石薺苧提取物的體外抑菌作用及抗氧化活性研究

黃樹平，文莉，黃程程，王志剛，徐超，李霞輝，舒剛*

(1.眉山職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)技術(shù)系，四川眉山620010;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川成都611130)

石薺苧提取物的體外抑菌作用及抗氧化活性研究

黃樹平1，文莉2，黃程程2，王志剛2，徐超2，李霞輝2，舒剛2*

(1.眉山職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)技術(shù)系，四川眉山620010;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川成都611130)

為研究石薺苧提取物的體外抑菌作用和抗氧化活性，分別用水和無水乙醇提取石薺苧活性成分，并對(duì)乙醇總提取物依次用石油醚、氯仿、正丁醇進(jìn)行分步萃取，得到不同極性的各部分提取物，分別采用管碟法、倍比稀釋法測(cè)定沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌對(duì)提取物的敏感性，同時(shí)采用DPPH法和Fenton法研究不同溶劑萃取的提取物的體外抗氧化活性。結(jié)果表明，石薺苧水提液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌均有抑制作用，最小抑菌濃度(MIC)分別為15.63、125.00、125.00 mg/mL，最小殺菌濃度(MBC)分別為31.25、250.00、250.00 mg/mL;乙醇總提取物對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用，MIC、MBC分別為125.00、250.00 mg/mL。氯仿萃取物、正丁醇萃取物、乙醇總提取物、水提液清除DPPH·的IC50分別為422.5、425.8、413.4、611.4 mg/mL，其中乙醇總提取物清除作用最強(qiáng);氯仿萃取物、正丁醇萃取物、乙醇總提取物、水提液清除·OH的IC50分別為542.2、577.1、925.5、781.2 mg/mL，其中正丁醇萃取物清除能力最強(qiáng)。綜上，石薺苧提取物對(duì)細(xì)菌有抑制作用和抗氧化作用。

石薺苧;提取物;抑菌;抗氧化

Key words:Scabrous mosla;extract;antibacterium;antioxidation

近年來，由于抗生素在畜禽養(yǎng)殖中的濫用導(dǎo)致藥物殘留和耐藥性問題日益嚴(yán)重，天然藥物的研究開發(fā)和利用成為熱點(diǎn)［1］。國(guó)外出現(xiàn)了日益重視藥用植物的趨向，而我國(guó)是世界上植物資源最豐富的國(guó)家之一［2-3］，深入研究藥用植物有效成分的作用，積極開拓植物提取物資源在動(dòng)物保健中的應(yīng)用具有重要意義。

石薺苧(Scabrous mosla)系長(zhǎng)唇形科植物，多年生草本，主要分布在長(zhǎng)江流域以南地區(qū)［4］。臨床上用于治療感冒、中暑、瘧疾、便秘和慢性支氣管炎等［5］。石薺苧提取物可顯著改善流感病毒感染小鼠的病理狀態(tài)，延長(zhǎng)其存活時(shí)間，提高機(jī)體免疫水平［6］。曾曉艷等［7］研究表明，蘇州石薺苧的水提液具有一定的抑菌作用。蘇州石薺苧中黃酮類成分含量豐富，而黃酮類成分具有清除自由基、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、抗衰老等藥理作用［8-10］。

目前，對(duì)于石薺苧在動(dòng)物保健中的應(yīng)用研究較少，為此，提取石薺苧活性成分，探究其提取物的體外抑菌活性及其體外抗氧化活性，以期為石薺苧作為動(dòng)物藥的開發(fā)、應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要儀器

LDZX－50FBS高壓蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)、恒溫培養(yǎng)箱(寧波東南儀器有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市英峪高科儀器廠)、ESJ200－4A電子分析天平(沈陽龍騰電子有限公司)、UV－2000型紫外分光光度計(jì)(尤尼柯儀器有限公司)、SHZMD型循環(huán)水多用真空泵(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試驗(yàn)材料與試劑

石薺苧采自重慶市北碚歇馬鎮(zhèn)，經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)范巧佳副教授鑒定為石薺苧。大腸桿菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、沙門氏菌(C79－13)均購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

肉湯培養(yǎng)液、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、MH培養(yǎng)基均購(gòu)自青島海博生物公司;DPPH、水楊酸、30%H2O2、Fe-SO4、茶多酚、石油醚、正丁醇、無水乙醇、氯仿均為分析純，購(gòu)自成都科龍化工試劑公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 石薺苧不同提取物的制備稱取石薺苧全草粗粉50 g，加4倍體積水煎煮3次，每次15 min，過濾，合并濾液，濃縮至50 mL，得到水提液備用。

稱取石薺苧全草粗粉300 g，置于燒杯中，加入1 800 mL 95%乙醇浸沒藥材，用保鮮膜封口后浸泡12 h，于超聲清洗儀中振蕩提取30 min，冷卻過濾后得到石薺苧乙醇總提取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓回收，得乙醇總浸膏，真空干燥后密閉保存。

將上述提取得到的乙醇總提取物，加水溶解至50 mL，置于250 mL分液漏斗中，依次用石油醚、氯仿、正丁醇各50 mL萃取3次。分別合并萃取液后，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓回收各部分溶劑，依次得到石油醚萃取物、氯仿萃取物、正丁醇萃取物和水部位浸膏，于烘箱中烘干，稱質(zhì)量后密閉保存?zhèn)溆谩Ｌ崛×鞒倘鐖D1所示。

圖1 石薺苧不同提取物制備流程

1.3.2 抑菌作用的測(cè)定在無菌操作的條件下，挑取培養(yǎng)18～24 h純培養(yǎng)菌落4～5個(gè)。接種于3～5 mL水解酪蛋白(MH，0.5麥?zhǔn)蠁挝?肉湯中，37℃培養(yǎng)6～8 h，用無菌生理鹽水或MH肉湯校正菌液濁度，使其與標(biāo)準(zhǔn)比濁管的濁度相同。

體外抑菌試驗(yàn)采用管碟法［11-12］。用無菌棉簽蘸取濃度為107～108cfu/mL的細(xì)菌稀釋液，涂布于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，用無菌鑷子將牛津杯均勻擺放在平板上，靜置10～15 min后滴加石薺苧各提取物，加至液面與牛津杯表面平行即可，分別用相應(yīng)萃取試劑作對(duì)照。將平板37℃培養(yǎng)18～24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小。試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):抑菌圈直徑大于20 mm為高度敏感，10～19 mm為中度敏感，小于10 mm為低度敏感［12］。

1.3.3 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定用MH肉湯將抗菌藥物稀釋成不同質(zhì)量濃度之后，再接種待測(cè)菌，定量測(cè)定提取物的MIC［13-14］。取96孔板，每孔加營(yíng)養(yǎng)肉湯0.1 mL，第1管加供試液0.1 mL，混勻后取0.1 mL于第2管，混勻后吸取0.1 mL于第3管，依次類推到第9管，棄去0.1 mL，第10管改加0.1 mL無菌生理鹽水作為對(duì)照，然后每管內(nèi)加入細(xì)菌懸液0.1 mL混合均勻，37℃培養(yǎng)24 h。結(jié)果判定依據(jù):肉湯清亮透明表示細(xì)菌不生長(zhǎng)，肉湯渾濁表示有細(xì)菌生長(zhǎng)。以能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的提取物的最低劑量為其MIC［15］。

1.3.4 最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定從1.3.2所述無菌生長(zhǎng)的肉湯中吸出0.1 mL滴入平板中，涂布均勻。然后將各平皿放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)24 h，觀察是否有細(xì)菌生長(zhǎng)。結(jié)果判定依據(jù):以無菌生長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的提取物最低劑量為其MBC［15］。

1.3.5 體外抗氧化活性的測(cè)定將制備得到的石薺苧乙醇總提取物、各極性部分浸膏溶液和水提液分別稀釋成5個(gè)質(zhì)量濃度梯度，以同質(zhì)量濃度的茶多酚為陽性對(duì)照，測(cè)定各自的DPPH·和·OH清除率。

1.3.5.1 DPPH法參照彭長(zhǎng)連等［16］的方法，將5個(gè)不同質(zhì)量濃度的石薺苧提取物樣品各2.0 mL置于10 mL試管內(nèi)，加入2.0 mL濃度為1.52×10－4mol/L的DPPH無水乙醇溶液，充分振蕩搖勻，放置30 min。以各個(gè)萃取物對(duì)應(yīng)的溶劑為參比溶液，測(cè)定樣品在517 nm波長(zhǎng)處的吸光度Ai。將2.0 mL不同質(zhì)量濃度的石薺苧乙醇提取物樣品溶液與2.0 mL溶劑混合后，測(cè)定在517 nm波長(zhǎng)處的吸光度Aj。同時(shí)測(cè)定2.0 mL濃度為1.52×10－4mol/L的DPPH溶液與2.0 mL溶劑混合后在517 nm波長(zhǎng)處的吸光度A0。自由基清除率(S0)=［1－(Ai－A0)/Aj］× 100%。以樣品對(duì)應(yīng)的萃取溶劑為參比溶液，以同質(zhì)量濃度的茶多酚為陽性對(duì)照，評(píng)價(jià)樣品的體外抗氧化活性，并用GraphPad Prism 5軟件分析IC50值 (DPPH吸收50%抗氧化劑的質(zhì)量濃度)。

1.3.5.2 Fenton法參照范拴喜等［17］的方法，在10 mL試管中分別依次加入1.0 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液、2.0 mL濃度為1.8 mmol/L的FeSO4溶液、1.5 mL濃度為1.8 mmol/L的水楊酸無水乙醇溶液，混勻，然后向其中加入0.1 mL 0.03%的H2O2，立即混勻，37℃保溫30 min，測(cè)定其在510 nm波長(zhǎng)處的吸光度Aj。以蒸餾水代替0.03%的H2O2，測(cè)定其在510 nm處的吸光度Ai。以蒸餾水代替樣品，測(cè)其在510 nm處的吸光度A0?！H清除率=［A0－(Aj－Ai)］/A0×100%。以同質(zhì)量濃度的茶多酚為陽性對(duì)照，評(píng)價(jià)樣品抗氧化活性，并用GraphPad Prism 5軟件分析IC50值(·OH吸收50%抗氧化劑的質(zhì)量濃度)。

2 結(jié)果與分析

2.1 石薺苧乙醇總提取物及不同極性部分萃取物得率

按照1.3.1提取方法獲得乙醇總提取物(12.56 g)及石油醚萃取物(0.81 g)、正丁醇萃取物(0.59 g)、氯仿萃取物(0.44 g)，石油醚、正丁醇和氯仿各部分提取物得率依次為6.4%、4.7%和3.5%。

2.2 石薺苧水提液和乙醇總提取物的體外抑菌效果

2.2.1 不同提取物抑菌效果由表1可知，石薺苧水提液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌均有一定的抑制效果，抑菌圈大小順序?yàn)榻瘘S色葡萄球菌＞沙門氏菌＞大腸桿菌。乙醇總提取物對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用，對(duì)沙門氏菌和大腸桿菌均無抑制作用。金黃色葡萄球菌對(duì)石薺苧水提液高度敏感，大腸桿菌和沙門氏菌中度敏感;金黃色葡萄球菌對(duì)乙醇總提取物中度敏感。

表1 石薺苧不同提取物對(duì)供試菌的抑菌圈直徑mm

2.2.2 石薺苧水提液的MIC和MBC由表2可知，石薺苧水提液對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為15.63 mg/mL，對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌的MIC均為125.00 mg/mL?？梢?，石薺苧水提液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最好。

由表3可知，石薺苧水提液對(duì)金黃色葡萄球菌的MBC為31.25 mg/mL，對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌的MBC均為250.00 mg/mL?？梢?，石薺苧水提液主要對(duì)細(xì)菌起抑制作用，而對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌的抑制作用較弱。

表2 石薺苧水提液的MIC

表3 石薺苧水提液的MBC

2.2.3 石薺苧乙醇總提取物的MIC和MBC由表4、表5可知，石薺苧乙醇總提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC、MBC分別為125.00、250.00 mg/mL。

表4 石薺苧乙醇總提取物的MIC

表5 石薺苧乙醇總提取物的MBC

2.3 石薺苧不同提取物的體外抗氧化效果

2.3.1 對(duì)DPPH·的清除作用由圖2可知，石薺苧水提液、乙醇總提取物及不同極性部分萃取物對(duì)DPPH·都有一定的清除能力，對(duì)DPPH·的清除率總體上隨著樣品質(zhì)量濃度的增加先增加后趨于平穩(wěn)。氯仿萃取物、正丁醇萃取物、乙醇總提取物、水提液的IC50分別為422.5、425.8、413.4、611.4 mg/ mL，其中乙醇總提取物清除作用最強(qiáng)，但均弱于相同質(zhì)量濃度的茶多酚。當(dāng)質(zhì)量濃度為600、800、1 000 mg/mL時(shí)，氯仿萃取物、正丁醇萃取物和乙醇總提取物清除率差異均不大，但都弱于茶多酚。當(dāng)質(zhì)量濃度為800、1 000 mg/mL時(shí)，石薺苧水提液清除率分別為87.2%、86.8%，清除作用與茶多酚相當(dāng)。

圖2 石薺苧不同提取物對(duì)DPPH·的清除率

2.3.2 對(duì)·OH的清除作用石薺苧水提液、乙醇總提取物及不同極性部分對(duì)·OH清除結(jié)果如圖3所示。石薺苧水提液、乙醇總提取物和不同極性部分萃取物對(duì)·OH都有一定的清除能力。除正丁醇萃取物外，總體上其他極性部分萃取物對(duì)·OH的清除率均隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而增加。氯仿低質(zhì)量濃度(200 mg/mL)萃取物的清除率高于茶多酚，正丁醇萃取物、水提液和乙醇總提取物的清除率均低于茶多酚。氯仿萃取物、正丁醇萃取物、乙醇總提取物、水提液的IC50分別為542.2、577.1、925.5、781.2 mg/mL，其中氯仿萃取物對(duì)·OH的清除作用最強(qiáng)。質(zhì)量濃度為1 000 mg/mL時(shí)，水提液的清除率最高，為74.3%，但清除效果弱于茶多酚;質(zhì)量濃度為200 mg/mL時(shí)，正丁醇萃取物清除率為60.8%，高于茶多酚的清除率;質(zhì)量濃度為400 mg/mL時(shí)，正丁醇萃取物達(dá)最高清除率(70.8%);當(dāng)高于該質(zhì)量濃度時(shí)，清除率又隨質(zhì)量濃度的升高而下降。

圖3 石薺苧不同提取物對(duì)·OH的清除率

3 結(jié)論與討論

3.1 石薺苧提取方法和試劑的選取

在諸多的傳統(tǒng)中藥提取方法中，水煎煮法是最有代表性、最常用的提取方法［18-19］。水煎煮法提取中藥工藝流程步驟簡(jiǎn)單，可在煎煮過程中獲得大部分的有效藥物成分。

為提取植物中與抗氧化有關(guān)的有效成分，選擇適當(dāng)?shù)奶崛∪軇┦种匾?。選擇溶劑的依據(jù)是相似相溶原則，以最大限度地提取所需要的化學(xué)成分，而對(duì)共存雜質(zhì)的溶解度要盡可能?。?0］。本試驗(yàn)中所選取的溶劑的極性表現(xiàn)為水＞乙醇＞正丁醇＞氯仿＞石油醚。水的極性大，可提取藥材中的苷類、有機(jī)酸鹽等。但水提取的選擇性和針對(duì)性均差，容易提取出大量無效成分，影響體外抗氧化能力。乙醇可通過調(diào)節(jié)其含量，有選擇性地提取浸提藥材中的某些有效成分。氯仿可以提取出游離生物堿、有機(jī)酸、黃酮及香豆素等。用上述不同極性的溶劑對(duì)石薺苧進(jìn)行提取時(shí)，各部分提取的物質(zhì)不盡相同，可以探究其各提取部分的作用效果。

3.2 石薺苧提取物體外抑菌效果

本試驗(yàn)選用常見的動(dòng)物源致病菌作為研究對(duì)象，金黃色葡萄球菌是人類和動(dòng)物的一種重要病原菌，有“嗜肉菌”的別稱［21］;大腸桿菌是禽畜最常見的病原菌之一，可引起腹瀉和敗血癥［22］;而沙門氏菌更是一種常見的食源性致病菌，在細(xì)菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首［13］。本試驗(yàn)初步證實(shí)石薺苧的水提液對(duì)這3種細(xì)菌均有一定的抑制作用。其中，金黃色葡萄球菌對(duì)石薺苧的水提液高度敏感，大腸桿菌和沙門氏菌中度敏感;金黃色葡萄球菌對(duì)乙醇總提取物中度敏感。水提液的抑菌作用與劉勝貴等［15］報(bào)道結(jié)果一致。

3.3 石薺苧提取物對(duì)自由基的清除作用

評(píng)價(jià)中草藥抗氧自由基活性的方法主要有化學(xué)發(fā)光法、分光光度法和電子自旋共振法等，DPPH法是較常用的方法之一。DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，其醇溶液呈深紫色，在517 nm處有一吸收峰。當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)中存在自由基清除劑時(shí)，它可以和DPPH·的單電子配對(duì)而使517 nm處的吸收峰漸漸消退。而且，這種顏色變淺的程度與配對(duì)電子數(shù)呈化學(xué)計(jì)量關(guān)系［23］。因此，根據(jù)消退速度和峰值改變程度可以檢測(cè)自由基的清除情況，從而評(píng)價(jià)試驗(yàn)樣品的抗氧化能力。張海濤等［24］以無水乙醇為提取試劑，在石薺苧質(zhì)量濃度為100、10、1 mg/mL時(shí)測(cè)定的DPPH的清除率分別為94.88%、68.50%、44.18%。呂佩惠等［25］研究表明，石薺苧屬植物自由基清除率與各提取物總黃酮含量呈正相關(guān)，其中，水提取物的自由基清除率均大于71%，75%乙醇提取物的自由基清除率大于75%。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，石薺苧水提液、乙醇總提取物及不同極性部分萃取物均有較好的體外抗氧化活性。石薺苧水提液、乙醇總提取物及不同極性部分萃取物對(duì)DPPH·和·OH都有清除作用，特別是氯仿萃取物和正丁醇萃取物對(duì)DPPH·和·OH的清除作用比較明顯，可能與富含多酚、黃酮等有效物質(zhì)密切相關(guān)［9］。綜上，石薺苧水提液和醇提取物在體外對(duì)細(xì)菌有一定的抑制作用和抗氧化作用。

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Study on Antibacterial and Antioxidant Activity of Extract from Scabrous mosla in Vitro

HUANG Shuping1，WEN Li2，HUANG Chengcheng2，WANG Zhigang2，XU Chao2，LI Xiahui2，SHU Gang2*
(1.Department of Agricultural Technology，Meishan Vocational and Technical College，Meishan 620010，China; 2.College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China)

In order to study the antibacterial and antioxidant activity of the extracts from Scabrous mosla，active components of Scabrous mosla were extracted by water and ethyl alcohol，and the ethanol extract were abstracted again with petroleum ether，chloroform，n-butanol successively for different polar extracts.Then susceptibility tests of Salmonella，E.coli and Staphylococcus aureus with pipe plate and doubling dilution method were conducted，and DPPH and Fenton method were used to research the antioxidant activity of extraction in different menstrua.The results showed that water extracts had antibacterial effect on Salmonella，E.coli and Staphylococcus aureus，with the MIC of 15.63，125.00，125.00 mg/mL and the MBC of 31.25，250.00，250.00 mg/mL.Ethyl alcohol extract had antibacterial effect on Staphylococcus aureus with MIC of 125.00 mg/mL and MBC of 250.00 mg/mL.The IC50of extraction of chloroform，n-butanol，ethyl alcohol and water were 422.5，425.8，413.4，611.4 mg/mL，respectively.The IC50of extraction of chloroform，n-butanol，ethyl alcohol and water were 542.2，577.1，925.5，781.2 mg/mL，respectively.In conclusion，the extracts from Scabrous mosla had good antibacterial and antioxidant activities.

S853.75

A

1004－3268(2017)07－0115－06

2017－01－05

四川省科技廳苗子工程項(xiàng)目(035Z1143)

黃樹平(1965－)，男，四川眉山人，副教授，本科，主要從事畜禽養(yǎng)殖研究。E－mail:cndyx2005@163.com

*通訊作者:舒剛(1978－)，男，重慶銅梁人，副教授，博士，主要從事中藥藥理與藥劑研究。E－mail:dyysg2005@sicau.edu.cn