒定出24個(gè)以上的生理小種［10］。在我國，沈向群等［11］已從遼寧、山東、云南、四川、吉林等地區(qū)采集的大白菜根腫病菌中初步鑒定出了4、2、7、10、11號(hào)等共5個(gè)生理小種，丁云花等［12］從我國8省(市) 18份根腫病菌中鑒定出了4、7、2號(hào)共3個(gè)生理小種。上述根腫病菌生理小種鑒定均采用Williams系統(tǒng)，目前，國內(nèi)尚無利用ECD系統(tǒng)對(duì)大白菜根腫病菌生理小種進(jìn)行鑒定的報(bào)道。

本試驗(yàn)采用菌液注射接種法，利用Williams和ECD 2套鑒別系統(tǒng)，對(duì)采自河南省南陽市新野縣城郊鄉(xiāng)的2份大白菜根腫病原菌XY－1(新野原始菌)和XY－2(基質(zhì)新引菌)進(jìn)行生理小種鑒定，旨在明確其生理小種類型，為河南大白菜根腫病研究和抗根腫病育種研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試根腫病菌2份供試根腫病原菌分別為XY－1和XY－2，均采集于河南省新野縣城郊鄉(xiāng)呂莊村。XY－1為田間大白菜發(fā)病植株的病根，代表新野當(dāng)?shù)卦季?XY－2為育苗基質(zhì)中發(fā)病大白菜幼苗腫根，代表因基質(zhì)帶菌而引入新野的新菌。將其新鮮的膨大根瘤洗凈后，晾干表面水分，密封于自封袋中，于－20℃冰箱中保存。

1.1.2 鑒別寄主分別采用Williams和ECD鑒別系統(tǒng)進(jìn)行根腫病菌生理小種鑒定［8-9］。Williams鑒別系統(tǒng)包括Jersey Queen(JQ)、Badger Shipper(BS)、Laurentian(LT)及Wilhelms burger(WB)。ECD鑒別系統(tǒng)由白菜(B.rapa L.)(2n=20)、甘藍(lán)型油菜(B.napus L.)(2n=38)和甘藍(lán)(B.oleracea L.)(2n= 18)3組蕓薹屬寄主共15個(gè)品種(系)組成。ECD05是結(jié)球白菜(B.rapa var.pekinensis)品種Granaat，在ECD鑒別系統(tǒng)中被作為感病對(duì)照;ECD12是抗根腫病的結(jié)球甘藍(lán)親本材料［9］;ECD鑒別系統(tǒng)中的鑒別寄主ECD11和ECD13分別對(duì)應(yīng)于Williams鑒別系統(tǒng)中的結(jié)球甘藍(lán)BS和JQ。ECD鑒別寄主種子由加拿大曼尼托巴大學(xué)栗根義教授提供，Williams鑒別寄主中的2個(gè)甘藍(lán)型油菜品種LT及WB種子由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心余陽俊研究員提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌液注射接種試驗(yàn)于2015年3—10月在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所位于新野的根腫病抗性鑒定圃大棚內(nèi)進(jìn)行，菌液制備和接種方法參考丁云花等［12］的方法。

播種后每穴注射1 mL菌液進(jìn)行接種，接種懸浮液孢子濃度為1×107個(gè)/mL。在利用Williams和ECD系統(tǒng)進(jìn)行生理小種鑒定試驗(yàn)中，每份菌樣分別同時(shí)接種4個(gè)和15個(gè)鑒別寄主，以高感材料豫新55為對(duì)照。Williams鑒別寄主和ECD寄主每個(gè)品種分別接種30株和50株，接種后45 d左右，對(duì)照正常發(fā)病且為7級(jí)時(shí)進(jìn)行調(diào)查。

1.2.2 病情調(diào)查病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201003029)制定的標(biāo)準(zhǔn)。0級(jí):根部無腫瘤;1級(jí):側(cè)根有小腫瘤;3級(jí):主根腫大，其直徑小于2倍莖基部;5級(jí):主根腫大，其直徑為莖基部的2～3倍;7級(jí):主根腫大，其直徑為莖基部的3倍以上。根據(jù)發(fā)病級(jí)別計(jì)算病情指數(shù)，病情指數(shù)小于10為抗病，病情指數(shù)等于10或以上為感?。?3］。

1.2.3 生理小種的劃分標(biāo)準(zhǔn)分別根據(jù)Williams和Buczacki制定的十字花科根腫病菌鑒別系統(tǒng)，按照病原菌在寄主上的抗感反應(yīng)來確定其生理小種類型［8-9］。在利用Williams鑒別系統(tǒng)進(jìn)行根腫病菌生理小種鑒定時(shí)，如果JQ、LT和WB這3個(gè)寄主對(duì)病原菌表現(xiàn)感病，而BS表現(xiàn)抗病，則該病菌被確定為1號(hào)生理小種;若JQ、BS和LT表現(xiàn)感病，而WB表現(xiàn)抗病，則確定為2號(hào)生理小種;其余依次類推，其抗感反應(yīng)詳見表1［8］。

表1 十字花科根腫病菌Williams鑒別系統(tǒng)的寄主反應(yīng)

在經(jīng)ECD鑒別系統(tǒng)鑒定根腫病菌未知生理小種時(shí)，白菜、甘藍(lán)型油菜和甘藍(lán)這3組寄主材料都有固定的順序，根據(jù)每組寄主分別對(duì)病原菌的抗感反應(yīng)，由寄主所得進(jìn)制值計(jì)算結(jié)果命名生理小種(表2)。命名時(shí)，若寄主對(duì)病原菌表現(xiàn)為抗病，則記為“0”;若表現(xiàn)為感病，則取相對(duì)應(yīng)的十進(jìn)制數(shù)值進(jìn)行累計(jì)計(jì)算。例如，B.rapa組的5個(gè)寄主中僅ECD 05寄主表現(xiàn)感病，B.napus組僅ECD 10寄主表現(xiàn)抗病，B.oleracea組中5個(gè)寄主全部感病，那么經(jīng)查表2可獲得對(duì)應(yīng)二進(jìn)制和十進(jìn)制數(shù)值，二進(jìn)制計(jì)算方法表述為:ECD 0+0+0+0+24/20+21+22+23+ 0/20+21+22+23+24;其十進(jìn)制計(jì)算方法為:ECD 0+0+0+0+16/1+2+4+8+0/1+2+4+8+16。該套寄主群體的總值分別為16、15和31，該小種應(yīng)該命名為ECD16/15/31。

表2 十字花科根腫病菌ECD鑒別系統(tǒng)及寄主對(duì)應(yīng)的二進(jìn)制、十進(jìn)制值

2 結(jié)果與分析

2.1 Williams鑒別系統(tǒng)的鑒定結(jié)果

從表3可知，采自河南新野的大白菜根腫病菌XY－1和XY－2在4份鑒別寄主上的反應(yīng)相同，均表現(xiàn)為感病，說明2份病菌均為4號(hào)生理小種。其中，XY－2的生理小種鑒定結(jié)果如圖1所示。

表3 基于Williams鑒別寄主的河南新野大白菜根腫病菌生理小種鑒定

續(xù)表3基于Williams鑒別寄主的河南新野大白菜根腫病菌生理小種鑒定

圖1 利用Williams鑒別系統(tǒng)對(duì)XY－2的鑒定結(jié)果

2.2 ECD鑒別系統(tǒng)的鑒定結(jié)果

從表4可知，原始菌XY－1和新引菌XY－2在15份寄主上的抗感反應(yīng)明顯不同，原始菌XY－1除了ECD 01、02、03、04和ECD 10表現(xiàn)為抗病外，其余均表現(xiàn)為感病，故生理小種為ECD16/15/31(或ECD0+0+0+0+24/20+21+22+23+0/20+21+ 22+23+24)，而新引菌XY－2除了ECD 02和ECD 04表現(xiàn)為抗病外，其余均表現(xiàn)為感病，其生理小種為ECD21/31/31(或ECD20+0+22+0+24/20+ 21+22+23+24/20+21+22+23+24)，因此，基于ECD鑒別系統(tǒng)鑒定的大白菜根腫病菌生理小種明顯不同，后者較前者致病性更強(qiáng)。其中，XY－2的生理小種鑒定結(jié)果如圖2所示。

表4 基于ECD鑒別寄主的河南新野大白菜根腫病菌生理小種鑒定

圖2 利用ECD鑒別系統(tǒng)對(duì)XY－2的鑒定結(jié)果

2.3 大白菜材料對(duì)2種菌的抗感反應(yīng)

為了進(jìn)一步比較2種根腫病菌的致病性差異，以3份DH系、10份雜種一代(F1)和27份高代自交系大白菜為試材進(jìn)行接種試驗(yàn)，調(diào)查結(jié)果顯示，除2份F1(Y664和Y642)和2份高代自交系(14CR440和14CR345)抗2種病菌外，其余對(duì)XY－1表現(xiàn)為抗病的材料對(duì)XY－2均失去了抗性(表5)。

表5 40份大白菜材料對(duì)2種病菌的抗感反應(yīng)

3 結(jié)論與討論

根腫病是一種非常難防治的病害，被稱為十字花科蔬菜的“癌癥”，其中一個(gè)重要原因是根腫病菌生理小種分化比較多。對(duì)根腫病的研究包括抗病育種一定要對(duì)根腫菌生理小種的分化進(jìn)行鑒定，才能有針對(duì)性地對(duì)不同地區(qū)根腫病進(jìn)行有效防治并選育出適合不同地區(qū)種植的抗性品種［13］。國外研究根腫病菌小種劃分起步較早，部分實(shí)驗(yàn)室甚至通過根腫菌單孢菌系的建立，完成了單孢菌系ECD小種的劃分，并對(duì)生理小種進(jìn)行了分子鑒定，獲得了小種特異的分子標(biāo)記［14-19］。我國根腫病菌生理小種研究尚處于起步階段，缺乏系統(tǒng)的鑒別方法研究，特別是由于ECD系統(tǒng)中鑒別寄主的冬性很強(qiáng)，15個(gè)寄主很難在國內(nèi)大量獲取種子，使得目前還未見采用ECD系統(tǒng)對(duì)國內(nèi)不同地區(qū)根腫病菌進(jìn)行生理小種劃分的系統(tǒng)研究報(bào)道。

國內(nèi)學(xué)者在十字花科根腫病菌生理小種鑒定方面的報(bào)道雖較多，但均是利用Williams鑒別系統(tǒng)鑒定生理小種，本研究首次利用ECD鑒別系統(tǒng)對(duì)來自同一地區(qū)的2份不同大白菜根腫病菌生理小種進(jìn)行了鑒定。從鑒定結(jié)果來看，基于Williams鑒別系統(tǒng)，來自河南省南陽市新野縣城郊鄉(xiāng)呂莊村的2份根腫病菌均為4號(hào)生理小種，表明目前河南新野十字花科蔬菜產(chǎn)區(qū)的大白菜根腫病菌優(yōu)勢(shì)小種為4號(hào)生理小種，這與沈向群等［11］的報(bào)道一致。目前的Willams鑒別系統(tǒng)存在一定的局限性，因?yàn)楦鶕?jù)該鑒別系統(tǒng)的命名原則，能使4個(gè)鑒別寄主均感病的病原菌菌株為4號(hào)生理小種，但隨著病原菌致病力的進(jìn)一步分化，出現(xiàn)強(qiáng)于4號(hào)生理小種菌株時(shí)，Willams鑒別系統(tǒng)將不能滿足鑒定需要;因此，亟需調(diào)整和補(bǔ)充新的鑒別寄主，形成一套適合不同類型根腫病菌的鑒別系統(tǒng)。本研究中，基于ECD鑒別系統(tǒng)鑒定的2份根腫病菌生理小種明顯不同，表明ECD鑒別系統(tǒng)較Williams鑒別系統(tǒng)的結(jié)果更為精確，其中，代表由基質(zhì)新引進(jìn)的根腫菌XY－2比新野當(dāng)?shù)卦季鶻Y－1致病性更強(qiáng)。

現(xiàn)今是生物信息學(xué)的時(shí)代，分子生物學(xué)技術(shù)突飛猛進(jìn)，從分子水平上對(duì)根腫菌進(jìn)行生理小種的劃分將是未來發(fā)展的一大趨勢(shì)，如何盡快科學(xué)地建立起實(shí)用的根腫菌小種鑒別方法，是當(dāng)前迫切需要解決的關(guān)鍵問題。只有這樣才能提高十字花科作物抗病品種選育效率，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)根腫病的持續(xù)控制［20-21］。

近年來，隨著蔬菜集約化育苗的迅猛發(fā)展，基質(zhì)帶菌傳播根腫病的現(xiàn)象在河南新野、安陽、濟(jì)源、原陽等地多處發(fā)生，因此，基質(zhì)帶菌傳播病害問題應(yīng)該引起高度重視。如何指導(dǎo)菜農(nóng)在育苗的過程中選好基質(zhì)以防基質(zhì)帶菌傳播大白菜根腫病，是預(yù)防大白菜根腫病傳播的一個(gè)重要手段，同時(shí)盡快選育出抗根腫病菌不同生理小種的新品種是育種工作者義不容辭的責(zé)任和使命。

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Pathotype Identification of Plasmodiophora brassicae Woron.Collected from Chinese Cabbage in Henan Province

YUAN Yuxiang1，ZHAO Yanyan1，WEI Xiaochun1，YAO Qiuju1，JIANG Wusheng1，WANG Zhiyong1，LI Yang2，XU Qian2，YANG Shuangjuan1，ZHANG Xiaowei1*
(1.Institute of Horticulture，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China; 2.College of Bioscience，Zhengzhou University，Zhengzhou 450000，China)

In order to clarify the pathotype of Plasmodiophora brassicae Woron.on Chinese cabbage in Henan province，two isolates XY-1 and XY-2 collected from Chinese cabbage clubbed roots in Xinye county，representing original and newly introduced pathogens were identified respectively.The identification was carried out by inoculating spore suspension based on the differential sets of Williams system and ECD system.The result showed that both XY-1 and XY-2 were classified into the pathotype 4 of P.brassicae based on the Williams differential system，while based on the ECD differential system，two different pathotypes were classified with XY-1 as pathotype ECD16/15/31 and XY-2 as pathotype ECD21/31/31.The inoculating test showed that the newly introduced pathogen(XY-2)was more virulent in pathogenicity on Chinese cabbage than the original one(XY-1).The above results indicated that the ECD system was more precise than the Williams system due to lager number and more species of differential hosts used for classification，which could further divide the pathotype 4 into different types.

Chinese cabbage;Plasmodiophora brassicae;pathotype;Williams system;ECD system

S436.341.1

A

1004－3268(2017)07－0071－06

2016－12－09

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFD0100204－18);國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS－25－G－27);河南省科技開放合作項(xiàng)目(162106000011);河南省專項(xiàng)資金項(xiàng)目(20157805);河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研發(fā)展基金項(xiàng)目(CYC20167804);河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新專項(xiàng)基金項(xiàng)目(2016ZC25)

原玉香(1970－)，女，河南武陟人，研究員，博士，主要從事蔬菜生物技術(shù)及遺傳育種研究。E－mail:yuxiangyuan126@126.com

*通訊作者:張曉偉(1965－)，男，河南平輿人，研究員，碩士，主要從事蔬菜生物技術(shù)育種研究。E－mail:xiaowei5737@163.com