血清MK和Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者病情發(fā)生發(fā)展的影響

馬信文，董澤民，王勇，李洪

(攀枝花市第二人民醫(yī)院骨外科1、檢驗(yàn)科2，四川攀枝花617065)

血清MK和Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者病情發(fā)生發(fā)展的影響

馬信文1，董澤民1，王勇1，李洪2

(攀枝花市第二人民醫(yī)院骨外科1、檢驗(yàn)科2，四川攀枝花617065)

目的觀察Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)免疫失衡在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者發(fā)病時(shí)的作用，探討血清中期因子(MK)和Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)對(duì)RA患者病情發(fā)生發(fā)展的影響。方法選取2013年3月至2016年1月在攀枝花市第二人民醫(yī)院接受治療的RA患者58例，根據(jù)RA是否處于活動(dòng)期，將26例DAS28≤3.2者納入非活動(dòng)組，32例DAS28＞3.2納入活動(dòng)組，另將30例健康者作為對(duì)照組，采用酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)三組受檢者的血清MK、白介素-17(IL-17)、白介素-6(IL-6)、白介素-23(IL-23)水平進(jìn)行檢測(cè)，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和外周血Th17細(xì)胞的比例變化，并對(duì)其比例變化和血清MK、IL-17、IL-6、IL-23的水平進(jìn)行比較。結(jié)果活動(dòng)組患者的Th17、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例分別為(1.90±1.00)%、(1.58±1.03)%，非活動(dòng)組分別為(0.98±0.36)%、(3.92±1.29)%，對(duì)照組分別為(0.57±0.21)%、(8.01±1.44)%，活動(dòng)組血清MK為(342.36±68.39)pg/m L，非活動(dòng)組為(257.91±56.79)pg/m L，對(duì)照組為(200.14±83.42)pg/m L，活動(dòng)組血清MK及Th17、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例分別與非活動(dòng)組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，活動(dòng)組與非活動(dòng)組的血清MK及Th17、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例分別與對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。活動(dòng)組IL-17、IL-6和IL-23分別為(28.74±4.37)ng/L、(12.84±2.38)ng/L、(74.27±11.74)ng/L，非活動(dòng)組分別為(19.25±3.27)ng/L、(9.36±2.74)ng/L、(52.29±13.83)ng/L，對(duì)照組分別為(6.01±3.28)ng/L、(5.99±2.92)ng/L、(27.37±10.27)ng/L，活動(dòng)組與非活動(dòng)組的IL-17、IL-6和IL-23水平分別與對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論RA患者的血清MK上升，且類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者Th17/Treg平衡中Th17相對(duì)增高，而Treg會(huì)相對(duì)降低，MK的上升和Th17/Treg平衡失調(diào)都促進(jìn)了RA的發(fā)生發(fā)展。

中期因子；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種自身免疫性疾病[1]。目前RA的發(fā)病機(jī)制不明，大多數(shù)醫(yī)生認(rèn)為，其原因是感染引起遺傳易感個(gè)體的自身免疫反應(yīng)。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為RA病理生理的改變主要由前炎性CD4+的Thl介導(dǎo)[2]。RA患者Th17細(xì)胞相對(duì)升高，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)則相對(duì)下降，Th17/細(xì)胞有所偏倚，而導(dǎo)致兩群細(xì)胞比例異常的重要因素與白介素-6 (IL-6)、白介素-23(IL-23)和白介素-17(IL-17)等相關(guān)細(xì)胞因子的異常有關(guān)[3-4]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞分化的重要機(jī)制是RORγt和Foxp3平衡被打破，在一定程度上抑制了Th17細(xì)胞的分化。本文將探討血清中期因子(MK)和Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者病情的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取我院于2013年3月至2016年1月期間治療的RA患者58例，RA患者根據(jù)美國(guó)風(fēng)濕學(xué)會(huì)1987年的RA分類標(biāo)準(zhǔn)及疾病活動(dòng)度DAS28評(píng)分，分為活動(dòng)組和非活動(dòng)組，其中DAS28≤3.2為非活動(dòng)組26例，DAS28＞3.2為活動(dòng)組32例。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他免疫系統(tǒng)及風(fēng)濕性疾?。?2)合并其他慢性疾??；(3)明顯血液學(xué)指標(biāo)異常。另將30例健康者作為對(duì)照組。RA患者病程2～13年，活動(dòng)組患者中男性18例，女性14例，平均年齡(56±13)歲；非活動(dòng)組患者中男性16例，女性10例，平均年齡(58±11)歲；健康組中男性17例，女性13例，平均年齡(58±15)歲。三組受檢者臨床資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器KDC-40低速離心機(jī)，奧地利產(chǎn)Sunrise TECAN型酶標(biāo)，杭州四季清公司產(chǎn)胎牛血清。IL-17、IL-16、IL-23、TGF-B ELISA試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R&D公司。

1.2.2 檢測(cè)方法(1)檢測(cè)細(xì)胞因子：首先測(cè)定三組受檢者血清IL-17、IL-23、IL-6及MK水平，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)，試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司，操作按試劑盒提供的說(shuō)明書進(jìn)行；(2)Th17的測(cè)定：采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，用RPM ll640稀釋后，再將25IxL PMA、20斗L Ionomy-cin加入，在37℃條件下進(jìn)行孵育5 h。設(shè)同型對(duì)照管和檢測(cè)管(f分別為A管、B管)，2.5 txL CD-PerCP和2.5 L CD8-FITC分別加入A管、B管，孵育約15 m in，加入Reagent A，在避光條件下放置約15 min。清洗后，兩只試管都加入100IxLFix&Penn中的溶血液和破膜。在避光條件下放置約15 m in后清洗，清洗后加500 tzL磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸。(3)Treg的測(cè)定：將50斗L加入10 txL FITC-CD4/ APC-CD25(肝素鈉抗凝全血)溶血洗滌后棄上清，使用1 m L新鮮配置的Fixation/Permmeabilization液混勻，在溫度為4℃條件下進(jìn)行孵育大約2 h。洗滌后，加入1 IxL正常鼠血清，4℃封閉約15 m in，并將10斗L PE加入，抗人Foxp3mAb于4℃孵育約30 m in，經(jīng)洗滌后，用500斗L染色緩沖液重懸，上機(jī)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組受檢者的Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及MK比較活動(dòng)組Th17、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及MK分別與非活動(dòng)組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，活動(dòng)組與非活動(dòng)組的Th17、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及MK分別與對(duì)照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 三組受檢者的Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例比較(，%)

表1 三組受檢者的Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例比較(，%)

注：與非活動(dòng)組比較，aP＜0.05；與對(duì)照組比較，bP＜0.05。

例數(shù)組別Th17(%)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(%)MK(pg/m L) 32 26 30活動(dòng)組非活動(dòng)組對(duì)照組F值P值1.90±1.00ab0.98±0.36b0.57±0.21 32.709＜0.05 1.58±1.03ab3.92±1.29b8.01±1.44 80.489＜0.05 342.36±68.39ab257.91±56.79b200.14±83.42 31.698＜0.05

2.2 三組受檢者的I-17、IL-6和IL-23水平比較活動(dòng)組IL-17、IL-6和IL-23水平分別與非活動(dòng)組相比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，活動(dòng)組與非活動(dòng)組的IL-17、IL-6和IL-23水平分別與對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 三組受檢者的IL-17、IL-6和IL-23水平比較(，ng/L)

表2 三組受檢者的IL-17、IL-6和IL-23水平比較(，ng/L)

注：與非活動(dòng)組比較，aP＜0.05；與對(duì)照組比較，bP＜0.05。

組別IL-23例數(shù)IL-17 IL-6活動(dòng)組非活動(dòng)組對(duì)照組F值P值74.27±11.74ab52.29±13.83b27.37±10.27 60.168＜0.05 32 26 30 28.74±4.37ab19.25±3.27b6.01±3.28 68.321＜0.05 12.84±2.38ab9.36±2.74b5.99±2.92 53.292＜0.05

3 討論

RA是一種慢性自身免疫性疾病，目前其具體的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)Thl7是能夠分泌IL-17的Th細(xì)胞亞群[1]。細(xì)胞可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，并且是淋巴細(xì)胞中的重要組分，其維持機(jī)體的免疫穩(wěn)定的作用主要通過(guò)抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的功能實(shí)現(xiàn)，以有效避免自身免疫病的發(fā)生。MK是一種肝素結(jié)合生長(zhǎng)/分化因子，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后過(guò)程中具有很重要的影響[5-6]。本文旨在探討血清MK和Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者病情發(fā)生發(fā)展的影響。

調(diào)控Th17細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子有很多，但最重要的就是RORγτ，這種因子會(huì)促進(jìn)Th17生成[7]；同時(shí)，RORγτ一個(gè)關(guān)鍵的活化信號(hào)就是信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子，信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子會(huì)促進(jìn)RORγτ的分化，也會(huì)促進(jìn)Th17生成，因此我們通常認(rèn)為信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子是Th17的調(diào)節(jié)因子[8-9]。本研究中，三組受檢者血清MK及Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例比較結(jié)果顯示，活動(dòng)組血清MK及Th17、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例分別與非活動(dòng)組相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，活動(dòng)組與非活動(dòng)組的血清MK及Th17、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例分別與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，這說(shuō)明Th17/細(xì)胞亞群失衡在RA發(fā)病中具有很大影響。有研究報(bào)道，IL-6和IL-17在嚙齒類動(dòng)物還是人類均為Thl7細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的重要細(xì)胞因子[7]，本實(shí)驗(yàn)用ELISA法對(duì)RA患者血清中IL-6和IL-17、IL-23濃度進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其濃度均明顯高于對(duì)照組。

綜上所述，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的血清MK升高，且類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者Th17/Treg平衡中Th17相對(duì)增高，而Treg會(huì)相對(duì)降低，MK的升高和Th17/Treg平衡失調(diào)可能共同參與并促進(jìn)了RA的發(fā)生發(fā)展。

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讀者·作者·編者

標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)學(xué)名詞表(待續(xù))

(本表以全國(guó)自然科學(xué)名詞審定委員會(huì)公布的《醫(yī)學(xué)名詞》為據(jù))

Effects of serum MK and Th17/regulatory T cells on the development of rheumatoid arthritis.

MA Xin-wen1, DONG Ze-min1,WANG Yong1,LI Hong2.Orthopeadic Surgery1,Clinical Laboratory2,the Second People's Hospital of Panzhihua,Panzhihua 617065,Sichuan,CHINA

Objective To investigate the role of Th17/regulatory T(Treg)cells imbalance in onset patients w ith rheumatoid arthritis(RA),and to explore the effects of serum midkine(MK)and Th17/Treg cells balance on the development of RA.Methods A total of 58 cases of RA patients treated in the Second People's Hospital of Panzhihua between March 2013 to January 2016 were enrolled.According to whether RA was active,patients were divided into inactive group(DAS28≤3.2,26 cases),and active group(DAS28＞3.2,32 cases),and 30 healthy people were selected as controls.Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)was used to detect in three groups the levels of serum MK,interleukin-17(IL-17),IL-6 and IL-23;flow cytometry was used to analyze the proportional change of Th17 cells and Treg cells in peripheral blood.Comparison were explored on the change between the proportion of Th17 cells and Treg cells, serum MK level and values of IL-17,IL-6,IL-23.Results The proportion of Th17 cells and Treg cells in active group were(1.90±1.00)%,(1.58±1.03)%,respectively,which were(0.98±0.36)%,(3.92±1.29)%in inactive group and(0.57± 0.21)%,(8.01±1.44%)%in control group,respectively.The level of serum MK in active group was(342.36±68.39)pg/m L, (257.91±56.79)pg/m L in inactive group and(200.14±83.42)pg/m L in control group.A ll the results(the level of serum MK and the propotion of Th17 and Treg cells)showed statistically significant difference between active group and inactive group(P＜0.05).The levels of IL-17,IL-6 and IL-23 in active group were(28.74±4.37)ng/L,(12.84±2.38)ng/L, (74.27±11.74)ng/L,respectively,(19.25±3.27)ng/L,(9.36±2.74)ng/L,(52.29±13.83)ng/L in inactive group,and(6.01± 3.28)ng/L,(5.99±2.92)ng/L,(27.37±10.27)ng/L in control group,respectively.Statistically differences were showed both in active group and inactive group when compared to the control group(P＜0.05).Conclusion Serum MK level Is significantly elevated in RA patients,who revealed a relatively high frequency of Th17 cells and low number of Treg cells on Th17/Treg balance.An elevated serum MK level and impared Th17/Treg balance both promote the occurrence and development of RA.

M idkine;Regulatory T cells;Rheumatoid arthritis

不宜用厭食藥癮藥原性伊萊亞森卡環(huán)伊娃系列胰泌素胰臟移行上皮移植抗原遺傳圖遺傳性出血性毛細(xì)管擴(kuò)張疑病癥異常β脂蛋白血癥異卵雙生抑胃肽易感性癔病隱性眼鏡嬰兒型脊髓性肌萎縮嬰兒型進(jìn)行性脊髓性肌萎縮癥熒光抗體宜用畏食藥物依賴藥源性RPA卡環(huán)汞合金懸突磨除器促胰液素胰腺變移上皮組織相容性抗原連鎖圖奧斯勒-韋伯-朗迪病疑病性神經(jīng)癥家族性高脂血癥Ⅲ型二卵雙生糖依賴性胰島素釋放肽易患性癔癥接觸鏡韋德尼希-霍夫曼病韋德尼希-霍夫曼綜合征熒光素標(biāo)記抗體不宜用硬癱幽門口尤爾畸形右胸導(dǎo)管釉髓原發(fā)綜合征原核原淋巴細(xì)胞圓柱鏡約翰遜矯治器甾類激素在體巴爾體巴氏小體疤痕白蛋白白塞綜合征白色梗死白血球斑釉牙半乳糖神經(jīng)酰胺脂質(zhì)貯積癥宜用痙攣性癱瘓幽門羊皮紙樣右心室右淋巴導(dǎo)管[成釉器]星網(wǎng)狀層原發(fā)復(fù)合征前核淋巴母細(xì)胞柱鏡片雙絲弓矯治器類固醇激素體內(nèi)性染色質(zhì)X染色質(zhì)瘢痕清蛋白貝赫切特綜合征貧血性梗死白細(xì)胞氟牙癥球形細(xì)胞腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良

R593.22

A

1003—6350（2017）13—2128—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.13.020

2017-01-11)

馬信文。E-mail：403627894@qq.com