HPLC波長切換法同時測定寶寶樂中四種成分的含量

沈 健，張誠賢

HPLC波長切換法同時測定寶寶樂中四種成分的含量

沈 健1，張誠賢2

目的 建立HPLC波長切換法同時測定寶寶樂中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素的含量。方法 采用Venusil MP C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，進行梯度洗脫，檢測波長分別為230 nm(芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷)和254 nm(毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素)，流速0.9 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量為10 μL。結(jié)果 芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素4個成分的質(zhì)量濃度分別在4.18～83.60 μg/mL(r=0.999 8)、5.14～102.80 μg/mL(r=0.999 5)、5.60～112.00 μg/mL(r=0.999 9)、4.72～94.40 μg/mL(r=0.999 3)范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；平均加樣回收率及相應的RSD分別為99.66%(0.96%)、98.17%(1.39%)、97.00%(1.48%)、99.92%(0.58%)；精密度良好，RSD≤1.06%；重復性良好，RSD≤1.69%。供試品溶液在室溫條件下12 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD≤1.12%。結(jié)論 所建立的方法靈敏度高、快速、專屬性好、準確度高，為寶寶樂的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

寶寶樂；芍藥內(nèi)酯苷；芍藥苷；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；芒柄花素；波長切換法；梯度洗脫

0 引言

寶寶樂由白芍、黃芪(蜜炙)、大棗、桂枝、干姜、山楂(炒)、六神曲(焦)、麥芽等8味中藥材加工而成的中成藥顆粒劑，具有溫中補虛、和里緩急、開胃消食的功效，白芍[1]為方中君藥，味苦、酸，微寒，養(yǎng)血斂陰，柔肝止痛，平肝陽，其主要成分為氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷；黃芪[1]味甘性微溫，補齊固表，托瘡生肌，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素為黃芪的有效成分。寶寶樂主要用于脾胃虛寒、脘腹隱痛、喜溫喜按、胃納不香、食少便溏等癥狀的治療。

寶寶樂標準收載于《衛(wèi)生部頒藥品標準》中藥成方制劑第七冊，是一種兒童常用藥物，服用方便，其現(xiàn)行標準僅規(guī)定了制法、性狀及沖劑的通則檢查項，對所含成分未進行定量檢測研究[2]，也未檢索到對該制劑多組分進行定量測定的文獻報道，難以全面有效地控制本品的質(zhì)量。多指標控制能更好地反映中成藥的質(zhì)量，本文對白芍的指標性成分芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷，黃芪的指標性成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素，采用HPLC波長切換法同時進行了測定，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1100系列四元梯度泵高效液相色譜儀[四元梯度泵、自動進樣器、柱恒溫箱、可變波長檢測器(VWD)](美國安捷倫公司)；BS423S型分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；KQ-500DE超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(111920-201505，含量97.1%)、芒柄花素對照品(111703-201504，含量100.0%)、芍藥苷對照品(110736-201640，含量95.2%)來源于中國食品藥品檢定研究院；芍藥內(nèi)酯苷對照品(39011-90-0，含量98.0%)來源于上海純優(yōu)生物科技有限公司。寶寶樂(5 g/袋，批號：615010、615016、616011)來源于河南宛東藥業(yè)有限公司；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Venusil MP C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)色譜柱；流動相A：乙腈，流動相B：0.1%磷酸溶液，梯度洗脫(0～12 min，15.0%A；12～23 min,15.0%A→22.0%A；23～32 min,22.0%A→38.0%A；32～40 min,38.0%A→15.0%A)；0～23 min時在230 nm[3]波長下檢測芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷，23～40 min在254 nm[4]波長下檢測毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素。流速：0.9 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素各適量，用甲醇分別制得芍藥內(nèi)酯苷0.418 mg/mL、芍藥苷0.514 mg/mL、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.560 mg/mL、芒柄花素0.472 mg/mL單一成分的對照品儲備溶液。再分別依次量取上述各對照品儲備液2.5、5.0、1.0、2.5 mL，置同一個量瓶中，用甲醇稀釋至50 mL，振搖均勻，即得試驗用混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取寶寶樂適量，研細，取約1.0 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加入甲醇45 mL，超聲處理30 min，放冷，再用甲醇稀釋至刻度，振搖均勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按寶寶樂質(zhì)量標準項下的處方工藝，分別制備不含白芍的陰性樣品和不含黃芪的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制成白芍陰性樣品溶液和黃芪陰性樣品溶液。

2.3 專屬性考察 精密吸取“2.2.1～2.2.3”項下制備的4個溶液各適量，按上述色譜條件進行檢測。試驗結(jié)果表明，白芍陰性樣品溶液和黃芪陰性樣品溶液的色譜圖中，在所測芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素4個成分對應的位置無干擾，分離度均符合要求，理論塔板數(shù)均>2 500，色譜圖見圖1。

2.4 線性范圍考察 分別精密吸取“2.2.1”項下制備的對照品儲備液各0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于6個10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，振搖均勻，即得到6個系列濃度的混合對照品溶液，按照上述測定方法進行測定，采用質(zhì)量濃度X作為橫坐標，測得的峰面積Y作為縱坐標，進行線性回歸，回歸方程及線性范圍如表1所示。

圖1 色譜圖

所測組分回歸方程線性范圍(μg/mL)r芍藥內(nèi)酯苷Y=6.5726×105X+417.94.18～83.600.9998芍藥苷Y=9.1311×105X+181.25.14～102.800.9995毛蕊異黃酮葡萄糖苷Y=3.0413×105X-263.85.60～112.000.9999芒柄花素Y=7.0125×105X+448.04.72～94.400.9993

2.5 精密度考察 取混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，結(jié)果芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素峰面積的RSD(n=6)分別為0.92%、0.85%、1.06%和0.98%。

2.6 重復性考察 取寶寶樂樣品(批號：615010)6份，按“2.2.2”項下制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，分別計算芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素的含量，并計算芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素含量的RSD，結(jié)果所測4個組分的RSD依次為1.42%、1.37%、1.69%和1.34%。

2.7 穩(wěn)定性考察 取批號為615010寶寶樂樣品的同一供試品溶液，室溫下放置0、2、4、6、8、12 h，考察供試品溶液在室溫下儲存的穩(wěn)定性，按“2.1”項下色譜條件測定芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素的峰面積值，結(jié)果其RSD分別為1.01%、0.96%、1.12%、1.07%。結(jié)果顯示，供試品溶液自制備起，在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率考察 取批號為615010的寶寶樂樣品，研成細粉，取細粉6份，每份約0.5 g，精密稱定，分置不同的50 mL量瓶中，精密加入上述制備的混合對照品溶液25 mL、甲醇20 mL，采用超聲波超聲處理30 min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，振搖均勻，過濾，即得加樣回收樣品試液。按“2.1”項下色譜條件及上述檢測方法，計算芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素的回收率及RSD，結(jié)果其回收率分別為99.66%、98.17%、97.00%、99.92%，RSD分別為0.96%、1.39%、1.48%、0.58%。

2.9 樣品測定 取3批寶寶樂，按“2.2.2”項下制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件下進樣測定，結(jié)果見表2。

表2 含量測定結(jié)果(n=3,mg/g)

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇 在實驗過程中，筆者對不同的提取溶劑(50%甲醇、甲醇[5-6]、50%乙醇[7]、乙醇)進行了考察，以所測各組分芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素的提取率為指標，優(yōu)選最佳的提取溶劑。結(jié)果以甲醇為提取溶劑時，所測4個組分的提取率最佳。

3.2 流動相的選擇 本文分別考察了乙腈-水[4,8]、乙腈-0.2%乙酸溶液[9]、乙腈-0.02%磷酸溶液[5]、乙腈-0.1%磷酸溶液[10]等流動相體系，以所測各組分的分離效果、峰形等為指標，優(yōu)選最佳的流動相體系。結(jié)果以乙腈-水為流動相體系梯度洗脫時，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素能達到有效分離，但芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷分離效果不佳；以乙腈-0.2%乙酸溶液為流動相體系梯度洗脫時，芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷峰形較好，但芒柄花素與其他雜質(zhì)峰達不到有效分離；以乙腈-0.02%磷酸溶液為流動相體系梯度洗脫時，毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰形較差，存在拖尾現(xiàn)象；采用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相體系梯度洗脫時，基線較平穩(wěn)，所測各組分峰形較好，均能達到有效分離，故選取乙腈-0.1%磷酸溶液按照文中的梯度洗脫程序?qū)ι炙巸?nèi)酯苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素同時進行測定。

4 小結(jié)

本研究表明，本文所建立的HPLC波長切換聯(lián)合梯度洗脫法，操作簡便、準確，重復性好，能夠有效控制寶寶樂的質(zhì)量，確保臨床用藥的安全性和療效的一致性，為進一步完善寶寶樂的質(zhì)量標準提供了有力的數(shù)據(jù)支持。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:105,302-303.

[2] 中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.衛(wèi)生部頒藥品標準(中藥成方制劑第七冊)[S].北京:人民衛(wèi)生出版社,1993:103.

[3] 李偉銘,趙月然,楊燕云,等.HPLC波長切換法同時測定白芍飲片中9個成分的含量[J].藥物分析雜志,2011,31(12):2208-2212.

[4] 梁瑾,劉小花,任遠,等.HPLC-DAD-ELSD法同時測定黃芪中5個成分的含量[J].藥物分析雜志,2013,33(2):210-213.

[5] 歐金梅,吳德玲,金傳山,等.HPLC法同時測定白芍總苷中4種單萜苷的含量[J].中藥材,2013,36(3):423-425.

[6] 紀松崗,李翔,婁子洋,等.高效液相色譜法測定黃芪中毛蕊異黃酮苷和芒柄花素的含量[J].第二軍醫(yī)大學學報,2006,27(1):81-84.

[7] 劉金環(huán),楊玉琴,丁秦,等.HPLC法同時測定白芍藥材中芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷的含量[J].河南中醫(yī),2013,33(10):1796-1797.

[8] 王曉輝,劉濤,李清,等.高效液相色譜法同時測定黃芪中的五種異黃酮類成分[J].色譜,2006,24(5):486-488.

[9] 陸小云,楚楚,顏繼忠.超高效液相色譜法同時測定白芍中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量[J].中南藥學,2012,10(2):98-100.

[10]杜偉鋒,胡淑珍,吳芳,等.不同等級杭白芍中3個有效成分的考察[J].中成藥,2014,36(2):358-362.

Simultaneous determination of the content of four constituents in Baobaole by HPLC wavelength switching method

SHEN Jian1,ZHANG Cheng-xian2

(1.Huzhou Central Hospital,Huzhou 313000,China;2.Huzhou Institute for Food and Drug Control,Huzhou 313000,China)

Objective To develop an HPLC wavelength switching method for simultaneous determination of the content of alibiflorin,paeoniflorin,calycosin7-O-β-D-glucopyranoside and formononetin in Baobaole.Methods The Venusil MP C18(250 mm×4.6 mm,5.0 μm)chromatographic column was adopted;the mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution with gradient elution,at a flow rate of 0.9 mL/min.The detection wavelengths were 230 nm(determination of alibiflorin and paeoniflorin),and 254 nm(determination of calycosin7-O-β-D-glucopyranoside and formononetin).The column temperature was set at 30 ℃,and the sample quantity was 10 μL.Results The concentration of alibiflorin,paeoniflorin,calycosin7-O-β-D-glucopyranoside and formononetin was respectively 4.18～83.60 μg/mL(r=0.999 8),5.14～102.80 μg/mL(r=0.999 5),5.60～112.00 μg/mL(r=0.999 9) and 4.72～94.40 μg/mL(r=0.999 3).The average recoveries and the correspondingRSDwere 99.66%(0.96%),98.17%(1.39%),97.00%(1.48%) and 99.92%(0.58%),respectively.The precision was good,RSD≤1.06%;the repeatability was goodRSD≤1.69%.Test solution was stable at room temperature within 12 h,RSD≤1.12%.Conclusion The established method is rapid,with high sensitivity,good specificity and high accuracy,which can be applied to the quality control of Baobaole.

Baobaole;Alibiflorin;Paeoniflorin;Calycosin7-O-β-D-glucopyranoside;Formononetin;Wavelength switching method;Gradient elution

2016-09-30

1.湖州市中心醫(yī)院，浙江 湖州 313000；2.湖州市食品藥品檢驗研究院，浙江 湖州 313000

10.14053/j.cnki.ppcr.201705021