高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定紙質(zhì)食品接觸材料中11種熒光增白劑

韓曉鷗，李延升，陳曦，高巖，姜漢碩

(遼寧省疾病預(yù)防控制中心，沈陽(yáng) 110005)

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定紙質(zhì)食品接觸材料中11種熒光增白劑

韓曉鷗，李延升，陳曦，高巖，姜漢碩

(遼寧省疾病預(yù)防控制中心，沈陽(yáng) 110005)

建立了同時(shí)測(cè)定紙和紙板食品接觸材料中11種熒光增白劑的高效液相色譜-熒光檢測(cè)法。將粉碎好的紙質(zhì)樣品用40%乙腈水溶液超聲提取，脫脂、濃縮后用高效液相色進(jìn)行定性定量分析。在測(cè)定條件下，樣品干擾低，11種熒光增白劑分離度大于1.0，在各自線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 9，11種熒光增白劑的檢出限為0.12～0.24 mg/kg，定量限為0.40～0.80 mg/kg，加標(biāo)回收率為90.1%～99.3%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3%～2.8% (n=6)。該法樣品處理簡(jiǎn)便、快速，方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，可用于紙質(zhì)食品接觸材料中熒光增白劑的檢測(cè)。

高效液相色譜法；熒光檢測(cè)；熒光增白劑；食品接觸材料；紙和紙板

AbstractThe method was established for determination of 11 kinds of fluorescent whitening agents in food contact materials by high performance liquid chromatography(HPLC) with fluorescence detector. The samples were extracted with acetonitrile by sonication and determined by high performance liquid chromatography. The results were less in fluenced,resolution of peaks of the 11 kinds of flourescent whitening agents achieved to values larger than 1.0. Under the experiment conditions, the correlation coef ficients were all more than 0.999 9, the detection limits (LODs) were 0.12-0.24 mg/kg, and quantitative limits were 0.40-0.80 mg/kg. The standard recovery rates were 90.1%-99.3%, and the relative standard deviations were 0.3%-2.8%(n=6). The method is simple, rapid, accurate and sensitive for the determination of fluorescent whitening agents in food contact materials.

Keywordshigh performance liquid chromatography; fluorescence detection; fluorescent whitening agent; food contact material; paper

食品安全一直是人們關(guān)心的重大國(guó)計(jì)民生問題。世界各國(guó)特別是美國(guó)、歐盟、日本等工業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家的分析與研究結(jié)果表明，與食品接觸的器皿、餐廚具和包裝容器以及包裝材料中有害物質(zhì)已經(jīng)成為食品污染的重要來(lái)源之一［1］。熒光增白劑是一種熒光染料，或稱為白色染料，是一種能吸收紫外光再激發(fā)出可見的藍(lán)或藍(lán)紫色熒光的復(fù)雜有機(jī)化合物［2-3］。熒光增白劑可以補(bǔ)充所添加產(chǎn)品中藍(lán)-紫光的不足，更好地增加所照射產(chǎn)品上光的總反射量，從而使人們所看到的物質(zhì)更白，達(dá)到增白增艷的效果［4］。熒光增白劑除了有增白作用外，還有保鮮、防腐的功能。據(jù)報(bào)道，一些不法商販將熒光增白劑添加到蘑菇［5］、面粉［6］等食品中，對(duì)人體產(chǎn)生潛在的威脅。越來(lái)越多的學(xué)者和專家開始對(duì)熒光增白劑的危害進(jìn)行研究。我國(guó)國(guó)家食品安全整頓辦在2010年3月發(fā)布的整頓辦函(2010)50號(hào)文件中，已將熒光增白劑物質(zhì)列入第四批“食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑”黑名單中［7-8］。國(guó)家其它相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)［9-11］也明確規(guī)定：在食品包裝用原紙、餐具洗滌劑、食品工具設(shè)備用洗滌劑與洗滌消毒劑中均不得使用熒光增白劑。

紙質(zhì)食品接觸材料中熒光增白劑的檢測(cè)一般檢測(cè)4～5種，有些液相色譜法色譜峰分離效果不好，用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)最多可同時(shí)檢測(cè)7種熒光增白劑，但液相色譜-質(zhì)譜儀器設(shè)備成本高［12-15］。

筆者在超市等商場(chǎng)進(jìn)行食品接觸材料(紙杯、紙碗)的樣品采集，采用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法進(jìn)行11種熒光增白劑的分析，以期為食品安全監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：1260型，安捷倫科技(中國(guó))有限公司；

超聲波清洗器：KQ5200DB型，昆山市超聲儀器有限公司；

Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司；

臺(tái)式冷凍離心機(jī)：Sorvall ST 16R型，美國(guó)熱電公司；

漩渦混勻器：LAB DANCER S25型，德國(guó)艾卡儀器設(shè)備有限公司；

辦公室碎紙機(jī)：寧波得力集團(tuán)有限公司；

高速粉碎機(jī)：A11BS25型，德國(guó)艾卡儀器設(shè)備有限公司；

電子天平：BS110S型，感量為0.1 mg，德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；

pH計(jì)：SevenExcellence型，瑞士梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司；

移液槍：1 000 mL，200 mL，德國(guó) Eppendorf儀器公司；

乙腈、甲醇、正己烷：均為色譜純，美國(guó)費(fèi)希爾公司；

四丁基溴化銨(TBA)、三乙胺、鹽酸：均為分析純，中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；

熒光增白劑標(biāo)準(zhǔn)樣品：11種熒光增白劑標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量濃度均為200 μg/mL，代號(hào)、化學(xué)式、生產(chǎn)批號(hào)見表1，福州勤鵬生物技術(shù)有限公司；

表1 熒光增白劑標(biāo)準(zhǔn)品

實(shí)驗(yàn)用水為高純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

于暗室中，分別用移液槍準(zhǔn)確吸取0.20 mL熒光增白劑標(biāo)準(zhǔn)樣品于10 mL容量瓶中，用40%乙腈水溶液定容至標(biāo)線，配制成質(zhì)量濃度為4 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。吸取0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用40%乙腈水溶液定容至標(biāo)線，配制成200 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 試樣制備

取紙質(zhì)食品包裝材料樣品，先用剪刀將其剪成小塊，再通過碎紙機(jī)，將紙屑全部轉(zhuǎn)移至高速粉碎機(jī)中，以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速粉碎6次，每次約5 s，將紙屑粉碎成纖維狀，常溫下置于黑暗處保存，備用。

1.3.2 試樣提取

稱取0.5 g(精確至0.001 g)粉碎均勻的樣品至50 mL聚丙烯塑料離心管中，避光狀態(tài)下加入20 mL pH為11.5(用三乙胺調(diào)節(jié))的40%乙腈水溶液，于50℃水浴下超聲提取35 min。提取結(jié)束后，以10 000 r/min冷凍離心5 min。轉(zhuǎn)移上清液至50 mL具塞刻度玻璃試管中，再分兩次向紙屑中加入15 mL 40%乙腈水溶液，同上述提取步驟提取10 min，重復(fù)兩次。合并前后3次的上清液，加入40%乙腈水溶液，定容至50 mL，充分渦旋混勻，于暗室中保存，供后續(xù)脫脂使用。

1.3.3 提取液脫脂

分取2 mL提取液至5 mL玻璃刻度試管中，加入0.5 mL正己烷，充分渦旋30 s以使提取液充分脫脂。靜置2 min，使用1 mL吸管小心移取上層正己烷，將下層清液轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，以10 000 r/min離心5 min，小心將上清液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，待HPLC分析。

1.4 色譜條件

色譜柱：Zorbax Elipse plusC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司)；柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：10 μL；樣品室溫度：室溫；FLD檢測(cè)器；激發(fā)波長(zhǎng)：350 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：430 nm；流動(dòng)相：A為乙腈-甲醇(體積比為2∶3)，B為含25 mmol/L TBA 的甲醇 -水 (體積比為 5∶95)，梯度洗脫程序見表2。

1.5 結(jié)果計(jì)算

用高效液相色譜法分析，以系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的色譜峰面積為縱坐標(biāo)Y，溶液質(zhì)量濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)X，擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，樣品的測(cè)定結(jié)果按

表2 流動(dòng)相的梯度洗脫程序

式(1)計(jì)算：

式中：w——樣品中某熒光增白劑的含量，mg/kg；

Y——目標(biāo)物色譜峰面積；

B——標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的截距；

V——樣品提取液的體積，mL；

A——標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率

m——稱樣量，g；

w0——空白對(duì)照試驗(yàn)值，mg/kg。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的選擇

2.1.1 提取溶劑

超聲提取所需溶劑少，且操作簡(jiǎn)便，時(shí)間短，是最常用的提取方式。本實(shí)驗(yàn)使用40%乙腈水溶液作為提取溶劑，可減少有機(jī)溶劑的使用量，但熒光增白劑C.I 264，C.I 353和C.I 357回收率極低。改用pH為11.5(用1%三乙胺水溶液調(diào)節(jié))的40%乙腈水溶液提取，提取液用鹽酸－水(體積比為1∶5)調(diào)節(jié)pH至9.0，11種熒光增白劑回收率滿足要求。

2.1.2 提取溶劑體積

在保持樣品量不變的條件下考察不同提取溶劑體積 (10，20，30，40，50 mL)對(duì)同一加標(biāo)樣品中熒光增白劑提取效果的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，提取溶劑體積為20，30，40，50 mL 時(shí)熒光增白劑的回收率較高，且無(wú)顯著性差異。考慮到增加提取試劑用量會(huì)降低方法的靈敏度，且大量有機(jī)溶劑的使用不利于環(huán)境保護(hù)，還會(huì)增加檢測(cè)成本，故選擇提取溶液體積為20 mL。

2.1.3 提取時(shí)間和溫度

在空白樣品中添加相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品儲(chǔ)備液，考察了超聲提取時(shí)間 (25，30，35，40，45 min)對(duì)熒光增白劑回收率的影響，結(jié)果表明，回收率開始增加趨勢(shì)明顯，35 min后基本保持不變，為節(jié)約時(shí)間，選擇提取時(shí)間為35 min。

在空白樣品中添加同樣濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液，制成陽(yáng)性樣品，分別于30，40，50，60℃下超聲萃取，結(jié)果表明增白劑的提取效率幾乎不隨提取溫度的變化而變化，提取溫度為50℃時(shí)提取效率相對(duì)較高，故選擇提取溫度為50℃。

2.1.4 過濾膜

向空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，按照1.3步驟進(jìn)行樣品前處理，提取液脫脂后一部分過4.5 μm微孔濾膜，一部分以10 000 r/min離心5 min后直接上機(jī)測(cè)定。結(jié)果表明，微孔濾膜對(duì)11種熒光增白劑有吸附作用，會(huì)造成目標(biāo)物的損失。故采用直接進(jìn)樣測(cè)定。

2.2 流動(dòng)相的選擇

分別選擇高效液相色譜經(jīng)常使用的有機(jī)流動(dòng)相甲醇、乙腈作為流動(dòng)相A，試驗(yàn)結(jié)果表明，使用甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑作流動(dòng)相時(shí)，11種熒光增白劑不能實(shí)現(xiàn)基線分離，而且用乙腈作流動(dòng)相，色譜峰嚴(yán)重拖尾。以25 mmol/L TBA鹽溶液作為流動(dòng)相B，pH值在6～8之間時(shí)色譜峰前延嚴(yán)重且11種熒光增白劑也不能實(shí)現(xiàn)基線分離，pH值為9.5～10時(shí)色譜峰拖尾，無(wú)法滿足分析要求。選擇含25 mmol/L TBA的甲醇-水(5∶95)且用三乙胺調(diào)節(jié)pH值為9，流動(dòng)相比例(甲醇∶乙腈∶TBA-甲醇-水)從30∶25∶45到 57∶38∶5，根據(jù)色譜峰分離情況調(diào)節(jié)流動(dòng)相梯度，最終得到表2中最佳流動(dòng)相梯度淋洗條件。

11種熒光增白劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的分離色譜圖見圖1。

圖1 11種熒光增白劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.3 線性范圍和檢出限

分別吸取11種熒光增白劑標(biāo)準(zhǔn)使用液，根據(jù)需要用40%乙腈水溶液分別稀釋成5.0，30.0，100.0，150.0，200.0 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別取10 μL進(jìn)樣測(cè)定。以色譜峰峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，目標(biāo)物的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性方程及相關(guān)系數(shù)見表3。由表3可知，11種熒光增白劑相關(guān)系數(shù)均為0.999 9，表明各組分色譜峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，可以通過外標(biāo)法定量。

當(dāng)稱樣質(zhì)量為0.5 g時(shí)，使用FLD檢測(cè)器檢測(cè)，樣品空白進(jìn)行11次連續(xù)測(cè)定，由3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算得檢出限，11種熒光增白劑的方法檢出限為0.12～0.24 mg/kg，定量限為 0.40～0.80 mg/kg，具體數(shù)據(jù)見表3。

表3 11種熒光增白劑的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限

2.4 加標(biāo)回收及精密度試驗(yàn)

采用在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行加標(biāo)回收重復(fù)性試驗(yàn)?？瞻讟悠愤x擇實(shí)驗(yàn)用紙，配制高、中、低3種濃度，分別取質(zhì)量濃度為4 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液250，500，1 000μL加入空白樣品中，于冰箱中冷藏保存過夜，按照1.3步驟進(jìn)行樣品前處理后重復(fù)測(cè)定6次，加標(biāo)樣品色譜圖見圖2，11種熒光增白劑測(cè)定結(jié)果見表4。由表4可知，熒光增白劑各個(gè)目標(biāo)組分加標(biāo)回收率為90.1%～99.3%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3%～2.8%(n=6)，說明該提取方法回收率高，重現(xiàn)性好，可用于紙杯、紙碗中熒光增白劑的檢測(cè)。

圖2 11種熒光增白劑加標(biāo)樣品色譜圖

2.5 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用本方法對(duì)30份紙杯、紙碗中的11種熒光增白劑進(jìn)行檢測(cè)，用來(lái)確定方法的適應(yīng)性，結(jié)果表明樣品中干擾低。30份樣品中12份測(cè)出熒光增白劑，其中C.I 257，C.I 113等均在檢出限和定量限之間，說明這種熒光增白劑常用于紙杯、紙碗等食品接觸材料中，應(yīng)引起有關(guān)部門的重視。

表4 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3 結(jié)語(yǔ)

建立了紙杯、紙碗中11種熒光增白劑同時(shí)測(cè)定的高效液相色譜法，該方法具有樣品前處理簡(jiǎn)便、使用有機(jī)溶劑少、重現(xiàn)性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，方法的線性關(guān)系能滿足定量分析要求。

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“環(huán)境監(jiān)測(cè)關(guān)鍵計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)及技術(shù)研究”項(xiàng)目順利通過驗(yàn)收

國(guó)家科技支撐計(jì)劃“環(huán)境監(jiān)測(cè)關(guān)鍵計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)及技術(shù)研究”項(xiàng)目順利通過驗(yàn)收，其中，環(huán)境空間輻射非固定波束傳輸機(jī)制和傳輸模式下基站功率通量密度評(píng)估方法的研究成果，填補(bǔ)了相關(guān)領(lǐng)域的空白。

該項(xiàng)目針對(duì)大氣環(huán)境成分量、水體中微生物、土壤中重金屬、空間電磁輻射等環(huán)境指標(biāo)監(jiān)測(cè)中對(duì)于計(jì)量的需求，構(gòu)建了煙氣流量、大氣中溫室氣體成分、比吸收率、在線監(jiān)測(cè)水質(zhì)等量值溯源體系，攻克了激光多普勒測(cè)量大口徑氣體流量的難題，解決了利用氣相滴定法測(cè)量臭氧含量溯源難題；解決了微痕量多組分揮發(fā)性有機(jī)物的制備及長(zhǎng)期穩(wěn)定保存的技術(shù)難題；攻克了球狀微生物活菌定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的真空冷凍干燥技術(shù)難點(diǎn)；進(jìn)行了利用同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)量底泥中痕量多溴二苯醚、模擬組織液系統(tǒng)的驗(yàn)證等一系列研究。

項(xiàng)目搭建了標(biāo)準(zhǔn)級(jí)煙氣流量計(jì)量裝置，形成了從實(shí)驗(yàn)室到現(xiàn)場(chǎng)的煙氣流量量值傳遞能力，為現(xiàn)場(chǎng)煙氣流量計(jì)溯源校準(zhǔn)提供了有效手段；實(shí)現(xiàn)了氣體滴定方法，并通過“空氣中臭氧”第二輪國(guó)際關(guān)鍵比對(duì)BIPM QM K1(Cycle II)取得國(guó)際等效度；開發(fā)了微量原料轉(zhuǎn)移技術(shù)，使一次性完成千萬(wàn)倍氣體稀釋成為可能，利用此項(xiàng)技術(shù)研制出42組分揮發(fā)性有機(jī)物氣體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；環(huán)境空間輻射非固定波束傳輸機(jī)制和傳輸模式下基站功率通量密度評(píng)估方法的研究成果形成了標(biāo)準(zhǔn)文稿，提交至國(guó)際電工委員會(huì)，填補(bǔ)了相關(guān)領(lǐng)域空白。

在上述研究基礎(chǔ)上，項(xiàng)目建立了11套計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)裝置，制訂技術(shù)規(guī)范16項(xiàng)，研制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)89種，取得發(fā)明專利17項(xiàng)，形成示范基地及生產(chǎn)線9項(xiàng)。項(xiàng)目的完成對(duì)改善我國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域測(cè)量水平提供了有力的計(jì)量技術(shù)支持，初步建立了我國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)計(jì)量體系。

(科技部)

2021年全球小型/微型光譜儀市場(chǎng)將達(dá)3億美元

不久前，Research and Markets發(fā)布最新研究報(bào)告，報(bào)告內(nèi)容顯示，與整個(gè)分子光譜系統(tǒng)的市場(chǎng)增長(zhǎng)狀況相比，小型化光譜儀器的增長(zhǎng)速度更高。預(yù)計(jì)，2015～2021年之間，整個(gè)分子光譜市場(chǎng)年增長(zhǎng)率為7%，而小型/微型光譜儀的復(fù)合年增長(zhǎng)率將達(dá)11%，2021年市場(chǎng)將達(dá)3億美元。

小型/微型光譜儀，主要用于實(shí)驗(yàn)室之外的環(huán)境，比如工業(yè)在線、農(nóng)業(yè)或環(huán)境現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用，醫(yī)療應(yīng)用時(shí)的即時(shí)檢測(cè)，甚至是消費(fèi)類產(chǎn)品等設(shè)任何領(lǐng)域。隨著尺寸的減小，緊湊型光譜儀的使用更加方便，成本更低，響應(yīng)時(shí)間也更短。

然而，為了達(dá)到工業(yè)和消費(fèi)市場(chǎng)的需求，開發(fā)面向應(yīng)用的產(chǎn)品是至關(guān)重要的。其中，硬件并不是系統(tǒng)中唯一重要的部分，數(shù)據(jù)處理、數(shù)據(jù)解析、人機(jī)交互界面、產(chǎn)品設(shè)計(jì)等方面的要求也很高，尤其是這些產(chǎn)品的用戶并非光譜專家。

報(bào)告中，預(yù)計(jì)將呈現(xiàn)高增長(zhǎng)的市場(chǎng)包括：醫(yī)藥QA/QC、食品和飲料、農(nóng)業(yè)、環(huán)境檢測(cè)、醫(yī)療POC和消費(fèi)者應(yīng)用(智能手機(jī)光譜、食品測(cè)試等)。

要很好的滿足這些領(lǐng)域的應(yīng)用，一些技術(shù)上的突破是必要的，最近的研究就利用了MEMS(微機(jī)電系統(tǒng))、MOEMS(微光機(jī)電系統(tǒng))、微鏡陣列、線性漸變?yōu)V光片、集成光子等新的技術(shù)，從而降低光譜分析儀的成本和尺寸，同時(shí)提高了性能，增強(qiáng)抗造性和產(chǎn)量。

(儀器信息網(wǎng))

Determination of 11 Kinds of Fluorescent Whitening Agents in Paper Food Contact Materials by High Performance Liquid Chromatography

Han Xiaoou, Li Yansheng, Chen Xi, Gao Yan， Jiang Hanshuo
(Liaoning Provincial Center for Disease Control and Prevention, Shenyang 110005, China)

O657.7

A

1008-6145(2017)03-0036-05

10.3969/j.issn.1008-6145.2017.03.009

聯(lián)系人：姜漢碩；E-mail: ganghs2001@163.com

2017-04-18