超聲波對(duì)肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠化學(xué)作用力與保水性的影響

王靜宇，楊玉玲，康大成，湯曉智，張興，馬云，倪文溪

（1南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210023；2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院/江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心,南京 210095）

超聲波對(duì)肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠化學(xué)作用力與保水性的影響

王靜宇1，楊玉玲1，康大成2，湯曉智1，張興1，馬云1，倪文溪1

（1南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210023；2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院/江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心,南京 210095）

【目的】研究超聲波對(duì)肌原纖維蛋白凝膠化學(xué)作用力與保水性的影響，并探討化學(xué)作用力與保水性之間的內(nèi)在聯(lián)系。【方法】取活A(yù)A雞屠宰，提取肌原纖維蛋白（myofibrillar proteins，MP），用不同超聲時(shí)間處理MP并制成熱誘導(dǎo)凝膠，運(yùn)用凝膠中總巰基含量的變化來(lái)反應(yīng)二硫鍵的形成；凝膠的表面疏水性S0和Zeta電位值來(lái)表征疏水作用力和靜電斥力；用拉曼光譜的I850/I830比值大小反映凝膠氫鍵的變化；凝膠保水性用高速離心機(jī)測(cè)定?！窘Y(jié)果】超聲波處理0—6 min時(shí)，MP凝膠的總巰基含量隨時(shí)間的增加而減少，活性巰基含量顯著增加；處理6—15 min時(shí)，MP凝膠的總巰基以及活性巰基均隨時(shí)間延長(zhǎng)而顯著減少，而對(duì)MP原料進(jìn)行同樣處理時(shí)，處理時(shí)間在0—6 min內(nèi)，MP總巰基和活性巰基變化趨勢(shì)與MP凝膠相同；超過(guò)9 min后，活性巰基和總巰基沒(méi)有顯著變化，且二者含量逐漸接近。表明短時(shí)間超聲波處理促進(jìn)了MP分子內(nèi)部巰基轉(zhuǎn)變成二硫鍵，長(zhǎng)時(shí)間超聲波處理和加熱成膠的共同作用促進(jìn)了活性巰基轉(zhuǎn)變成二硫鍵。MP凝膠的表面疏水性先隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)從1 194.1顯著上升到1 489.5（6 min），隨后逐漸降至1 230.8，表明超聲波產(chǎn)生的空穴效應(yīng)能夠使MP分子內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露到分子表面，但超過(guò)6 min后，增加的蛋白表面疏水性又被包裹在凝膠網(wǎng)絡(luò)中。MP凝膠的Zeta電位絕對(duì)值隨超聲時(shí)間的增加從6.03顯著增加到7.68（P＜0.05），超過(guò)6 min后顯著減少，表明超聲波處理使MP分子逐漸展開，蛋白質(zhì)分子間靜電作用增強(qiáng)，但過(guò)度展開后對(duì)其形成凝膠的靜電作用力不利。適度的超聲時(shí)間（0—6 min）使MP凝膠的歸一化強(qiáng)度I850/I830比值從0.9805增加至1.023（P＜0.05），表明MP與水分子形成的“蛋白-水分子”氫鍵增多，6 min過(guò)后比值減少，蛋白與水分子之間的氫鍵減弱；超聲波處理0—6 min后的MP凝膠保水性從47.5899%快速升至72.9855%（6 min）（P＜0.05），之后隨時(shí)間延長(zhǎng)，凝膠的保水性減少至44.356%。相關(guān)性分析結(jié)果表明，保水性與總巰基的相關(guān)性不大（P＞0.05），與活性巰基顯著相關(guān)（P＜0.05），與表面疏水性、電位絕對(duì)值和氫鍵都極顯著相關(guān)（P＜0.01）。【結(jié)論】超聲波顯著影響肌原纖維蛋白凝膠化學(xué)作用力與保水性；疏水作用力、靜電斥力和氫鍵是決定保水性的主要作用力，而二硫鍵次之；超聲波處理時(shí)間為6 min時(shí)為最優(yōu)條件，在此條件下，凝膠的疏水作用力、氫鍵和靜電斥力均達(dá)到最大，致使凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)均勻致密，能最大限度的保留水分。

肌原纖維蛋白凝膠；二硫鍵；疏水作用力；靜電斥力；氫鍵；保水性

0 引言

【研究意義】超聲波作為一種快速、高效并且可靠的新興技術(shù)，已經(jīng)在食品加工行業(yè)得到廣泛的應(yīng)用[1-2]，其所形成的空化效應(yīng)能夠產(chǎn)生高能量的作用力，包括剪切力、沖擊波和湍流作用，因此可以改變蛋白分子的功能特性[3]。保水性是肌原纖維蛋白（MP）熱誘導(dǎo)凝膠最重要的功能特性之一[4]。而MP熱誘導(dǎo)凝膠的功能特性（比如凝膠保水性）主要取決于化學(xué)作用力[5]。因此，研究超聲波對(duì)MP熱誘導(dǎo)凝膠的保水性與作用力關(guān)系的影響，探究保水性與化學(xué)作用力之間的關(guān)系以及最優(yōu)超聲波處理?xiàng)l件，不僅可以為超聲波處理在肌肉肉糜凝膠制品中的應(yīng)用提供技術(shù)參數(shù)和理論依據(jù)，而且對(duì)提高肉制品品質(zhì)也具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】JAMBRAK等[6]指出超聲能夠增加大豆蛋白的表面疏水性。LI等[7]發(fā)現(xiàn)超聲波能夠改變PSE（pale, soft and exudative）肉的功能特性，進(jìn)而改善凝膠的微觀結(jié)構(gòu)以及流變特性。HU等[8]通過(guò)對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行超聲波處理，發(fā)現(xiàn)其二硫鍵、表面疏水性、保水性都有增加。GULSEREN等[3]研究表明超聲作用乳清蛋白能夠顯著提高其溶解性并將其流變性改為剪切稀化流體。同時(shí)ZISU等[9]采用頻率為20 KHz，功率為400 W的超聲波能夠降低酪蛋白和乳清蛋白的粘性，增加其凝膠性。超聲波處理MP可以促進(jìn)其溶解，進(jìn)而可以提高肉制品的保水性、嫩度等功能特性[10-11]。ZHANG等[5]用拉曼光譜法測(cè)定了雞胸肉蛋白分子間的氫鍵?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)超聲波對(duì)肌原纖維蛋白凝膠中化學(xué)作用力與保水性共同影響的報(bào)道，也未見(jiàn)超聲波處理下保水性與化學(xué)作用力之間關(guān)系的報(bào)道，而開展此方面的研究能為超聲波處理在糜類肉制品中的應(yīng)用提供參考?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)控制超聲波處理?xiàng)l件處理MP，制成熱誘導(dǎo)凝膠后，研究超聲波處理時(shí)間對(duì)MP凝膠中化學(xué)作用力（二硫鍵、疏水作用力、靜電斥力和氫鍵）、凝膠保水性以及凝膠超微結(jié)構(gòu)的影響，探討超聲波處理?xiàng)l件下對(duì)MP凝膠作用力與保水性之間的內(nèi)在關(guān)系，尋找出最優(yōu)的超聲處理?xiàng)l件。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016年3—8月在南京財(cái)經(jīng)大學(xué)糧油質(zhì)量檢測(cè)工程技術(shù)研究中心進(jìn)行。

1.1 主要材料與試劑

重2.6 kg左右的活A(yù)A（Arbor Acres）雞30只，其中公雞和母雞各15只，購(gòu)于南京青龍山養(yǎng)雞場(chǎng)，屠宰后取雞胸肉，于-18℃下儲(chǔ)存,一個(gè)月內(nèi)使用。牛血清蛋白（Bovine SerumAlbumin，BSA）購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；DS-1高速組織搗碎機(jī)，上海標(biāo)本模型廠；PHS-3C型pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Avanti J-26XP高效冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter公司；NMI20-Analyst低場(chǎng)核磁共振儀，上海紐邁電子科技有限公司；U-3900紫外分光光度儀，日本日立公司；F-7000熒光光譜儀，日本日立公司；Zeta電位分析儀（Zetasizer Malvern Nano ZS90），英國(guó)馬爾文公司； LABRAM 800型激光拉曼光譜儀，法國(guó)Jobin Yvon公司；日本TM 3000掃描電鏡，日本日立公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取 雞胸肉于4℃下解凍20 min，剔除結(jié)締組織和脂肪，切碎后稱取40 g用于提取雞胸肉肌原纖維蛋白，蛋白提取和濃度測(cè)定方法參考楊玉玲等[12]，4℃下保存。

1.3.2 MP的超聲波處理以及凝膠的制備 將MP用磷酸鹽緩沖液（10 mmol·L-1KH2PO4、0.6 mol·L-1KCI，pH 6.0）溶解，分別稀釋至質(zhì)量濃度40、30和0.5 mg·mL-1的MP溶液，取20 mL該溶液于50 mL離心管中，并將其放在裝有碎冰的燒杯中，一起置于超聲波細(xì)胞破碎儀中（超聲探頭為頻率20 KHz，直徑6 mm的鈦金屬探頭），設(shè)置超聲時(shí)間為0、3、6、9、12和15 min（工作時(shí)間和間歇時(shí)間分別為1 s和3 s），超聲功率設(shè)為240 W，加碎冰控制樣品溫度為4—8℃，處理后的樣品于0—4℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存?zhèn)溆茫幚矸椒▍⒄語(yǔ)HAO等[13]，且稍做改動(dòng)。

超聲波處理后的樣品置于水浴鍋中從20℃程序升溫至65℃（1℃·min-1）制成凝膠，保溫20 min，取出，冷卻至室溫，凝膠在4℃下保存9—16 h，制備30 mg·mL-1不同超聲波處理的MP凝膠用于保水性、低場(chǎng)核磁共振測(cè)試和凝膠微觀結(jié)構(gòu)的測(cè)定，0.5 mg·mL-1MP凝膠用于巰基、表面疏水性和Zeta電位的測(cè)定，40 mg·mL-1MP凝膠用于拉曼光譜測(cè)定氫鍵。

1.3.3 巰基含量的測(cè)試 采用LIU等[14]的方法測(cè)定MP及MP凝膠樣品的總巰基和活性巰基含量?？値€基含量的測(cè)定：取0.5 mg·mL-1MP樣品0.5 mL，加入到4.5 mL的緩沖液中（8 mol·L-1尿素、0.01 mol·L-1EDTA、0.1 mol·L-1KH2PO4，pH 6.0），再加入100 μL Ellman試劑（0.01 mol·L-1DTNB、0.01 mol·L-1KH2PO4，pH 6.0）,旋渦震蕩1 min，充分混合，靜置25 min，于412 nm下測(cè)定吸光值，消光系數(shù)為13 600 M-1·cm-1；活性巰基含量的測(cè)定：取0.5 mg·mL-1MP樣品0.5 mL，加入到4.5 mL的緩沖液中（0.01 mol·L-1EDTA、0.1 mol·L-1KH2PO4，pH 6.0），再加入100 μL Ellman試劑（0.01 mol·L-1DTNB、0.01 mol·L-1KH2PO4，pH 6.0）,旋渦震蕩1 min，充分混合，靜置25 min，于412 nm下測(cè)定吸光值，消光系數(shù)為13 600 M-1·cm-1。

1.3.4 疏水作用力的測(cè)定 取0.5 mg·mL-1MP及MP凝膠樣品，稀釋成一系列濃度（0.5 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.125 mg·mL-1、0.0625 mg·mL-1）。每個(gè)濃度取5 mL，加入25 μL緩沖液（8 mmol·L-1ANS、0.1 mol·L-1KH2PO4，pH 6.0），混勻，黑暗中靜置20 min后用于測(cè)定表面疏水性。熒光分光光度計(jì)的激發(fā)波長(zhǎng)為374 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為485 nm。以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白濃度作曲線，曲線初始階段的斜率即為蛋白質(zhì)的表面疏水性指標(biāo)（S0-ANS）。

1.3.5 靜電斥力的測(cè)定 將0.5 mg·mL-1MP及MP凝膠樣品注入Zeta電位皿后，加塞，進(jìn)行電位測(cè)試。測(cè)試參數(shù)：散射角90°，平衡時(shí)間60 s，測(cè)試溫度25℃。

1.3.6 氫鍵的測(cè)定 將制備好的40 mg·mL-1凝膠樣品置于載玻片上，調(diào)節(jié)好焦距后直接用激光拉曼光譜儀進(jìn)行測(cè)量，測(cè)試參數(shù)：激光出射功率10 mM；激發(fā)波長(zhǎng)514.5 nm；顯微物鏡50倍長(zhǎng)焦距；狹縫200 μm；積分時(shí)間30 s；光柵600。I850/I830比值可以反映酪氨酸殘基苯環(huán)上-OH是與溶劑水分子生成氫鍵（“暴露”式）還是與蛋白質(zhì)分子其他基團(tuán)（如-COOH）生成氫鍵（“包埋”式）。公式：N包埋+N暴露=1，0.5 N包埋+ 1.25 N暴露=I850/I830，因此，可以計(jì)算出酪氨酸殘基“埋藏”式和“暴露”式的摩爾分?jǐn)?shù)[15]。

1.3.7 保水性的測(cè)定 保水性（water holding capacity，WHC）通過(guò)KOCHER等[16]的離心法測(cè)定。將制備好的凝膠稱重后于4℃下10 000×g離心10 min，去除上清液。記錄空離心管的重量以及離心后離心管與凝膠的總重量。每個(gè)樣品重復(fù)3次。WHC（%）=（W2-W）/（W1-W）×100。式中，W為離心管質(zhì)量；W2為離心后質(zhì)量；W1為離心前質(zhì)量。

1.3.8 水分子弛豫特性 采用低場(chǎng)核磁共振法測(cè)定。將2 mL MP凝膠放入直徑15 mm的核磁管中，之后放入核磁共振分析儀，進(jìn)行低場(chǎng)核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）測(cè)試。測(cè)試條件：質(zhì)子共振頻率為19 MHz，磁場(chǎng)強(qiáng)度為（0.5±0.08）T，測(cè)量溫度為32℃，90°脈寬13 μs，180°脈寬25 μs，回波次數(shù)12 000，等待時(shí)間1 500 ms，采樣頻率200 KHz，模擬增益20 db，累加次數(shù)為4次。自旋-自旋弛豫時(shí)間T2用CPMG序列進(jìn)行測(cè)量[17-18]。T2b、T21和T22是3種水分的弛豫時(shí)間，PT2b、PT21和PT22是相應(yīng)的峰面積百分比，即各水分的百分比。PT2b反映的是與大分子物質(zhì)緊密結(jié)合的水分[19]，PT21反映的是束縛在凝膠網(wǎng)絡(luò)里的水分，PT22反映的是凝膠中的自由水[20]。

1.3.9 微觀結(jié)構(gòu)的測(cè)定 MP凝膠的微觀結(jié)構(gòu)用掃描電鏡（scanning electron microscopy，SEM）測(cè)定，將制備的凝膠切成5 mm厚的小塊，用3%的戊二醛固定2 h，然后用緩沖液（0.1 mol·L-1KH2PO4，pH 6.0）清洗1 h，再進(jìn)行不同梯度的乙醇脫水（50%、70%、 90%、95%和100%），每次30 min, 再用叔丁醇置換3次，-20℃預(yù)凍2 d，-70℃冷凍干燥72 h，噴金鍍膜后用SEM觀察微觀結(jié)構(gòu)，加速電壓15 kV。

圖1 超聲波處理對(duì)肌原纖維蛋白和肌原纖維蛋白凝膠巰基含量的影響Fig. 1 Effect of ultrasound treatment on sulfhydryl group content of MP and MP gel

1.3.10 統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS17.0軟件相關(guān)性分析和方差分析，若方差分析效應(yīng)顯著則用Duncan multiple range test進(jìn)行多重比較（P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 巰基含量

如圖1所示，在0—6 min內(nèi)，MP總巰基的含量隨著超聲時(shí)間的增加而顯著減少（P＜0.05），活性巰基顯著增加；超聲時(shí)間超過(guò)6 min后，二者變化趨勢(shì)逐漸變緩；超過(guò)9 min后活性巰基和總巰基均沒(méi)有顯著變化?？値€基含量指暴露在蛋白表面和埋藏在蛋白分子內(nèi)的巰基，而活性巰基指暴露在蛋白分子表面的巰基[21]?？値€基含量減少代表二硫鍵的生成[10]。由此可見(jiàn)，超聲波處理破壞了蛋白的結(jié)構(gòu)，隨超聲波處理時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白分子逐漸展開，內(nèi)部巰基逐漸暴露，使活性巰基含量達(dá)到最大并促進(jìn)MP分子內(nèi)部的巰基形成二硫鍵。

與MP原料總巰基含量相比，MP熱誘導(dǎo)凝膠的總巰基含量隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)而顯著降低，活性巰基含量隨超聲時(shí)間的增加呈先上升后下降，在處理6 min時(shí)活性巰基含量最高，這說(shuō)明加熱成膠過(guò)程為二硫鍵的形成提供了充分能量，促使活性巰基也生成了二硫鍵，并且超聲波處理時(shí)間越長(zhǎng)，在加熱過(guò)程中活性巰基越容易轉(zhuǎn)變成二硫鍵。這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間超聲波處理為活性巰基提供了更多能量，使之處于高能狀態(tài)，從而降低了活性巰基轉(zhuǎn)變成二硫鍵的活化能。

2.2 疏水作用力

如圖2所示, 超聲波處理3 min后，MP樣品的表面疏水性急劇增加（P＜0.05），表明在超聲處理之前，很多疏水基團(tuán)都包埋在蛋白分子內(nèi)部，超聲波的空穴效應(yīng)以及微束流能夠?qū)⑦@些基團(tuán)暴露出來(lái)。與MP樣品表面疏水性對(duì)比可知，MP熱誘導(dǎo)凝膠表面疏水性更大，在0—6 min，隨超聲波處理時(shí)間增加，MP凝膠表面疏水性急劇增加（P＜0.05），且6 min 時(shí)表面疏水性最大為1 489.5。超過(guò)6 min后開始急劇下降，最終趨于平緩。說(shuō)明隨著超聲波處理時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)展開程度增加，疏水基團(tuán)逐漸暴露，但超過(guò)6 min后增加的蛋白表面疏水性并沒(méi)有轉(zhuǎn)化成熱誘導(dǎo)凝膠的疏水作用力，而是又被包裹在凝膠網(wǎng)絡(luò)中。

圖2 超聲波處理對(duì)肌原纖維蛋白和肌原纖維蛋白凝膠表面疏水性影響Fig. 2 Effect of ultrasound treatment on surface hydrophobicity of MP and MP gel

2.3 靜電斥力

如圖3所示，MP的電位全是負(fù)值，說(shuō)明蛋白表面負(fù)電荷要比正電荷多，凈電荷為負(fù)電荷。超聲波處理后MP的Zeta電位絕對(duì)值逐漸增大，表明蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷逐漸增加，蛋白質(zhì)展開程度增加。經(jīng)超聲波熱處理凝膠化后，MP凝膠Zeta電位的絕對(duì)值先從6.03 mV（0 min）迅速增加到7.67 mV（6 min）后又急劇降至6.13 mV（15 min），而且在處理6 min之前，MP凝膠的電位絕對(duì)值顯著高于MP的電位值。因此，超聲時(shí)間處理不足6 min時(shí)，MP分子的適度展開能提高凝膠的靜電斥力，但過(guò)度展開導(dǎo)致其熱誘導(dǎo)凝膠的靜電斥力迅速降低。

圖3 超聲波處理對(duì)肌原纖維蛋白和肌原纖維蛋白凝膠Zeta電位的影響Fig. 3 Effect of ultrasound treatment on zeta potential of MP and MP gel

2.4 氫鍵

對(duì)I850/I830結(jié)果利用1.3.6中的公式進(jìn)行計(jì)算得表1，N暴露呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，N暴露從0.6406（0 min）增加到0.6973（6 min），說(shuō)明蛋白分子上的酪氨酸酚羥基暴露增加，即在水環(huán)境中與水分子形成更多的氫鍵。而N包埋從0.34（9 min）增加到0.3427（15 min），表明越來(lái)越多的酪氨酸酚羥基被包埋在蛋白質(zhì)的疏水微環(huán)境中，與其他蛋白質(zhì)分子形成的氫鍵更多。由此可以看出超聲波處理時(shí)間為6 min時(shí)MP凝膠分子與水分子形成的氫鍵最多。

表1 超聲處理對(duì)MP凝膠“暴露”式和“埋藏”式酪氨酸殘基摩爾分?jǐn)?shù)的影響Table 1 Effect of ultrasound treatment on molar fractions ofexposed and buried tyrosine residues of MP gel

2.5 保水性

隨著超聲時(shí)間的增加，MP凝膠的保水性從47.5899%（0 min）快速升至72.9855%（6 min），而后快速降到49.4235%（9 min），再逐漸降至44.356%（15 min）（圖4-A），這表明短時(shí)間超聲波處理（0—6 min）可以顯著增強(qiáng)凝膠的保水性，并且處理6 min時(shí)的凝膠具有最高保水性，較長(zhǎng)時(shí)間超聲波處理（6—15 min）會(huì)降低凝膠的保水性。這一變化趨勢(shì)與凝膠的疏水作用力、靜電斥力、氫鍵的變化趨勢(shì)一致（圖2、圖3和表1中的凝膠部分）。

圖4 超聲波處理對(duì)肌原纖維蛋白凝膠保水性（A）、各水分馳豫時(shí)間（B）和各水分比例（C）的影響Fig. 4 Effect of ultrasound treatment on water holding capacity (WHC) (A), relaxation time of T2b, T21, T22(B) and proportions of different kinds of water (C) of MP gel

如圖4-B所示，超聲波熱處理MP后使結(jié)合水（T2b）顯著下降（P＜0.01），說(shuō)明超聲波處理后形成凝膠的這部分水結(jié)合的更加緊密，水分子的移動(dòng)性降低。束縛水（T21）的變化不是很明顯（P＞0.05），而自由水（T22）顯著增加（P＜0.01），說(shuō)明自由水的移動(dòng)性更強(qiáng)。圖4-C為這3種水分各占的百分比，隨著超聲時(shí)間的增加，結(jié)合水（PT2b）的比例從0.611%（0 min）增至0.86%（15 min），表明更多的水分子與蛋白質(zhì)結(jié)合，但因?yàn)槠湔伎偡迕娣e的百分比很?。ú蛔?%），因此，保水性的變化與此成分關(guān)系不大。束縛水（PT21）從81.7796%（0 min）增至94.484%（6 min），之后又降至89.739%（15 min），表明短時(shí)間超聲波處理（≤6 min）會(huì)使更多的水分被束縛在凝膠網(wǎng)絡(luò)中，可能凝膠保水性的改善為這部分水。自由水（PT22）從18.1593%（0 min）降至5.4637%（6 min），之后又升至10.175%（15 min），表明更多的自由水留在了凝膠網(wǎng)絡(luò)里，而超聲處理6 min以后，自由水又逐漸增加，可能是由于長(zhǎng)時(shí)間的超聲波處理破壞了均勻的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

2.6 相關(guān)性分析

由表2可知，MP凝膠的保水性與總巰基的相關(guān)性不大（P＞0.05），與活性巰基顯著相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)為0.835，因此二硫鍵對(duì)凝膠保水性的影響可能比較復(fù)雜，需要進(jìn)一步的分析才能正確判斷。保水性與表面疏水性、電位絕對(duì)值和氫鍵之間均呈極顯著相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.938、0.954、0.926，表明疏水相互作用、靜電相互作用和氫鍵是決定凝膠保水性的主要作用力。

2.7 微觀結(jié)構(gòu)

超聲波處理后的MP凝膠空間結(jié)構(gòu)與未處理的樣品相比，結(jié)構(gòu)變得更加致密均勻，網(wǎng)孔更小（圖5）。經(jīng)過(guò)超聲3 min處理后，網(wǎng)絡(luò)凝膠結(jié)構(gòu)變化不是很多，但是較未處理的凝膠相比，網(wǎng)孔變小，初步有了較好的凝膠。6 min處理后的凝膠網(wǎng)絡(luò)細(xì)膩，孔徑小且分布均勻，呈現(xiàn)蜂窩狀膠束，蛋白分子間的相互作用達(dá)到較好的平衡。當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到9 min及以上時(shí)，均勻的凝膠結(jié)構(gòu)遭到破壞，凝膠網(wǎng)孔變大，且不均勻，蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得粗糙。

3 討論

凝膠形成是蛋白質(zhì)分子內(nèi)部鄰近肽鏈之間引力和斥力平衡的結(jié)果，斥力由蛋白表面凈電荷提供，而引力是由疏水作用力、氫鍵等共同提供的。共價(jià)鍵二硫鍵在MP凝膠中的作用說(shuō)法不一。SMYTH等[22]認(rèn)為肌球蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)形成交聯(lián)的作用力是巰基受熱作用形成的二硫鍵。WANG等[23]給出了不同的觀點(diǎn)，認(rèn)為二硫鍵形成不是凝膠形成的前提，僅僅增加網(wǎng)絡(luò)中多肽的平均分子量，增加鏈的長(zhǎng)度。在研究二硫鍵時(shí)，一般用總巰基含量減少表示二硫鍵的形成。ZHANG等[10]指出超聲波能夠使水分子解離出高活性的自由基（H2O→·H+·OH），進(jìn)而反應(yīng)生成的過(guò)氧化氫很容易把蛋白質(zhì)中的巰基氧化成二硫鍵，總巰基減少。FEMANDEZ-DIAZ等[24]指出脈沖電場(chǎng)能夠使卵清蛋白分子打開，從而使內(nèi)部的巰基暴露出來(lái)。還有文獻(xiàn)指出超聲波能夠使活性巰基增多[25-26]。這些變化趨勢(shì)與本試驗(yàn)MP原料的巰基變化趨勢(shì)一致。本試驗(yàn)中MP熱誘導(dǎo)凝膠的總巰基含量隨超聲時(shí)間的增加而減少，而活性巰基先增加后減小。通過(guò)與MP原料的指標(biāo)相比較，發(fā)現(xiàn)超聲波處理破壞了蛋白的結(jié)構(gòu)，使蛋白分子展開并暴露出更多的活性巰基，并促進(jìn)了MP分子內(nèi)部巰基轉(zhuǎn)變成二硫鍵。但以往的文獻(xiàn)都不能解釋在超聲波處理超過(guò)6 min后，隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，活性巰基在原料中一直含量較高，但在凝膠中逐漸降低的現(xiàn)象。對(duì)任意一個(gè)化學(xué)反應(yīng)而言，影響化學(xué)反應(yīng)速度的因素取決于3個(gè)因子，即擴(kuò)散因子、碰撞頻率因子和活化能，超聲波作用提高了MP分子的擴(kuò)散性和碰撞頻率，但MP的活性巰基并沒(méi)有轉(zhuǎn)化成二硫鍵。因此，本研究認(rèn)為，這種現(xiàn)象的發(fā)生是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間超聲波處理為活性巰基提供了更多能量，使其處于高能

狀態(tài)，而降低了活性巰基轉(zhuǎn)變成二硫鍵的活化能；同時(shí)在熱誘導(dǎo)凝膠形成的過(guò)程中，蛋白質(zhì)分子鏈相互靠近，高能態(tài)的活性巰基在熱的作用下轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)鏈間的二硫鍵，因此，長(zhǎng)時(shí)間強(qiáng)超聲波處理與加熱共同作用促使MP分子間二硫鍵的形成。

表2 保水性與MP凝膠化學(xué)作用力之間的相關(guān)性

圖5 超聲波處理對(duì)肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響（電鏡照片2000倍）Fig. 5 Effect of ultrasound treatment on microstructure (SEM micrographs at 2000×) of MP gel

疏水作用力、靜電作用力和氫鍵為凝膠中的非共價(jià)鍵作用力。目前幾乎沒(méi)有關(guān)于超聲波處理對(duì)MP凝膠非共價(jià)鍵作用力影響的報(bào)道。疏水作用力可以用其表面疏水性來(lái)衡量，后者能反映蛋白質(zhì)分子微觀構(gòu)象的變化[27]。并可以用熒光分光光度法進(jìn)行測(cè)定[28]。Zeta電位是帶電顆粒表面剪切層的電位，可用于描述蛋白顆粒之間的靜電斥力[29-30]。HANAOR等[31]認(rèn)為Zeta電位高的膠粒之間是靜電穩(wěn)定的，容易形成穩(wěn)定的分散體系。拉曼光譜可用于檢測(cè)蛋白質(zhì)凝膠中的氫鍵，它是基于酪氨酸殘基上含有羥基，是形成氫鍵的重要基團(tuán)，酪氨酸殘基在850 cm-1和830 cm-1附近的兩個(gè)譜峰，是對(duì)取代苯環(huán)呼吸振動(dòng)和面外呼吸振動(dòng)之間的費(fèi)米共振產(chǎn)生的，其I850/I830比值的變化情況可以反映MP凝膠中氫鍵變化[5]。本試驗(yàn)中，原料MP的表面疏水性和Zeta電位值均隨處理時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加到最大值。而經(jīng)短時(shí)間超聲波處理（≤6 min）MP形成的熱誘導(dǎo)凝膠的表面疏水性、Zeta電位值和I850/I830歸一化強(qiáng)度都隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，并都在6 min時(shí)達(dá)到最大值，之后又都逐漸下降。這是由于超聲波處理能夠破壞蛋白聚集體，并使蛋白質(zhì)分子鏈逐漸展開，暴露更多的疏水基團(tuán)、帶電基團(tuán)和羥基等極性基團(tuán)，因此，MP原料的這些指標(biāo)隨處理時(shí)間增強(qiáng)而增加，短時(shí)間超聲波處理的MP熱誘導(dǎo)凝膠的疏水作用力、靜電斥力和氫鍵也因此逐漸增加。長(zhǎng)時(shí)間處理的MP在加熱形成凝膠的過(guò)程中，有大量的鏈間二硫鍵形成，限制了蛋白質(zhì)分子鏈的伸展和有序排列，導(dǎo)致其各種功能基團(tuán)被包埋在蛋白質(zhì)顆粒和凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部，因此，隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，凝膠的各種非共價(jià)鍵作用力均逐漸減弱。HU等[8]指出大豆分離蛋白經(jīng)超聲波處理后，表面疏水性也顯著提高，這與MP原料的變化趨勢(shì)一致。

保水性是凝膠性質(zhì)中的一種重要性質(zhì)。離心法是測(cè)定凝膠保水性的常用方法，然而高速離心會(huì)破壞凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，所測(cè)得的保水值不能很好的反映出凝膠在完好狀態(tài)下的保水性。而低場(chǎng)核磁共振是一種無(wú)損的、非侵入式的測(cè)量高含水量樣品水分分布狀態(tài)和移動(dòng)性的工具[32]。所以能夠在不破壞凝膠結(jié)構(gòu)的情況下測(cè)定凝膠中各種水的可移動(dòng)性及各水分的比例，能夠較好地反映凝膠保水性[33-34]。凝膠中結(jié)合水（PT2b）面積均小于總峰面積的1%，其所占比例隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)而增加是因?yàn)镸P表面的電荷增加及其分子中極性基團(tuán)增多。凝膠網(wǎng)絡(luò)中束縛水（PT21）的比例最多，占總水分的80%以上，束縛水比例隨超聲時(shí)間增大的改變趨勢(shì)與離心法測(cè)定的保水性變化趨勢(shì)一致，表明凝膠中所保留的水分大多是束縛水。PEARCE等[35]認(rèn)為PT21的提高意味著MP外部水的增加，肉的保水性增加。

凝膠保水性的大小受其作用力影響。PUOLANNE等[4]指出蛋白質(zhì)凝膠中水分的保持，主要依靠水和蛋白質(zhì)之間的電荷相互作用、氫鍵以及毛細(xì)管作用。而KOHYAMA等[36]指出在熱誘導(dǎo)凝膠形成過(guò)程中，疏水作用力能形成更好的蛋白-蛋白聚集物，從而能夠促進(jìn)形成均一、致密結(jié)構(gòu)的凝膠，最終凝膠的保水性得到提高。OFFER等[37]指出在高靜電斥力條件下，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散、均勻，并且凈電荷增加意味著能結(jié)合水分子的氫鍵結(jié)合位點(diǎn)增加，從而使更多的水保留在凝膠中。本研究表明，MP凝膠的疏水作用力、靜電斥力以及氫鍵都與保水性極顯著相關(guān)。保水性增加原因之一是，隨著超聲時(shí)間增加，蛋白質(zhì)展開、形成這些作用力的疏水基團(tuán)、帶電基團(tuán)和極性基團(tuán)等均逐漸暴露，這些基團(tuán)分別通過(guò)疏水水合、偶極－離子、偶極－偶極3種形式與水分子發(fā)生作用，使凝膠中結(jié)合水含量增加，其中水與蛋白質(zhì)中COO-等帶電基團(tuán)的作用強(qiáng)度最大、水與-OH等極性基團(tuán)的作用次之，非極性基團(tuán)通過(guò)疏水水合作用固定的水分子最弱。另外的一個(gè)重要原因是，短時(shí)間的超聲處理使維持MP凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的靜電斥力與疏水作用力和氫鍵等引力在更高的水平上達(dá)到平衡，凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加均勻、致密、牢固，使更多的水分束縛在凝膠的網(wǎng)絡(luò)中，導(dǎo)致凝膠中的束縛水急劇增加。保水性降低是因?yàn)楫?dāng)?shù)鞍追肿颖砻鎯粝嗤姾奢^少時(shí)，蛋白分子間的靜電斥力降低，分子間相互接近并發(fā)生絮凝，形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中網(wǎng)孔變大，無(wú)法容納更多的水分；同時(shí)由于蛋白質(zhì)分子所帶的負(fù)電荷減少，蛋白質(zhì)與水分子間通過(guò)偶極－離子作用結(jié)合的水分子顯著減少。典型的實(shí)例是，在6 min時(shí)，MP凝膠的非共價(jià)鍵作用力最大，凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)也最均勻、致密、呈蜂窩狀，此時(shí)保水性也是最好的。SHARP等[38]指出呈現(xiàn)“蜂窩”狀結(jié)構(gòu)的凝膠網(wǎng)絡(luò)，可以容納更多的水分。長(zhǎng)時(shí)間超聲處理結(jié)果也可以同樣解釋。本研究還發(fā)現(xiàn)，超聲波處理通過(guò)改變MP凝膠中分子間二硫鍵的含量影響凝膠的保水性，超聲時(shí)間延長(zhǎng)，凝膠中分子間二硫鍵增加（即活性巰基減少）導(dǎo)致凝膠的保水性下降。

4 結(jié)論

短時(shí)間超聲波處理（0—6 min）促進(jìn)肌原纖維蛋白分子適度展開，顯著提高凝膠的疏水作用力和靜電斥力，并使凝膠中肌原纖維蛋白與水分子形成的氫鍵增多，凝膠的保水性逐漸增加。肌原纖維蛋白凝膠的疏水作用力、靜電斥力以及氫鍵都與保水性極顯著相關(guān)，超聲波處理時(shí)間為6 min時(shí)，凝膠的疏水作用力、氫鍵和靜電斥力均達(dá)到最大，凝膠中的引力和斥力在最高的水平上達(dá)到平衡，致使凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)均勻致密，能最大限度的保留水分。肌原纖維蛋白凝膠的保水性與與活性巰基顯著相關(guān)，說(shuō)明超聲波處理通過(guò)改變肌原纖維蛋白凝膠中分子間二硫鍵的含量影響凝膠的保水性，但其影響力比疏水相互作用、靜電相互作用和氫鍵要小。

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Effects of Ultrasound on Chemical Forces and Water Holding Capacity Study of Heat-Induced Myofibrillar Protein Gel

WANG JingYu1, YANG YuLing1, KANG DaCheng2, TANG XiaoZhi1, ZHANG Xing1, MA Yun1, NI WenXi1
(1College of Food Science and Engineering/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety/Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023;2College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University/Collaborative Innovation Center for Meat Production and Processing, Quality and Safety Control, Nanjing 210095 )

myofibrillar protein gel; disulfide bond ; hydrophobic force ; electrostatic repulsion; hydrogen bond; water holding capacity; microstructure

2016-10-31；接受日期：2017-02-10

國(guó)家自然科學(xué)基金（31371798）、江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

聯(lián)系方式：王靜宇，E-mail：jimixy8072@yeah.net。通信作者楊玉玲，E-mail：yulingy@sina.com

Abstract: 【Objective】 The influences of ultrasound on chemical forces and water holding capacity of myofibrillar protein (MP) gel were studied. The relationship between MP gel chemical forces and WHC was revealed.【Method】AA type broilers were slaughtered. The MP was extracted from breast muscle. The MP solution and heat induced gel in different ultrasound times were prepared. Total sulfhydryl group (SH) content changes of gel were used to reflect the formation of disulfide bond. Surface hydrophobicity and Zeta potential value of the gel were employed to present the hydrophobic interaction and electrostatic repulsion, respectively. The ratio of I850/I830was used to show the hydrogen bonding changes of gel. Water holding capacity (WHC) of MP gel was calculated by high-speed centrifuge.【Result】As the ultrasonic time (UT) increased (0-6 min), the total SH contents of the MP gel decreased and reactive SH content significantly increased, at stronger UT (6-15 min), the total SH and reactive SH contents all decreased. At short time (0-6 min), the changing trends of MP and MP gel about the total SH and reactive SH content were the same, while the total SH and reactive SH contents of MP all had no significant changes (P＞0.05) over 6 min, suggesting that UT promoted internal SH of MP into disulfide bond for shorter time, and UT and heating gel for longer time work together to promote reactive SH into disulfide bond. Surface hydrophobicity of MP gels increased from 1 194.1 to 1 489.5 (P＜0.05) and decreased from 1 489.5 to 1 230.8 at last, for the cavitation phenomenon induced by UT could bring the hydrophobic regions into the surface, while at UT＞6 min, the hydrophobic group was wrapped in the gel network. Zeta potential value of the gel changed from 6.03 to 7.68（P＜0.05）（0-6 min）, and then decreased over 6 min, which showed that ultrasonic wave made protein molecular chain unfolding, negatively charged by exposure, resulting in the stronger electrostatic repulsion, while excessive expansion of MP molecules were not conducive to the electrostatic force of the gel. After moderate UT (0-6 min), the normalized intensity of I850/I830ratio increased from 0.9805 to 1.023 (P＜0.05), which indicated that more phenolic hydroxyl groups of tyrosine were exposed to the aqueous environment, generating hydrogen bonds with water molecules, while the ratio decreased at UT＞6 min, hydrogen bonds between water molecules and protein were weaken. At UT ≤6 min, the WHC of samples increased sharply from 47.5899% to 72.9855% (6 min) (P＜0.05), while at 9 min and above, WHC dropped gradually to 44.356%. Results of the correlation analysis showed that WHC of MP gel was unrelated to total SH content (P＞0.05) and was significantly related to reactive SH content (P＜0.05) and had a significantly correlation with Zeta potential absolute value, the surface hydrophobicity and hydrogen bonding (P＜0.01).【Conclusion】Ultrasound has significant impacts on both chemical forces and water holding capacity of the MP gel. Hydrophobic force, electrostatic repulsion and hydrogen bonding play important roles in holding water in MP gels, disulfide bonds not. Thus a value of 6 min is the optimum time for the water holding capacity of MP gel, under this condition, hydrophobic force, hydrogen bonding and electrostatic repulsion of the gel are maximum, resulting in the gel network structure of uniform density, and retaining water at best.