SAHA抑制瘦素誘導(dǎo)的乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的分子機制

周偉強

SAHA抑制瘦素誘導(dǎo)的乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的分子機制

周偉強

（沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點實驗室，遼寧沈陽110034）

目的：研究組蛋白去乙酰化酶抑制劑SAHA抑制瘦素誘導(dǎo)的乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的分子機制。方法：采用固相細胞凋亡抗體芯片技術(shù)測定瘦素和SAHA對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖產(chǎn)生的影響。結(jié)果：SAHA顯著增強MDA-MB-231細胞中Bax、p21CIP1和p27KIP1的表達，并降低Survivin蛋白的含量；經(jīng)SAHA作用后MDA-MB-231細胞中Caspase-3和Clusterin的表達水平明顯上升，而腫瘤壞死因子受體超家族成員1A（TNFRSF1A）的表達水平明顯下降。結(jié)論：SAHA可通過激活乳腺癌細胞內(nèi)凋亡途徑，并抑制細胞周期的進程而達到抑制乳腺癌發(fā)生的目的。

乳腺癌；MDA-MB-231；增殖；瘦素；SAHA

隨著對乳腺癌發(fā)生的不斷認識，乳腺癌的預(yù)防、治療有了長足的進步，但有效地預(yù)防和阻斷乳腺癌發(fā)生和發(fā)展仍是乳腺癌研究的關(guān)鍵和難點之一。盡管乳腺癌發(fā)生和發(fā)展的原因十分復(fù)雜，但歸根到底均和基因表達及基因表達產(chǎn)物活性異常密切相關(guān)［1］。隨著科技發(fā)展，特別是分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)表觀遺傳改變在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中具有更普遍的意義，其主要是影響基因轉(zhuǎn)錄活性而非DNA序列突變，可通過細胞分裂和增殖得以穩(wěn)定遺傳的表達調(diào)控方式已逐漸成為乳腺癌研究和治療的熱點［2-3］。組蛋白乙?；{(diào)控作為一種重要的表觀遺傳修飾方式，通過調(diào)節(jié)組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（histone acetyltra nsferase，HAT）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）之間的動態(tài)平衡，參與乳腺癌的形成過程［4］。

SAHA（Suberoylanilide Hydroxamic Acid）作為繼HMBA（Hexamethy Lenebisacetamide）之后的第二代羥肟酸類的HDAC抑制劑，是美國Merck公司開發(fā)的用于治療持續(xù)惡化或復(fù)發(fā)的T細胞淋巴瘤（CTCL）藥物，于2006年10月獲得FDA上市批準，商品名為Zolinza。大量實驗證實SAHA具有良好的抑瘤性，其可非特異性結(jié)合HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC6的催化位點，并抑制其活性以促進乙?；M蛋白增加，造成癌細胞轉(zhuǎn)錄過程異常，誘導(dǎo)癌細胞分化，阻滯癌細胞周期進程和促進癌細胞凋亡的發(fā)生［5］。本文選取ER陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞，利用固相細胞凋亡抗體芯片技術(shù)研究SAHA抑制Leptin誘導(dǎo)的MDA-MB-231細胞增殖的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料人乳腺癌細胞株MDA-MB-231由本實驗室凍存；Leibovitz′s L-15培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素及鏈霉素購自美國Thermo公司；固相細胞凋亡抗體芯片試劑盒購自美國R&D公司；人重組Leptin蛋白、SAHA及其它化學(xué)試劑購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)人乳腺癌MDA-MB-231細胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清、100 U/ml的青霉素、100 μg/ml的鏈霉素的Leibovitz′s L-15培養(yǎng)基中。

1.2.2 全細胞蛋白提取將大約1×107個乳腺癌MDA-MB-231細胞接種于100 mm培養(yǎng)皿中，細胞進行無血清同步化處理后加入0.625 nmol/L Leptin和5 μmol/L SAHA與MDA-MB-231細胞孵育32 h。將處理后的MDA-MB-231細胞經(jīng)胰蛋白酶消化，14 000×g離心5 min后取細胞團塊經(jīng)M-PER裂解液裂解，應(yīng)用BCA法檢測蛋白濃度待用。

1.2.3 固相細胞凋亡抗體芯片技術(shù)檢測將已包被抗體的PVDF膜封閉1 h后，分別加入200 μg各蛋白樣品液于4孔板各孔中，4℃振蕩孵育過夜。蛋白樣品-抗體膜經(jīng)PBS沖洗3遍后分別加入1.5 ml生物素標記的二抗振蕩孵育1 h。PVDF膜經(jīng)沖洗后加入HRP偶聯(lián)的鏈霉親和素孵育30 min。將等體積混合的ECL化學(xué)發(fā)光底物A、B液均勻加在PVDF膜上，顯色5 min?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光后應(yīng)用Gelpro Analyzer software（Media Cybernetics）計算膜上各抗體標記點的灰度值來決定Leptin和SAHA等處理因素對MDA-MB-231細胞凋亡蛋白表達產(chǎn)生的影響。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以（x±s）表示，采用單因素方差分析方法和Student's t-test進行統(tǒng)計學(xué)處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SAHA抑制乳腺癌細胞周期調(diào)控系統(tǒng)因子的表達固相細胞凋亡抗體芯片技術(shù)測定結(jié)果顯示，與空白對照組相比，單獨SAHA處理顯著誘導(dǎo)了乳腺癌MDA-MB-231細胞中Bax、p21CIP1和p27KIP1的表達，并降低了Survivin的蛋白表達水平；而Leptin則抑制了Bax和p21CIP1的表達，對p27KIP1和Survivin蛋白表達的影響不明顯。SAHA和Leptin的聯(lián)合作用不能抑制SAHA誘導(dǎo)的Bax、p21CIP1和p27KIP1的表達。見圖1。

2.2 SAHA對乳腺癌細胞中凋亡蛋白表達的影響固相細胞凋亡抗體芯片技術(shù)測定結(jié)果表明，與空白對照組相比，經(jīng)SAHA作用后MDA-MB-231細胞中Caspase-3和Clusterin的表達水平明顯上升，而腫瘤壞死因子受體超家族成員1A（TNFRSF1A）的表達水平明顯下降；與凋亡產(chǎn)生密切相關(guān)的TRAIL DR5表達水平在SAHA的作用下也有所升高。Leptin對MDA-MB-231細胞的作用效果體現(xiàn)在可顯著增加TNFRSF1A的表達水平；但對Caspase-3等蛋白的表達水平影響不大。見圖2。

圖1 SAHA對乳腺癌MDA-MB-231細胞周期調(diào)控系統(tǒng)因子表達的影響

圖2 SAHA誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細胞中凋亡蛋白的表達

3 討論

HDAC抑制劑是近年來發(fā)現(xiàn)的一類體內(nèi)外抗腫瘤效果顯著的藥物，其生物學(xué)效應(yīng)主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)細胞凋亡、細胞周期阻滯、促進細胞分化以及抑制血管生成［6］。HDAC抑制劑可在小劑量、低濃度情況下誘導(dǎo)腫瘤細胞分化，選擇性凋亡，對正常細胞無毒性，且具有抗腫瘤廣譜性，具有潛在的臨床應(yīng)用前景，以HDAC抑制劑為靶標的相關(guān)研究與臨床應(yīng)用正廣泛的開展［7-8］。

有研究通過對斑馬魚等發(fā)育生物模型研究發(fā)現(xiàn)，HDAC在生物體組織發(fā)育中起到關(guān)鍵的誘導(dǎo)發(fā)育的作用，而SAHA可通過抑制腫瘤生長、調(diào)控癌細胞增殖而發(fā)揮自己的生物學(xué)效能［9-10］。另外前期研究還發(fā)現(xiàn)SAHA可明顯抑制乳腺癌MDAMB-231細胞增殖周期的進程，誘導(dǎo)細胞凋亡的產(chǎn)生，并伴有核心組蛋白H3、H4乙酰化水平的上調(diào)及HDAC1活性的下降，SAHA通過上調(diào)核心組蛋白表觀遺傳修飾水平，激活p53、p21WAF1/CIP1等相關(guān)基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性，促進細胞周期調(diào)控因子的功能，有效抑制了Leptin誘導(dǎo)的乳腺癌細胞增殖，并促發(fā)細胞凋亡的產(chǎn)生，從而阻礙乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展［11］。本實驗進一步發(fā)現(xiàn)，SAHA作用后MDA-MB-231細胞中Caspase-3和Clusterin的表達水平明顯上升，而TNFRSF1A的表達水平明顯下降。Caspase-3作為凋亡過程中最重要的關(guān)鍵反應(yīng)元件，是細胞凋亡的主要執(zhí)行者和效應(yīng)分子，是多種凋亡激活信號傳遞的匯集點，它的活化是凋亡發(fā)生進入不可逆階段的標志［12］。Clusterin可通過與細胞質(zhì)中Bax共同作用抑制細胞色素C的釋放而達到保護細胞的目的［13］。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）通過其特異受體TNFRSF1A在體內(nèi)發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)，包括刺激腫瘤發(fā)生和促炎癥作用［14］。綜合本實驗結(jié)果，我們認為SAHA可通過Caspase-3依次激活乳腺癌細胞內(nèi)凋亡途徑，抑制細胞周期的進程而達到抑制乳腺癌發(fā)生的目的。

本實驗在蛋白水平上探討了SAHA對Leptin誘導(dǎo)的乳腺癌發(fā)生所產(chǎn)生的抑制作用，對于拓寬乳腺癌研究方向，尋找潛在的、有效的乳腺癌靶基因治療位點都奠定了堅實的實驗和理論基礎(chǔ)。

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The Molecular Mechanisms of Inhibiting the Cell Proliferation with SAHA and Leptin Treatment in Breast Cancer MDA-MB-231 Cells

ZHOU Weiqiang
（Shenyang Medical College，Key Laboratory of Environmental Pollution and Microecology of Liaoning Province，Shenyang 110034，China）

Objective:To study the molecular mechanisms of histone deacetylase inhibitor SAHA for inhibiting the cell proliferation of breast cancer MDA-MB-231 cells induced by leptin.Methods:Solid phase of antibody microarray was used to detect the apoptostic effects for MDA-MB-231 cells treated with leptin and SAHA treatment.Results:SAHA significantly increased the expressions of Bax,p21CIP1and p27KIP1and reduced the level of Survivin protein.After SAHA treatment，the levels of Caspase-3 and Clusterin obviously increased and the level of TNFRSF1A significantly decreased.Conclusion:By activating apoptotic pathways in breast cancer MDA-MB-231 cells and inhibiting the cell cycle progression,SAHA achieves the purpose of inhibiting breast cancer.

breast cancer；MDA-MB-231；proliferation；leptin；SAHA

R394.3

A

1008-2344（2017）02-0084-03

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.02.004

2016-06-08

（文敏編輯）

國家自然科學(xué)基金項目（No.81172509）

周偉強（1970—），男（漢），教授，研究方向：乳腺癌發(fā)生與調(diào)控.E-mail：zhouwq@hotmail.com