體外抗鴨坦布蘇病毒的藥物篩選試驗

陸新浩，劉 鴻，任祖伊

(浙江省余姚禽畜病防治研究所,浙江余姚 315400)

體外抗鴨坦布蘇病毒的藥物篩選試驗

陸新浩，劉 鴻，任祖伊

(浙江省余姚禽畜病防治研究所,浙江余姚 315400)

為了探討抗病毒藥物對鴨坦布蘇病毒的作用，選用5種常用的抗病毒藥物(金剛乙胺、脫氧若卡素鈉、病毒靈、利巴韋林、阿昔洛韋)進(jìn)行體外抗鴨坦布蘇病毒的藥物篩選試驗。結(jié)果表明，利巴韋林藥物濃度為0.156 mg/mL～0.625 mg/mL時，在DF-1細(xì)胞中能抑制鴨坦布蘇病毒的增殖、利巴韋林在體外對鴨坦布蘇病毒具有抗病毒作用；而阿昔洛韋、金剛乙胺、脫氧若卡素鈉、病毒靈等4種藥物對鴨坦布蘇病毒無明顯抗病毒作用。

鴨坦布蘇病毒；藥物篩選；鴨

鴨坦布蘇病毒是2010年4月在我國最早報道的一種新型病毒[1]，主要引起種(蛋)鴨產(chǎn)蛋性能急劇下降，一般產(chǎn)蛋率可由產(chǎn)蛋高峰的90%～95%迅速下降到5%～10%，甚至停產(chǎn)，可給養(yǎng)鴨業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[2]。病原學(xué)研究表明，該病毒為單股正鏈RNA病毒，系有囊膜的球形病毒粒子，大小約45～50nm，屬于黃病毒科黃病毒屬的一種新型病毒[3-4]。自2010年4月開始發(fā)現(xiàn)以后，半年內(nèi)該病毒迅速傳遍我國主要養(yǎng)鴨地區(qū)，鴨場一旦感染，鴨群幾乎100%發(fā)病。該病毒傳播極其迅速、感染力強(qiáng)，目前對其傳播媒介、傳播途徑等流行病學(xué)情況尚未完全了解，也未見有效的商品化疫苗與抗體可防控該病[5-6]。

目前，因尚無有效防控鴨坦布蘇病毒的高免血清和卵黃抗體，在治療該病時，養(yǎng)殖戶多使用廣譜抗病毒藥與復(fù)方抗病毒中草藥進(jìn)行治療，同時使用抗生素防控細(xì)菌繼發(fā)感染。為研究抗病毒藥物對鴨坦布蘇病毒是否具有有效的防控作用，筆者進(jìn)行了體外抗鴨坦布蘇病毒的藥物篩選試驗。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 鴨坦布蘇病毒DF-1細(xì)胞適應(yīng)株C01株[6]，DF-1細(xì)胞由浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)部動物疫病病原學(xué)與免疫控制重點(diǎn)開放實驗室提供。DMEM培養(yǎng)液購自Invitrogen公司；胎牛血清購自PAA 公司；FITC 標(biāo)記的羊抗雞IgG 購自KPL 公司；脫脂奶購自上海光明乳業(yè)；分析純甲醇液體和丙酮液體購自醫(yī)藥公司。DF-1細(xì)胞的生長液為加10%胎牛血清的DMEM，維持液為2%胎牛血清DMEM。

1.2 供試藥物 利巴韋林注射液購自江蘇某生物股份有限公司；阿昔洛韋片購自浙江某藥業(yè)股份有限公司；金剛乙胺、脫氧若卡素鈉、病毒靈(嗎啉胍)由浙江義烏某動物藥業(yè)有限公司提供。

1.3 試驗方法

1.3.1 鴨坦布蘇病毒TCID50測定 將生長旺盛的DF-1細(xì)胞消化后接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待DF-1細(xì)胞長成單層后，棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次后加入用細(xì)胞維持液10倍系列稀釋的病毒液，其稀釋度分別為10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6；0.1 mL/孔，4孔/每個稀釋度，置培養(yǎng)箱中孵育1 h后棄病毒液，用PBS清洗2次后加入維持液。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4d后觀察細(xì)胞病變，記錄細(xì)胞病變數(shù)。按Reed-Muench方法計算病毒TCID50。

1.3.2 藥物的細(xì)胞毒性測定 待DF-1細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上長成單層后，棄培養(yǎng)液后，用PBS洗滌2次，將藥物先用PBS稀釋為5mg/mL，再用細(xì)胞維持液倍比稀釋至21～25，將混有藥物的維持液加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，0.1 mL/孔，每個稀釋度2孔，同時設(shè)無藥物對照孔。每d觀察2次，連續(xù)觀察4 d。記錄細(xì)胞病變情況，判定對細(xì)胞無毒性作用的藥物濃度。

1.3.3 藥物體外抗鴨坦布蘇病毒試驗 待DF-1細(xì)胞在96孔板上長成單層后，棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次后，每孔接種100 TCID50的鴨坦布蘇病毒液0.1 mL，37 ℃吸附1 h后棄病毒液，用PBS液洗滌2次，加入從最大無毒濃度開始用細(xì)胞維持液倍比稀釋的藥物，每種藥物稀釋為20、21、22、23、24、256種濃度梯度，0.1 mL/孔，每種稀釋度重復(fù)4孔。同時設(shè)立正常細(xì)胞對照，100 TCID50病毒接種細(xì)胞對照。將培養(yǎng)板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每d觀察細(xì)胞病變，連續(xù)觀察5 d，記錄細(xì)胞病變情況。判定藥物對病毒的作用。

1.3.4 間接免疫熒光抗體檢測試驗 按照1.3.3操作步驟獲得的病毒感染細(xì)胞，加入含不同濃度利巴韋林的維持培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,傾棄96孔板中培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，每孔加甲醇丙酮等體積混合液150 μL，置-20 ℃冰箱固定20min。傾棄固定液，風(fēng)機(jī)風(fēng)干， 每孔用200 μL 5%脫脂奶37℃搖床封閉1 h；PBS清洗2次后，加用5%脫脂奶1∶200稀釋雞血清，37℃搖床反應(yīng)2 h；PBS清洗3次，每孔加5%脫脂奶1∶200稀釋的FITC 羊抗雞IgG 100 μL，37℃搖床反應(yīng)1 h；PBS清洗5次，加50 μL PBS，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 TCID50測定結(jié)果 按Reed-Muench方法計算鴨坦布蘇病毒C01株第7代的TCID50為10-3.3/0.1 mL。

2.2 藥物的細(xì)胞毒性測定結(jié)果 詳見表1。

表1 5種藥物的細(xì)胞毒性測定

注：細(xì)胞75%以上病變記為+++， 50%病變記為++，25%病變記為+，無病變記為-。

由表1可見，將不同稀釋度的藥物加于細(xì)胞維持培養(yǎng)液中與細(xì)胞一起培養(yǎng)，連續(xù)觀察4 d，記錄細(xì)胞病變情況，5種藥物的最大無毒濃度分別為：阿昔洛韋0.625 mg/mL，利巴韋林0.625 mg/mL，病毒靈0.625 mg/mL，脫氧卡若素鈉0.312 mg/mL，金剛乙胺0.078 mg/mL。

2.3 藥物體外抗病毒試驗結(jié)果 詳見表2。

表2 體外抗病毒試驗

注：細(xì)胞病變記為++，無病變記為-。

由表2可見，鴨坦布蘇病毒感染DF-1細(xì)胞后加入含不同濃度抗病毒藥的維持培養(yǎng)基，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每d觀察細(xì)胞病變情況，5 d后判斷結(jié)果。利巴韋林濃度為0.625 mg/mL～0.156 mg/mL時，細(xì)胞未出現(xiàn)病變，與未接毒的細(xì)胞對照基本一致(詳見圖1)，加有阿昔洛韋、金剛乙胺、脫氧若卡素鈉、病毒靈的細(xì)胞與病毒對照則無明顯差異，細(xì)胞圓縮、融合、脫落。結(jié)果表明，利巴韋林濃度為0.156 mg/mL～0.625 mg/mL時，在DF-1細(xì)胞上對鴨坦布蘇病毒具抑制病毒生長的作用，而阿昔洛韋、金剛乙胺、脫氧若卡素鈉、病毒靈對鴨坦布蘇病毒無明顯抗病毒作用。

2.4 間接免疫熒光抗體檢測試驗結(jié)果 詳見圖2。

圖1 1利巴韋林處理的感染細(xì)胞，2病毒感染的細(xì)胞，3 未感染的正常細(xì)胞

A：病毒感染后用正常維持培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后；B：病毒感染后用濃度為0.156 mg/mL利巴韋林的維持培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后；C：未感染的正常細(xì)胞。圖2 間接免疫熒光檢測利巴韋林處理的細(xì)胞

由圖2可見，將含不同濃度利巴韋林的維持液與鴨坦布蘇病毒感染的DF-1細(xì)胞一起培養(yǎng)48 h后進(jìn)行間接熒光抗體檢測，在熒光顯微鏡下可見鴨坦布蘇病毒感染的細(xì)胞發(fā)出很強(qiáng)的綠色熒光，而在不同濃度利巴韋林培養(yǎng)基中的感染細(xì)胞和正常對照細(xì)胞基本未見熒光，其中利巴韋林的最小有效濃度為0.156 mg/mL。結(jié)果表明，利巴韋林能有效抑制鴨坦布蘇病毒在細(xì)胞中增殖。

4 小結(jié)與討論

鴨坦布蘇病毒是引起種(蛋)鴨產(chǎn)蛋量迅速下降的一種新型病毒，對該病目前尚無有效的防控措施。為探討5種常用抗病毒藥物對鴨坦布蘇病毒的防控作用，筆者通過體外抗病毒試驗，研究了金剛乙胺、脫氧若卡素鈉、病毒靈、利巴韋林、阿昔洛韋等5種藥物對鴨坦布蘇病毒的抗病毒作用。結(jié)果表明，利巴韋林能有效抑制鴨坦布蘇病毒引起的細(xì)胞病變。為了進(jìn)一步驗證結(jié)果的可靠性，筆者進(jìn)行了間接免疫熒光檢測，在熒光顯微鏡下明顯可見鴨坦布蘇病毒感染的細(xì)胞中含有大量病毒抗原蛋白，而與利巴韋林相互作用的細(xì)胞中病毒抗原蛋白表達(dá)量很小，利巴韋林確能有效抑制鴨坦布蘇病毒在細(xì)胞中增殖。

利巴韋林(Ribavirin)又名病毒唑，是一種廣譜抗病毒藥物，對多種DNA和RNA病毒均有抗病毒作用，通過與RNA聚合酶作用而抑制病毒復(fù)制[7]。曾有體外研究報道表明，利巴韋林對黃病毒屬的日本乙型腦炎病毒、登革熱病毒、黃熱病毒及西尼羅病毒具有良好的抗病毒作用[8-10]。也有動物實驗研究表明，利巴韋林對沙粒病毒和裂谷熱病毒感染的小鼠、裂谷熱病毒感染的恒河猴、漢坦病毒感染的乳鼠體內(nèi)具有高度的抗病毒作用[11]。利巴韋林在體內(nèi)對鴨坦布蘇病毒是否具有抗病毒活性還需作進(jìn)一步的體內(nèi)抗病毒研究試驗。

另外，筆者的試驗結(jié)果表明病毒靈、金剛乙胺、脫氧若卡素鈉、阿昔洛韋等4種藥物對鴨坦布蘇病毒沒有抗病毒活性。

據(jù)此，筆者建議廣大養(yǎng)殖戶及臨床獸醫(yī)在治療鴨坦布蘇病毒病時，不宜使用病毒靈、金剛乙胺、脫氧若卡素鈉、阿昔洛韋這類抗病毒藥物進(jìn)行治療，以免造成抗病毒藥物的濫用而又達(dá)不到治療效果。

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農(nóng)業(yè)部要求大力推進(jìn)畜牧業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革，推動畜牧業(yè)轉(zhuǎn)型升級，加快建設(shè)現(xiàn)代畜牧業(yè)

最近，2017年全國農(nóng)牧漁業(yè)大縣局長輪訓(xùn)第2期培訓(xùn)班，生豬調(diào)出大縣畜牧局長班在北京舉辦。農(nóng)業(yè)部領(lǐng)導(dǎo)在開班式上強(qiáng)調(diào)，要深刻認(rèn)識農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革的重大意義，準(zhǔn)確把握農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革目標(biāo)任務(wù)，以大力推進(jìn)畜牧業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革為主線，以綠色發(fā)展為導(dǎo)向，以結(jié)構(gòu)調(diào)整為重點(diǎn)，培育發(fā)展新動能，協(xié)調(diào)推進(jìn)保供給、保安全、保生態(tài)各項工作，推動畜牧業(yè)轉(zhuǎn)型升級，加快建設(shè)現(xiàn)代畜牧業(yè)。

農(nóng)業(yè)部領(lǐng)導(dǎo)指出，2017年是全面落實“十三五”規(guī)劃的關(guān)鍵一年，也是推進(jìn)畜牧業(yè)發(fā)展結(jié)構(gòu)調(diào)整、轉(zhuǎn)型升級的關(guān)鍵一年。推進(jìn)畜牧業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革，要突出抓好九方面工作：一是加大糧改飼試點(diǎn)力度，調(diào)整優(yōu)化生豬區(qū)域布局，大力發(fā)展現(xiàn)代草牧業(yè)，做大做強(qiáng)優(yōu)勢特色畜牧業(yè)，推進(jìn)結(jié)構(gòu)調(diào)整。二是抓好畜禽糞污處理和資源化利用，深入開展畜牧業(yè)綠色發(fā)展示范縣創(chuàng)建，積極推廣種養(yǎng)結(jié)合循環(huán)發(fā)展模式，持續(xù)加強(qiáng)草原生態(tài)保護(hù)建設(shè)，推進(jìn)綠色發(fā)展。三是進(jìn)一步研究落實草原改革任務(wù)，健全完善以綠色生態(tài)為導(dǎo)向的政策支持體系，加強(qiáng)畜牧業(yè)法制建設(shè)，加強(qiáng)政風(fēng)行風(fēng)建設(shè)，推進(jìn)支撐保障體系建設(shè)。四是大力發(fā)展畜禽標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)模養(yǎng)殖，加快奶業(yè)振興發(fā)展，促進(jìn)飼料工業(yè)轉(zhuǎn)型發(fā)展，建設(shè)現(xiàn)代畜禽牧草種業(yè)，強(qiáng)化產(chǎn)業(yè)科技創(chuàng)新推廣，推動一二三產(chǎn)融合發(fā)展，提升產(chǎn)業(yè)競爭力。五是強(qiáng)化飼料質(zhì)量安全監(jiān)管，加強(qiáng)飼料質(zhì)量安全風(fēng)險監(jiān)測，嚴(yán)格生鮮乳質(zhì)量安全監(jiān)管，全面推進(jìn)安全生產(chǎn)，提升質(zhì)量安全水平。六是加強(qiáng)產(chǎn)業(yè)監(jiān)測預(yù)警，建立健全草原管理數(shù)據(jù)體系，加強(qiáng)行業(yè)數(shù)據(jù)管理和共享，加強(qiáng)產(chǎn)業(yè)發(fā)展跟蹤研究，提升行業(yè)精準(zhǔn)管理水平。七是堅決不放松對高致病性禽流感等重大動物疫病的防控，強(qiáng)化動物防疫監(jiān)督執(zhí)法，維護(hù)養(yǎng)殖業(yè)安全。八是加大對人畜共患病防控力度，維護(hù)公共衛(wèi)生安全。九是重視做好動物源性食品安全保障工作，維護(hù)食品安全。

農(nóng)業(yè)部領(lǐng)導(dǎo)強(qiáng)調(diào)，加快推進(jìn)畜禽養(yǎng)殖廢棄物資源化處理，是當(dāng)前推進(jìn)畜牧業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革和畜牧業(yè)綠色發(fā)展的一項要務(wù)。要總結(jié)經(jīng)驗，明確目標(biāo)，突出重點(diǎn)，切實貫徹綠色發(fā)展新理念，加快補(bǔ)齊現(xiàn)代畜牧業(yè)發(fā)展的環(huán)境短板，推動現(xiàn)代種業(yè)結(jié)合農(nóng)牧循環(huán)發(fā)展，推進(jìn)糧飼兼顧、農(nóng)牧結(jié)合、循環(huán)發(fā)展的新型種養(yǎng)結(jié)構(gòu)。

《浙牧》訊

2017-03-17

陸新浩，E-mail：yylxh68@126.com

S858.32

A

1005-7307(2017)04-0005-004