基于A(yíng)FLP標(biāo)記的黃河三角洲中國(guó)檉柳種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

李永濤+楊慶山+劉德璽+周健+王莉莉+王振猛+魏文千

摘要：為了解黃河三角洲地區(qū)分布的中國(guó)檉柳單株間的遺傳關(guān)系，利用AFLP 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)黃河三角洲濱海地區(qū)天然分布的60個(gè)中國(guó)檉柳優(yōu)良單株的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，篩選出的8對(duì)引物組合在60個(gè)中國(guó)檉柳單株中共擴(kuò)增出1 197個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶1 177個(gè)，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出149.63個(gè)條帶和147.13個(gè)多態(tài)性條帶，平均多態(tài)性條帶比率為98.27%。每個(gè)位點(diǎn)的平均多態(tài)信息量為0.1648，平均有效等位基因數(shù)為1.2562，平均多樣性指數(shù)為0.2718。60份材料間的遺傳相似性系數(shù)介于0.8148～0.9172之間，經(jīng)聚類(lèi)分析，以遺傳相似性系數(shù)0.86為閾值，可將60份種質(zhì)資源聚為6個(gè)類(lèi)群；其中，第6組群內(nèi)再以遺傳相似性系數(shù)0.872為閾值時(shí)，又可分為7個(gè)亞組。本研究揭示出黃河三角洲濱海地區(qū)中國(guó)檉柳單株間雖存在一定的遺傳多樣性，但遺傳基礎(chǔ)差異較小，可為該區(qū)域檉柳種質(zhì)資源保存、鑒定和利用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：黃河三角洲；中國(guó)檉柳；AFLP；遺傳多樣性

中圖分類(lèi)號(hào)：Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2017）07-0021-06

Abstract In order to understand the genetic relationship of Tamarix chinensis in the Yellow River Delta， the genetic diversity of 60 T. chinensis superior individuals was tested by AFLP technique. The results showed that 1 197 fragments were amplified by 8 selective primer pairs from 60 superior individuals of T. chinensis， and there were 1 177 polymorphic fragments. A total of 149.63 fragments and 147.13 polymorphic fragments were amplified for each pair of primers. The average polymorphism percentage was 98.27%. The average polymorphic information of each locus was 0.1648， the average number of effective alleles was 1.2562， and the average index of genetic diversity was 0.2718. The average genetic similarity coefficients ranged from 0.8148 to 0.9172. Through clustering analysis， the 60 samples were clustered into 6 groups when the genetic similarity coefficient of 0.86 was used as the threshold value. In which， when the genetic similarity coefficient was 0.872， the sixth group could be divided into 7 subgroups. In short， although there were certain genetic diversity among T. chinensis superior individuals in the Yellow River Delta， the genetic basis difference was narrow. The results could provide theoretical bases for germplasm conservation， identification and utilization of T. chinesis in this region.

Keywords The Yellow River Delta； Tamarix chinensis； AFLP； Genetic diversity

黃河三角洲濱海地區(qū)是中國(guó)北方典型的泥質(zhì)海岸，地下水埋藏淺且礦化度高，海水易內(nèi)侵，土壤鹽漬化嚴(yán)重，生態(tài)系統(tǒng)脆弱。目前，分布于黃河三角洲沿海及灘涂地帶的大面積檉柳群落是維持該地區(qū)生態(tài)環(huán)境的重要支柱，其在黃河三角洲的生態(tài)維護(hù)以及植物資源的種質(zhì)保護(hù)上都具有極其重要的價(jià)值[1]。

檉柳（Tamarix chinensis）為檉柳科（Tamaricaceae）檉柳屬（Tamarix Linn.）植物，又稱(chēng)中國(guó)檉柳、三春柳等，具有高抗鹽、抗旱、耐水濕的生物學(xué)特性[2]。黃河三角洲地區(qū)目前有中國(guó)檉柳和甘蒙檉柳兩種檉柳分布，甘蒙檉柳多為大面積分布，中國(guó)檉柳多為零星散生。與甘蒙檉柳相比，中國(guó)檉柳植株更為高大，綠化效果更佳。目前中國(guó)檉柳已成為黃河三角洲濱海重鹽堿地區(qū)重要的生態(tài)修復(fù)物種，并在鹽堿地綠化和植被修復(fù)中得到廣泛應(yīng)用[3]。國(guó)內(nèi)外對(duì)檉柳屬植物的研究較多，內(nèi)容涉及遺傳分類(lèi)、資源分布、抗逆生理等各個(gè)方面[4-6]。近幾年，研究者們對(duì)于將分子標(biāo)記應(yīng)用于檉柳種質(zhì)資源研究進(jìn)行了有益的探索。趙景奎等[7]利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)分布于東營(yíng)市內(nèi)不同小區(qū)域檉柳天然群體的遺傳多樣性進(jìn)行檢測(cè)。蔣志敏等[8]利用ISSR分子標(biāo)記，對(duì)來(lái)自黃河三角洲三個(gè)居群的90個(gè)檉柳個(gè)體的遺傳多樣性進(jìn)行了對(duì)比分析，并深入探討了居群結(jié)構(gòu)和遺傳分化格局的成因。葉春秀等[9]選用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)10份分布于新疆塔河流域上、中、下游的檉柳種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，并構(gòu)建了每份種質(zhì)的指紋圖譜。目前，利用RAPD、SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)檉柳天然群體進(jìn)行遺傳多樣性的研究已有所報(bào)道，但利用AFLP技術(shù)分析中國(guó)檉柳的遺傳多樣性還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。為深入了解黃河三角洲濱海地區(qū)中國(guó)檉柳的遺傳結(jié)構(gòu)，本研究以天然分布的60份中國(guó)檉柳優(yōu)良單株為研究材料，利用AFLP分子標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期為黃河三角洲濱海地區(qū)檉柳種質(zhì)資源的保存、鑒定和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為黃河三角洲濱海區(qū)域天然分布的中國(guó)檉柳優(yōu)良喬化型單株60株，采集時(shí)分別標(biāo)記其經(jīng)緯度（表1）。群體間為避免采集到同一家系的個(gè)體，各采集單株至少相隔1 km。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 剪取每個(gè)單株當(dāng)年新生鮮葉片，立即放入裝有硅膠的密封袋中干燥保存，帶回實(shí)驗(yàn)室置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用CTAB 法提取葉片總DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 AFLP擴(kuò)增及檢測(cè) 從64對(duì)隨機(jī)引物組合中篩選出擴(kuò)增條帶數(shù)量多、多態(tài)性好、清晰度高、分布均勻的8 對(duì)引物組合（表2）。采用PstⅠ和MseⅠ內(nèi)切酶對(duì)DNA樣品進(jìn)行酶切，然后與PstⅠ和MseⅠ特定接頭連接，通過(guò)PstⅠ和MseⅠ預(yù)擴(kuò)增引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。預(yù)擴(kuò)增體系為：酶切連接產(chǎn)物2 μL，PstⅠ和MseⅠ預(yù)擴(kuò)增引物各0.5 μL，dNTPs 0.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 18.5 μL，共計(jì)25 μL體系；預(yù)擴(kuò)增PCR條件為：94℃ 2 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 80 s，循環(huán)30次；再72℃延伸5 min，反應(yīng)終止于4℃。將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍后，采用PstⅠ和MseⅠ引物組合進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：預(yù)擴(kuò)稀釋樣品2 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 0.5 μL，PstⅠ引物1 μL，MseⅠ引物1 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 17.5 μL，共計(jì)25 μL體系；選擇性擴(kuò)增條件為：94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 80 s，1個(gè)循環(huán)；然后以每循環(huán)復(fù)性溫度逐級(jí)降低0.7℃的梯度繼續(xù)12個(gè)循環(huán)；接著按94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 80 s，擴(kuò)增23輪；最后再72℃延伸5 min，反應(yīng)終止于4℃。

PCR擴(kuò)增在Gene Amp PCR System 9600擴(kuò)增儀上完成，內(nèi)切酶和T4連接酶均購(gòu)自New England Biolabs公司，接頭及引物由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物變性后在4%聚丙烯酰胺變性凝膠上電泳分離，染色顯影。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

在電泳圖譜上對(duì)遷移率相同的條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有帶記為1，無(wú)帶記為0。采用POPGENE version 1.32軟件計(jì)算多態(tài)性條帶比率（PPB）、多態(tài)信息量（PIC）、有效等位基因數(shù)（Ne）、多態(tài)性信息指數(shù)（PIC） 和多樣性指數(shù)（I）等遺傳多樣性指標(biāo)；利用NTSYSpc-V.2.1計(jì)算遺傳相似性系數(shù)；根據(jù)相似性系數(shù)進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)分析[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP 擴(kuò)增結(jié)果

利用篩選出的8對(duì)多態(tài)性較高的引物組合對(duì)60份中國(guó)檉柳材料進(jìn)行AFLP擴(kuò)增，圖譜（圖1）顯示擴(kuò)增多態(tài)性好，所得擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰，易于分辨。其中，擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)最多的是引物P-GAG/ M-CTG組合，最少的是引物P-GAG/M-CTT組合（表3）。擴(kuò)增片段大小主要在70～500 bp之間，8對(duì)引物在60份材料中共獲得1 197個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶1 177個(gè)；不同引物對(duì)擴(kuò)增的多態(tài)帶比例均較高，變化范圍為96.00%～99.43%，差異較??；其中引物對(duì)P-GAG/M-CTG擴(kuò)增的多態(tài)帶比例最高，為99.43%，而P-GTG/M-CTG擴(kuò)增的多態(tài)帶比例最低，為96.00%，平均多態(tài)性條帶比率為98.27%。每個(gè)位點(diǎn)的平均多態(tài)信息量為0.1648，平均有效等位基因數(shù)為1.2562，平均多樣性指數(shù)為0.2718。由此可見(jiàn)，選取的引物在檉柳優(yōu)良單株間表現(xiàn)出較高的多態(tài)性水平，說(shuō)明AFLP標(biāo)記適合進(jìn)行檉柳遺傳多樣性統(tǒng)計(jì)分析。

2.2 遺傳相似性分析

遺傳相似性系數(shù)是表示不同個(gè)體之間遺傳差異大小的重要指標(biāo)，60個(gè)中國(guó)檉柳單株的遺傳相似性系數(shù)，在0.8148～0.9172之間，平均為0.8437。遺傳相似性系數(shù)最小的是DY-18和XS-6，為0.8148，說(shuō)明二者的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，差異性最大；遺傳相似性系數(shù)最大的是XS-29和XS-30，達(dá)到0.9172，說(shuō)明二者的親緣關(guān)系最近，遺傳差異性最小。總之，通過(guò)遺傳相似性分析，60個(gè)中國(guó)檉柳單株間均呈現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系，這可能與材料地域性有重要關(guān)系。

2.3 聚類(lèi)分析

基于遺傳相似性系數(shù)，通過(guò)UPGMA 法對(duì)60個(gè)中國(guó)檉柳單株進(jìn)行聚類(lèi)分析。由圖2可以直觀(guān)地看出不同單株間的遺傳關(guān)系，在以相似性系數(shù)0.86為閾值進(jìn)行切割時(shí)，60個(gè)檉柳單株可劃分為6組。第1組包括2個(gè)單株，分別為XS-6和XS-7；第2組包括XS-10、XS-11、XS-14、XS-17、XS-23共5個(gè)單株；第3組包括1個(gè)單株為XS-31；第4組包括2個(gè)單株，分別為XS-5和XS-22；第5組包括1個(gè)單株為XS-15；第6組包括49個(gè)單株。在以遺傳相似性系數(shù)0.872為閾值進(jìn)行切割時(shí)，還可將第6組分為7個(gè)亞組，其中第1亞組包括XS-18、XS-21共2個(gè)單株；第2亞組、第3亞組和第4亞組均各包含1個(gè)單株，分別為XS-32、DY-26和 DY-22；第5亞組包括DY-1～DY-21、DY-23～DY-25、XC-35～XC-38共28個(gè)單株；第6亞組包括XS-4、XS-8、XS-12、XS-13、XS-16、XS-19、XS-20 和XS-24～XS-30共14個(gè)單株；第7亞組包括XS-3、XS-9共2個(gè)單株。聚類(lèi)結(jié)果表明，大部分種質(zhì)親緣關(guān)系較近，遺傳組成相似，種質(zhì)間存在較多的基因交流。對(duì)應(yīng)聚類(lèi)分析結(jié)果和材料分布位置，60個(gè)檉柳單株的分組與其分布位置不完全一致。

3 討論與結(jié)論

遺傳多樣性是物種基因豐富度的直接反映，而分子標(biāo)記技術(shù)可快速檢測(cè)遺傳變異水平的高低。研究表明，AFLP是研究遺傳多樣性非常有效的分子標(biāo)記技術(shù)[11]。本研究利用AFLP技術(shù)分析了60個(gè)中國(guó)檉柳單株，檢測(cè)出大量的多態(tài)性位點(diǎn)，每對(duì)引物組合在不同的材料間也檢測(cè)出共同的位點(diǎn)，表明AFLP 分子標(biāo)記可用于中國(guó)檉柳單株的鑒定。Vogel等[12]認(rèn)為當(dāng)今世界上四大標(biāo)記系統(tǒng)的綜合效用大小比較關(guān)系為AFLP>SSR>RAPD>RFLP。趙景奎等[7]采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA （RAPD）分子標(biāo)記技術(shù)分析了黃河三角洲檉柳3個(gè)天然群體的遺傳多樣性，多態(tài)譜帶比率為40.07%。葉春秀等[9]選用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)新疆塔河流域的檉柳種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，得出多態(tài)性比率為79.49%。本研究采用8對(duì)AFLP引物即可以將60份檉柳種質(zhì)資源區(qū)分開(kāi)來(lái)，供試的60個(gè)中國(guó)檉柳單株的多態(tài)性條帶百分率平均值達(dá)到了98.27%，表明AFLP標(biāo)記在植物種質(zhì)鑒定和遺傳多樣性分析中具有重要意義，這與Vogel等[12]的研究完全一致。

通常情況下，AFLP電泳圖譜上的每一條擴(kuò)增條帶都對(duì)應(yīng)1個(gè)基因位點(diǎn)，出現(xiàn)多態(tài)性條帶也就意味著某個(gè)或某些物種在該位點(diǎn)上存在變異[13，14]，如果多態(tài)性條帶百分率超過(guò)50%，就可以認(rèn)為該物種有較為豐富的遺傳多樣性[15]。而本研究中平均多態(tài)性條帶比率達(dá)到了98.27%，表明該區(qū)域檉柳具有較高的遺傳多樣性。根據(jù)AFLP 標(biāo)記及聚類(lèi)分析結(jié)果，60個(gè)中國(guó)檉柳單株間的遺傳相似性系數(shù)在0.8148～0.9172之間，平均為0.8437。其中，遺傳相似性系數(shù)最高的是XS-29 和XS-30。通過(guò)地理坐標(biāo)分析，兩者直線(xiàn)距離為1.16 km，距離最近，說(shuō)明地理距離一定程度上決定了種質(zhì)間的遺傳相似性；但聚類(lèi)分析將檉柳種質(zhì)分成的6組中，其中部分地理距離較近的單株并未嚴(yán)格地聚在一組，說(shuō)明基于A(yíng)FLP分子標(biāo)記獲得的60個(gè)中國(guó)檉柳單株間的遺傳關(guān)系與其地理距離沒(méi)有嚴(yán)格的相關(guān)性。

檉柳是黃河三角洲非常典型的適生植被，對(duì)土壤含鹽量和土壤水分的忍耐能力直接決定其適應(yīng)生境的能力。而適宜的生境使檉柳遭受的環(huán)境選擇壓力較小，保留了較大的群體數(shù)量。同時(shí)隔離障礙少，有利于基因流動(dòng)，豐富了各群體內(nèi)的基因資源[16]。本研究中60個(gè)檉柳單株間親緣關(guān)系較近，遺傳差異較小，可能個(gè)體彼此之間有許多相互連接的鄰里，由于基因頻率在鄰里間進(jìn)行交流，鄰里間的基因頻率差異小，導(dǎo)致各單株間在地理位置和遺傳距離之間有一定關(guān)系。需要指出的是，本研究對(duì)檉柳種質(zhì)資源的取材不夠全面，所有取材集中于黃河三角洲濱海區(qū)域，范圍小，不利于全面綜合分析檉柳的遺傳多樣性，今后有待于擴(kuò)大取材范圍進(jìn)行更深入的研究。

參 考 文 獻(xiàn)：

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