土壤中添加外源酚酸類物質(zhì)對(duì)地黃生長的影響

李 娟，聶 銘，李 磊，陳 楓

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

土壤中添加外源酚酸類物質(zhì)對(duì)地黃生長的影響

李 娟，聶 銘，李 磊，陳 楓

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

為了探索對(duì)羥基苯甲酸、香豆酸、阿魏酸、丁香酸、香草酸等一元酚酸類成分在地黃連作障礙中的作用，采用盆栽試驗(yàn)方法，以頭茬和重茬地黃為對(duì)照，對(duì)受試地黃進(jìn)行外源添加酚酸試驗(yàn)，對(duì)地黃的成活率、葉鮮重、根體積、根鮮重、光合色素含量、根系活力、細(xì)胞滲透性等方面的生長和生理指標(biāo)進(jìn)行比較研究。結(jié)果表明，5種單體酚酸及其混合物對(duì)地黃均有一定程度的毒害作用，其中，酚酸混合物對(duì)地黃成活的抑制情況與重茬地黃相似。酚酸處理對(duì)地黃地下部分生長的抑制作用要大于對(duì)地上部分生長的影響，各單體及組合酚酸處理對(duì)地黃葉片的光合色素含量影響不大，但均使地黃葉片的細(xì)胞膜透性顯著增加，根系活力下降。據(jù)此推測，酚酸類物質(zhì)對(duì)地黃具有較強(qiáng)的化感作用，是地黃的主要化感自毒物質(zhì)。

地黃； 酚酸類物質(zhì)； 化感作用； 自毒作用； 連作障礙

懷地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)是我國著名的“四大懷藥”之一，以干燥塊根入藥，一直被視為藥材中的上品?，F(xiàn)代研究認(rèn)為，地黃具有降血糖、保肝、止血、利尿、抗炎、抗真菌等作用。其塊根及其加工品分別作為鮮地黃、生地黃和熟地黃入藥，為中國傳統(tǒng)的大宗道地中藥材。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前在藥品市場中有近1/4的中成藥中含有地黃。

地黃是已知塊根類藥材中連作障礙最嚴(yán)重的藥用植物，隨著市場需求量的增加，連作障礙問題已經(jīng)嚴(yán)重影響了懷地黃產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。針對(duì)地黃的連作障礙問題，近十余年，學(xué)者們從植物生理學(xué)、化學(xué)生態(tài)學(xué)、植物功能基因組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及微生物宏組學(xué)等多個(gè)角度圍繞連作地黃[1-7]及其根際環(huán)境[5-6,8-12]和消減技術(shù)[13-15]進(jìn)行了大量的研究。研究結(jié)果表明，化感自毒作用是地黃連作障礙的主要原因，土壤中的酚酸類物質(zhì)及其相互作用，改變了地黃根際的微生態(tài)環(huán)境，從而直接或間接影響地黃塊根的各種生理生化性狀。化感物質(zhì)是引起地黃連作障礙的主要因素之一。

在引起作物連作障礙的眾多化感物質(zhì)中，酚酸類成分是目前研究最多、活性較強(qiáng)的一類化感物質(zhì)。大量試驗(yàn)表明：酚酸類物質(zhì)可能通過影響植物的膜系統(tǒng)、光合作用、酶活性、土壤微生物活性以及內(nèi)源激素對(duì)植物生長產(chǎn)生抑制作用。本試驗(yàn)以連作地黃土壤中檢測到的香草酸、對(duì)羥基苯甲酸、丁香酸、香豆酸和阿魏酸等5種一元酚酸為對(duì)象，以頭茬、重茬地黃為對(duì)照，用5種單體酚酸及其混合物處理地黃，通過檢測地黃的成活率、葉鮮重、根鮮重、光合色素含量、葉片相對(duì)電導(dǎo)率、根系活力等生長和生理指標(biāo)，探析酚酸類成分在地黃連作過程中的作用，驗(yàn)證一元酚酸類物質(zhì)對(duì)地黃生長的“毒害”作用，為解決地黃連作障礙提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在河南省鄭州市河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)進(jìn)行。試驗(yàn)用頭茬土壤為未種植過地黃的土壤，重茬土壤為前一年種植過地黃的土壤，均為砂壤土。供試地黃品種為溫85-5。塊根繁殖材料蘆頭(種栽)由溫縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。阿魏酸、香豆酸和對(duì)羥基苯甲酸購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，香草酸、丁香酸購自美國ACROS公司。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采取盆栽方式，設(shè)單體酚酸及混合酚酸共10個(gè)處理：對(duì)羥基苯甲酸(A)、香豆酸(B)、丁香酸(C)、阿魏酸(D)、香草酸(E)、對(duì)羥基苯甲酸和香豆酸混合(F)、對(duì)羥基苯甲酸和丁香酸混合(G)、香豆酸和丁香酸混合(H)、對(duì)羥基苯甲酸和香豆酸和丁香酸混合(I)、5種酸混合(J)，每組處理10盆重復(fù)。根據(jù)前期重茬土壤測試結(jié)果[5]，對(duì)羥基苯甲酸、香豆酸、丁香酸、阿魏酸、香草酸添加后在土壤中的濃度分別為1.790 0、0.020 0、0.003 3、0.033 3、0.013 3 μg·g-1，各處理添加的溶液體積均為200 mL。另設(shè)頭茬(FC)、重茬(CC)各10盆作為對(duì)照。

盆栽采用常規(guī)田間管理，出苗10 d后定苗，每盆保留2棵地黃。出苗90 d后測定各處理組地黃成活率、葉片數(shù)、冠幅面積、葉片鮮重、光合色素含量、葉細(xì)胞膜滲透性、根體積(排水法)、根鮮重、根活性(TTC法)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)采集的數(shù)據(jù)通過Excel 2010和IBM SPSS 19.0軟件進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源添加酚酸類成分對(duì)地黃成活率的影響

由圖1可知，與頭茬地黃相比，重茬組地黃的成活率大幅降低。除丁香酸組(C)外，各處理地黃的成活率均小于頭茬地黃，單一酚酸處理組的地黃成活率介于頭茬與重茬之間，普遍高于混合酚酸組處理，混合酚酸處理的地黃成活率均低于重茬組。由此可知，單一酚酸處理對(duì)地黃成活率的影響較小，而混合酚酸可大幅降低地黃的成活率，如丁香酸單一處理對(duì)地黃成活率基本無不良影響，但當(dāng)它與其他酚酸共同處理時(shí)則顯著抑制地黃的成活率。

2.2 外源添加酚酸類成分對(duì)地黃生長的影響

由圖2可知，重茬組地黃葉片鮮重低于頭茬組地黃。除丁香酸(C)處理的地黃葉片鮮重接近于重茬組之外，其他各處理組的葉片鮮重均接近甚至高于頭茬組，其中，對(duì)羥基苯甲酸(A)、阿魏酸(D)、香豆酸和丁香酸(H)組葉片鮮重大于頭茬地黃。由此可知，除丁香酸(C)處理外，其他單體酚酸及酚酸組合處理對(duì)地黃地上部分生長的抑制作用不強(qiáng)。

圖2 各處理對(duì)地黃地上部生長的影響

由圖3可知，在根體積與根鮮重方面，頭茬與重茬差異明顯，頭茬的平均根鮮重為31 g，平均根體積為32 cm3，而重茬地黃的平均根鮮重僅為7.7 g，平均根體積12 cm3，僅為頭茬的24.8%和37.5%。單體酚酸與混酸處理對(duì)地黃根鮮重和根體積的影響較大，對(duì)羥基苯甲酸(A)、阿魏酸(D)、香豆酸和丁香酸混合(H)，以及5種酸混合(J)的根體積與根鮮重均高于頭茬的水平，而香豆酸(B)、丁香酸(C)、香草酸(E)、對(duì)羥基苯甲酸和香豆酸混合(F)、對(duì)羥基苯甲酸和丁香酸混合(G)、對(duì)羥基苯甲酸和香豆酸和丁香酸三種酸混合(I)的根鮮重與根體積則介于頭茬與重茬之間，其中，以丁香酸(C)處理對(duì)地黃地下部分的生長影響最大，其根體積和根鮮重分別為頭茬的35.3%和32.6%。

2.3 外源添加酚酸類成分對(duì)地黃葉片光合色素含量的影響

由表1可知，與頭茬地黃中所含光合色素含量相比，重茬組地黃不論是葉綠素a、b還是胡蘿卜素的含量均大幅減少，分別為頭茬地黃的58.1%，63.0%，59.9%。單體酚酸處理的各組中，除阿魏酸(D)組之外，各組的光合色素含量均比頭茬有所降低，但遠(yuǎn)未達(dá)到重茬水平。各混合酚酸對(duì)葉綠素含量的影響除了香豆酸和丁香酸混合組(H)處理的地黃光合色素含量顯著降低，對(duì)羥基苯甲酸和香豆酸混合(F)處理對(duì)地黃光合色素含量有促進(jìn)作用之外，其余各組如對(duì)羥基苯甲酸和丁香酸混合(G)、對(duì)羥基苯甲酸和香豆酸和丁香酸混合(I)、五種酸混合組(J)均對(duì)光合色素含量影響不大。

圖3 各處理對(duì)地黃地下部生長的影響

mg·g-1

注：FC，頭茬；CC，重茬；A，對(duì)羥基苯甲酸；B，香豆酸；C，丁香酸；D，阿魏酸；E，香草酸；F，對(duì)羥基苯甲酸和香豆酸混合；G，對(duì)羥基苯甲酸和丁香酸混合；H，香豆酸和丁香酸混合；I，對(duì)羥基苯甲酸和香豆酸和丁香酸三種酸混合；J，5種酸混合。表2同。

2.4 外源添加酚酸類成分對(duì)地黃細(xì)胞膜透性及根系活力的影響

由表2可知，頭茬地黃葉片的相對(duì)電導(dǎo)率最小，僅為0.12%，重茬地黃葉片的相對(duì)電導(dǎo)率是頭茬的5倍，各處理的地黃葉片的相對(duì)電導(dǎo)率均高于重茬，其中，以丁香酸(C)處理地黃葉片的相對(duì)電導(dǎo)率最大。相對(duì)電導(dǎo)率是衡量細(xì)胞膜透性的重要指標(biāo)，其值越大，表示電解質(zhì)的滲漏量越多，細(xì)胞膜受害程度越重。由此可知，酚酸處理造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損，增加了地黃的細(xì)胞滲透性，改變了葉片細(xì)胞滲透壓，不利于地黃正常的生長發(fā)育。

頭茬和重茬組地黃的根系活力分別為0.70和0.44 ng·g-1·h-1，重茬組根系活力低于頭茬組。

表2 外源添加酚酸對(duì)地黃細(xì)胞膜透性和 根系活力的影響

各處理均降低地黃的根系活力，其中，以香草酸(E)組根系活力最弱，僅為0.23 ng·g-1·h-1；香豆酸(B)、香豆酸和丁香酸混合(H)及對(duì)羥基苯甲酸和香豆酸和丁香酸混合(I)組次之，均低于重茬組，其他處理組的根系活力均介于頭茬和重茬組之間。說明酚酸類物質(zhì)可抑制地黃的根系活力，造成根系吸收不暢，源動(dòng)力不足。

3 討論

植物根系所處的土壤環(huán)境是一個(gè)非常復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，其中的化學(xué)物質(zhì)變化范圍廣且影響因素眾多。因此，在田間情況下研究化感物質(zhì)的作用特性難度很大。酚酸類物質(zhì)是化感物質(zhì)研究中的熱點(diǎn)，也是存在爭議最大的一類成分，很多針對(duì)酚酸類成分化感作用的研究均是在室內(nèi)利用種子發(fā)芽試驗(yàn)進(jìn)行生物測試得到結(jié)果，難以反映土壤中的復(fù)雜狀況。也有人認(rèn)為，酚酸類成分在進(jìn)入土壤之后可能發(fā)生降解，且其存在于很多植物的根系分泌物中，不一定是造成連作障礙的主要化感物質(zhì)。在地黃的連作障礙研究過程中，陳楓等[16]發(fā)現(xiàn)，對(duì)地黃的根際土壤水提液分部位進(jìn)行化感自毒作用驗(yàn)證時(shí)，自毒作用較強(qiáng)的部位的確存在著數(shù)量較多、含量較大的一元酚酸類成分。Zhang等[12]的研究結(jié)果也表明，在地黃的根際土壤中，酚酸類物質(zhì)的確存在著典型的距離效應(yīng)，酚酸類物質(zhì)在土壤中的含量與地黃根際距離呈顯著相關(guān)。本試驗(yàn)的研究結(jié)果表明，外源添加酚酸類化合物可顯著降低地黃的成活率，改變地黃的細(xì)胞膜滲透性，降低其根系活力，抑制地黃地下塊根的生長，而對(duì)地上部分葉鮮重的影響較輕，這些與地黃在連作過程中的表現(xiàn)十分吻合，即早期地上部分生長正常，但中期出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象，即使存活也無法形成商品根。在研究中還發(fā)現(xiàn)，對(duì)地下部分生長影響最大的3種單體酚酸——香豆酸、香草酸和丁香酸，恰恰是在地黃根際土壤提取物分部位檢測中化感作用最強(qiáng)的正丁醇和水部位出現(xiàn)的幾種酚酸類成分[16]。這些都說明酚酸類物質(zhì)在地黃的連作障礙形成過程中起著重要作用，是重要的化感自毒物質(zhì)。另外，對(duì)光合色素的含量測定結(jié)果表明，重茬地黃的光合色素有較大幅度的降低，但本試驗(yàn)中僅部分酚酸單體及混酸處理能使光合色素含量少量降低，遠(yuǎn)達(dá)不到重茬水平，這反映出，連作對(duì)地黃光合色素的影響可能來自于其他化感物質(zhì)的作用。

本試驗(yàn)中所涉及的5種一元酚酸類物質(zhì)都屬于苯丙素類化合物中的苯丙酸類，雖然5種酚酸化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，但每種酚酸類物質(zhì)的物理、化學(xué)性質(zhì)有所不同，對(duì)受體地黃根系細(xì)胞膜不同作用位點(diǎn)的親和力也可能存在較大差異。Streibig等[17]對(duì)酚酸類物質(zhì)化感作用的研究結(jié)果表明，不同的酚酸類物質(zhì)對(duì)受體植物的影響程度是不同的。由于5種酚酸的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)不同，對(duì)地黃根系細(xì)胞膜的作用力也隨之有所區(qū)別，具有更強(qiáng)競爭力的酚酸往往能夠捕獲不止一個(gè)的作用位點(diǎn)(或至少干涉較近的其他位點(diǎn))。當(dāng)在地黃的根系細(xì)胞膜周圍聚集了比分子總數(shù)更多的開放位點(diǎn)時(shí)，酚酸物質(zhì)間的作用是增效的(在物質(zhì)的濃度較低時(shí)出現(xiàn)的情況)；反之，若分子總數(shù)比細(xì)胞膜的位點(diǎn)更多時(shí)，這時(shí)具有更強(qiáng)競爭力的酚酸將能捕獲到更多的作用位點(diǎn)，而競爭力較弱的酚酸捕獲到的位點(diǎn)就少，由于2種酚酸化合物的作用效果沒有得到充分的表達(dá)(在物質(zhì)的濃度較高時(shí)出現(xiàn)的情況)，就會(huì)引起“拮抗作用”。這就解釋了為什么不同的單體酚酸之間以及酚酸混合物處理之間的作用方式及效果存在著較大的差異，而其中的原理和構(gòu)效關(guān)系，還需要進(jìn)一步研究探索。

[1] 范華敏, 李明杰, 鄭紅艷, 等. 地黃中響應(yīng)連作基因的時(shí)空表達(dá)與分析[J]. 中國中藥雜志, 2012, 37(20):3029-3035.

[2] 尹文佳, 杜家方, 李娟,等. 連作對(duì)地黃生長的障礙效應(yīng)及機(jī)制研究[J]. 中國中藥雜志, 2009, 34(1):18-21.

[3] 牛苗苗, 李娟, 杜家方, 等. 地黃源庫關(guān)系的變化及其與連作障礙的關(guān)系[J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2011, 30(2):248-254.

[4] 吳林坤, 陳軍, 吳紅淼, 等. 地黃連作脅迫響應(yīng)機(jī)制的塊根蛋白質(zhì)組學(xué)分析[J]. 作物學(xué)報(bào), 2016, 42(2):243-254.

[5] 杜家方, 尹文佳, 張重義, 等. 不同間隔年限地黃土壤的自毒作用和酚酸類物質(zhì)含量[J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2009, 28(3):445-450.

[6] 李振方, 齊曉輝, 李奇松, 等. 地黃自毒物質(zhì)提取及其生物指標(biāo)測定[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2010, 30(10):2576-2584.

[7] 李明杰, 馮法節(jié), 張寶, 等.多元組學(xué)背景下地黃連作障礙形成的分子機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中國中藥雜志, 2017, 43(3): 413-419.

[8] 吳林坤, 黃偉民, 王娟英, 等. 不同連作年限野生地黃根際土壤微生物群落多樣性分析[J]. 作物學(xué)報(bào), 2015, 41(2): 308-317.

[9] YANG Y H, LI M J. DNA methylation in Rehmannia glutinosa roots suffering from replanting disease[J]. International Journal of Agriculture & Biology, 2015, 18(1): 160-167.

[10] ZHANG Z Y, LIN W X, YANG Y H, et al.Effects of consecutively monoculturedRehmanniaglutinosaL. on diversity of fungal community in rhizospheric soil[J].Agricultural Sciences in China, 2011, 10(9): 1374-1384.

[11] 張重義, 陳慧, 楊艷會(huì), 等. 連作對(duì)地黃根際土壤細(xì)菌群落多樣性的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2010, 21(11):2843-2848.

[12] ZHANG B, LI X Z, WANG F Q, et al. Assaying the potential autotoxins and microbial community associated withRehmanniaglutinosa, replant problems based on its ‘a(chǎn)utotoxic circle’[J]. Plant & Soil, 2016, 407(1/2): 307-322.

[13] 李娟, 黃劍, 張重義, 等. 地黃化感自毒作用消減技術(shù)研究[J]. 中國中藥雜志, 2011, 36(4):405-408.

[14] 茹瑞紅, 李烜楨, 黃曉書, 等. 食用菌菌渣緩解地黃連作障礙的研究[J]. 中國中藥雜志, 2014, 39(16):3036-3041.

[15] 李娟, 申軍艷, 陳楓, 等. 2種乙烯抑制劑對(duì)連作地黃生長的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 43(10):332-335.

[16] 陳楓, 李娟, 聶銘, 等. 地黃根際土壤不同萃取部位的化感效應(yīng)研究[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 57(5):693-698.

[17] STREIBIG J C, OLOFSDOTTER M. Joint action of phenolic acid mixtures and its significance in allelopathy research[J]. Physiologia Plantarom, 2002, 114(3): 422-428.

(責(zé)任編輯：高 峻)

2017-03-16

國家自然科學(xué)基金(81373910，81102756)；河南省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃(2010B180012)

李 娟(1980—)，女，河南信陽人，博士，副教授，主要從事藥用植物栽培學(xué)與化學(xué)生態(tài)學(xué)方面的研究工作，E-mail:juanli2003@126.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170625

S567.23+4

A

0528-9017(2017)06-0986-04

文獻(xiàn)著錄格式：李娟，聶銘，李磊，等. 土壤中添加外源酚酸類物質(zhì)對(duì)地黃生長的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(6)：986-989.