基于HPLC-TOF-MS代謝組學方法的溴鼠靈毒性作用評價

嚴慧，卓先義，沈保華，向平，沈敏

（司法部司法鑒定科學技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學重點實驗室上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務平臺，上海 200063）

基于HPLC-TOF-MS代謝組學方法的溴鼠靈毒性作用評價

嚴慧，卓先義，沈保華，向平，沈敏

（司法部司法鑒定科學技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學重點實驗室上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務平臺，上海 200063）

目的分析溴鼠靈中毒大鼠尿液的代謝特征，揭示溴鼠靈干預對大鼠毒性作用的分子機制。方法通過構(gòu)建大鼠溴鼠靈中毒模型，采用高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜（high performance liquid chromatographytime of flight mass spectrometry，HPLC-TOF-MS）獲取大鼠尿液代謝輪廓，并用正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）進行多變量統(tǒng)計分析，找出與溴鼠靈毒性作用密切相關(guān)的差異代謝物。結(jié)果OPLS-DA得分圖顯示給藥前后不同時間的大鼠尿液樣本代謝物軌跡在各時間段內(nèi)相似度較好，呈現(xiàn)各自聚類現(xiàn)象。比較溴鼠靈給藥前后大鼠尿液樣本，篩選出22個與溴鼠靈毒性相關(guān)的差異代謝物。結(jié)論溴鼠靈主要通過干擾大鼠體內(nèi)的三羧酸循環(huán)、糖酵解、鞘脂代謝和色氨酸代謝等代謝通路發(fā)揮毒性作用，且溴鼠靈毒性作用具有累積效應?；谀蛞篐PLC-TOF-MS代謝組學方法可為溴鼠靈毒性作用的分子機制研究提供新思路。

法醫(yī)毒理學；代謝組學；高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜；溴鼠靈；大鼠

溴鼠靈（brodifacoum），又名溴鼠隆、大隆、殺鼠隆、溴聯(lián)苯殺鼠萘、溴敵拿鼠，屬第二代抗凝血殺鼠劑。其分子式為C31H23BrO3，化學名為3-[3-（4’-溴聯(lián)苯-4-基）-1，2，3，4-四氫-1-萘基]-4-羥基香豆素，保留了第一代抗凝血殺鼠劑的4-羥基香豆素母核結(jié)構(gòu)，末端甲基被苯基取代，增加了親脂性，使生物半衰期和毒性增加[1-3]。因溴鼠靈具有殺鼠效果好、抗耐藥性佳等優(yōu)點被廣泛使用，同時也是國內(nèi)外引起中毒事件最多的抗凝血殺鼠劑之一[4，5]。溴鼠靈通過抑制維生素K環(huán)氧化物還原酶而切斷維生素K循環(huán)，使含有谷氨酸殘基的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ無法正常羧化，引起凝血功能障礙[6]。長期攝入溴鼠靈后即使使用特效解毒劑維生素K1進行治療，治療時間也需要八個月以上[7]。

由于溴鼠靈對已經(jīng)形成的凝血因子無抑制作用，須等這些凝血因子在體內(nèi)相對耗竭才能發(fā)揮作用，因此攝藥3～5d后才出現(xiàn)中毒癥狀。溴鼠靈中毒早期可發(fā)生惡心、嘔吐、腹痛，幾天后出現(xiàn)典型的抗凝血劑中毒癥狀，表現(xiàn)為血尿、鼻出血、齒齦出血、皮下出血等，重者可有咯血、嘔血、便血及其他重要器官出血，并發(fā)休克、昏迷，可死于腦出血、心肌出血[8]。由于溴鼠靈中毒潛伏期長，極具隱匿性，許多患者難以察覺溴鼠靈中毒這一事實，或是誤認為攝入藥物并未起作用、出現(xiàn)癥狀與攝藥無關(guān)，往往耽誤最佳治療時機；中毒癥狀又極易被誤診為疾病引起出血，例如典型的血尿中毒癥狀分析只局限于局部疾病，缺乏全身性疾病或中毒的考慮；此外有時影像學會對診斷有所誤導，例如超聲檢查時將血凝塊誤認為結(jié)石[9]。種種原因都會導致病情延誤甚至中毒者死亡，而在司法鑒定實踐中又易讓罪犯逍遙法外造成司法不公[10]。

盡管溴鼠靈是目前國內(nèi)使用最為廣泛的殺鼠劑，其中毒毒理學研究也有近四十年的歷史，但其毒性效應及作用機制至今尚未完全闡明。代謝組學研究致力于生物樣本中所有小分子代謝物的定性和定量測定，目前已成功應用于生理狀態(tài)評估、藥物安全評價、人類疾病診斷、藥物治療監(jiān)測領(lǐng)域[11]。由于采取的分析技術(shù)足夠靈敏，往往可以監(jiān)測到體液復雜混合物中的細微變化，已有大量文獻將代謝組學用于毒物肝毒性和腎毒性的評估[12，13]。

本研究以大鼠為實驗模型，采用基于高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-time of flight mass spectrometry，HPLC-TOFMS）代謝組學技術(shù)篩選和鑒定溴鼠靈中毒前后大鼠尿液差異代謝物，了解溴鼠靈多次給藥后大鼠尿液HPLC-TOF-MS代謝產(chǎn)物譜的改變，并研究其毒性損傷和作用機制，為溴鼠靈中毒的診斷和防治提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1290Infinity超高效液相色譜系統(tǒng)和6530四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀均購自美國Agilent公司。

HPLC級甲醇購自德國Merck公司，HPLC級乙腈購自美國Sigma公司，甲酸購自瑞士Fluka公司，超純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）制備，溴鼠靈藥液（0.5%）購自上海市衛(wèi)生害蟲防治公司。

1.2 動物實驗

清潔級雄性Wistar大鼠10只，體質(zhì)量為（200± 20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。大鼠飼養(yǎng)于晝夜交替（12h∶12h）的房間內(nèi)并給予標準飼料，控制室內(nèi)溫度為21℃～23℃，相對濕度40%左右，適應性喂養(yǎng)1周。每日9時許灌胃給藥1次，連續(xù)15d形成溴鼠靈中毒模型。前8d溴鼠靈給藥劑量為2.7μg/kg，后7d為13.5μg/kg。

將大鼠置于代謝籠，收集給藥前、給藥第8天、第15天24h尿液。在收集尿液的試管外置冰袋保持低溫。將尿液在4℃下，以離心半徑6cm，13000r/min，離心10min，取上清液保存在-80℃冰箱中，待測。

1.3 樣品預處理

將尿液置于室溫下融化，取100μL尿液樣品，加入300μL超純水，混旋后，在4℃下，以離心半徑6cm，13000r/min，離心10min，取上清液過濾膜（0.22μm），置于進樣小瓶用于HPLC-TOF-MS分析。

1.4 儀器分析條件

色譜柱為Acquity UPLC HSS T3色譜柱（美國Waters公司），柱溫40℃。流動相A為0.1%的甲酸水溶液，流動相B為0.1%的甲酸乙腈溶液，采用梯度洗脫，梯度程序設置如下：0～2min，2%B；2～17min，2%～95%B；17～19 min，95%B。平衡色譜柱5 min，流速350μL/min，進樣量為3μL。

質(zhì)譜為電噴霧離子源（ESI），采用正、負離子模式進行檢測。檢測參數(shù)：毛細管電壓4000V，干燥氣流速11L/min，干燥氣溫度350℃，噴霧氣壓0.3103MPa，碎裂電壓120 V，錐孔電壓60 V，數(shù)據(jù)采集范圍質(zhì)荷比（m/z）100～1000。選取m/z為121.0509和922.0098的內(nèi)標離子作實時質(zhì)量數(shù)校正。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Mass Profiler v B.02.00軟件（美國Agilent公司）對HPLC-TOF-MS采集的數(shù)據(jù)進行峰識別和峰匹配，獲得二維數(shù)據(jù)矩陣，包括變量（保留時間-質(zhì)荷比）、觀察量（樣本）和峰強。采用SIMCA-P+軟件v13.0（瑞典Umetrics公司）進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）。根據(jù)模型的變量重要性因子（variable importance in projection，VIP）大于1.5，并結(jié)合t檢驗結(jié)果（檢驗水準α=0.05）篩選潛在的差異代謝物，然后通過精確分子質(zhì)量信息和METLIN數(shù)據(jù)庫鑒定差異代謝物。

2 結(jié)果

2.1 尿液代謝組分析

大鼠溴鼠靈給藥前后共30份尿液樣本經(jīng)預處理后，用HPLC-TOF-MS方法分別在正、負離子模式下進行分析檢測，典型的溴鼠靈中毒大鼠尿液總離子流色譜圖（total ion chromatogram，TIC）見圖1。正離子模式下共得到1802個變量，負離子模式下獲得1634個變量，然后進行多變量統(tǒng)計分析。

圖1 典型的尿液總離子流色譜圖

圖2 UPLC-TOF-MS正、負離子模式的PCA得分圖

對給藥前和給藥后尿液代謝組進行PCA，獲得PCA得分圖（圖2）。各樣本點集中分布于得分圖的橢圓形區(qū)域（95%置信區(qū)間），給藥15d與給藥前尿液代謝組明顯分開，而給藥8d與給藥前相比，區(qū)分則不太明顯。

2.2 差異代謝物的挖掘和鑒定

為鑒別溴鼠靈毒性相關(guān)的差異代謝物，進一步采用監(jiān)督性的OPLS-DA對給藥前和給藥15 d樣本進行分析。結(jié)果正離子模式下得到1個主成分和1個正交成分，R2X=0.360，R2Y=0.997，Q2=0. 967；負模式下得到1個主成分和1個正交成分，R2X=0.422，R2Y= 0.989，Q2=0.950。此外，通過對模型進行排序驗證，該模型不存在“過擬合”現(xiàn)象，得到結(jié)果見圖3。

根據(jù)VIP值和t檢驗結(jié)果，共篩選出22個與溴鼠靈毒性相關(guān)的差異代謝物，其中脯氨酸、N-乙酰-L-谷氨酸、S-Adenosylmethioninamine、酮戊二酸、檸檬酸、蘋果酸、丙酮酸、吲哚乙酸、吲哚酚硫酸、馬尿酸、磷酸膽堿、蘇氨酸、戊二酸、乙酰乙酸、龍膽酸、輔酶Q、維生素B6共17種代謝物濃度在給藥15d后顯著降低，而8-Amino-7-oxononanoic acid、尿苷、煙尿酸、二氫神經(jīng)鞘氨醇、植物鞘氨醇5種代謝物濃度在給藥15d后明顯上升（表1）。

圖3 給藥前后OPLS-DA排序檢驗圖

表1 潛在的差異代謝物

3 討論

本研究基于OPLS-DA分析的UPLC-TOF-MS代謝組學方法從溴鼠靈中毒大鼠尿液中篩選出22個潛在的差異代謝物，并從代謝水平全面表征溴鼠靈中毒后的代謝變化。分析前已將保留時間小于0.5min的色譜峰（接近死時間）排除，因為這些離子受到強烈的離子抑制效應，不能反映真正的濃度差異[14]。本研究構(gòu)建的OPLS-DA模型R2Y和Q2值均在0.95以上，說明構(gòu)建的模型具有較高的預測能力。另外本研究還對模型進行排序驗證，從模型的參數(shù)來看，模型對于解釋給藥前后尿液代謝組之間差異及尋找差異物質(zhì)是可靠的，且從排序驗證圖來看模型不存在“過擬合”現(xiàn)象。OPLS-DA得分圖顯示，給藥前后不同時間的大鼠尿液樣本代謝物軌跡在各時間段內(nèi)相似度較好，呈現(xiàn)各自聚類現(xiàn)象，且隨著給藥次數(shù)增加，尿液代謝物組偏離正常組越遠，表明溴鼠靈毒性累積效應。檸檬酸、二氫神經(jīng)鞘氨醇等大部分差異代謝物在給藥15d和給藥8d較給藥前濃度變化有一致的趨勢，且給藥次數(shù)越多，變化越大。這可能說明溴鼠靈的毒性作用存在累積效應，溴鼠靈給藥次數(shù)越多，尿液代謝物組偏離正常組越遠，產(chǎn)生毒性作用越大。

葡萄糖的有氧氧化是糖氧化的主要方式，也是細胞能量供應的主要來源。葡萄糖循糖酵解途徑分解成丙酮酸，丙酮酸進入線粒體再氧化脫羧生成乙酰輔酶A，然后經(jīng)三羧酸循環(huán)轉(zhuǎn)化成檸檬酸、酮戊二酸、蘋果酸等系列有機酸，然后為氧化磷酸化反應生成ATP提供還原當量[15，16]。本研究中三羧酸循環(huán)中間體檸檬酸、酮戊二酸和蘋果酸的減少，表明三羧酸循環(huán)受到抑制，而糖酵解途徑中丙酮酸的減少或許會進一步抑制三羧酸循環(huán)。因此溴鼠靈中毒大鼠尿液中檸檬酸、酮戊二酸、蘋果酸和丙酮酸的含量異常或許意味著能量代謝的紊亂參與了溴鼠靈中毒的毒理進程，這與溴鼠靈中毒大鼠血液代謝組研究結(jié)果[17]一致。

鞘脂化合物在細胞生長、分化、衰老、信號傳導方面起著重要作用[18]。植物鞘氨醇和二氫神經(jīng)鞘氨醇均屬于鞘脂類化合物，在鞘脂生物合成和代謝中具有重要作用[19，20]。本研究中溴鼠靈中毒大鼠尿液中植物鞘氨醇和二氫神經(jīng)鞘氨醇濃度與給藥前相比顯著上升（P＜0.05），說明溴鼠靈毒性作用引起鞘脂代謝的紊亂。有研究[17]發(fā)現(xiàn)在鞘脂代謝中，鞘磷脂和神經(jīng)酰胺作為鞘脂代謝的底物可以生成生物活性脂質(zhì)如鞘氨醇、植物鞘氨醇、二氫神經(jīng)鞘氨醇等。由此可知，鞘磷脂和神經(jīng)酰胺分解代謝的上調(diào)可以導致鞘磷脂和神經(jīng)酰胺儲備下降，植物鞘氨醇和二氫神經(jīng)鞘氨醇在體內(nèi)富集。

本研究中溴鼠靈中毒大鼠尿液中色氨酸代謝物戊二酸、吲哚酚硫酸和吲哚乙酸濃度異常下降，表明體內(nèi)色氨酸代謝受到擾動。色氨酸先分解代謝成犬尿氨酸，然后再代謝成戊二酸，或者通過煙酰胺腺嘌呤二核苷酸分解代謝成黃尿酸，前一代謝路徑在腎中比在肝中活躍[21]。尿液色氨酸代謝物濃度的降低可能伴隨色氨酸濃度的升高，引起氨基酸尿，與腎損傷模型中近曲小管損傷相關(guān)聯(lián)，暗示著腎毒性的發(fā)生[22，23]。馬尿酸作為苯甲酸和甘氨酸的結(jié)合物在肝中形成，其合成可能與肝輔酶A相關(guān)，而輔酶A通過肝線粒體中葡萄糖氧化形成，因此生物體液中馬尿酸的濃度常常用于肝功能的評估[24]。本研究中馬尿酸濃度降低表明溴鼠靈可能引起肝線粒體功能障礙，這與文獻[25]報道溴鼠靈誘發(fā)肝腎損傷相符，溴鼠靈中毒死亡者肝、腎均可見單核細胞、淋巴細胞與中性粒細胞浸潤。

本研究利用基于HPLC-TOF-MS技術(shù)的尿液代謝組學方法研究溴鼠靈中毒大鼠的代謝變化，應用OPLS-DA方法篩選出尿液中與溴鼠靈毒性密切相關(guān)的22種潛在的差異代謝物，發(fā)現(xiàn)溴鼠靈可能通過干預三羧酸循環(huán)、糖酵解、鞘脂代謝、色氨酸代謝等代謝途徑發(fā)揮其全身毒性效應，且從分子水平闡明了溴鼠靈的毒性效應，明確了溴鼠靈毒性作用的累積效應。

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Evaluation of Brodifacoum-induced Toxicity by Metabonomics Approach Based on HPLC-TOF-MS

YAN Hui,ZHUO Xian-yi,SHEN Bao-hua,XIANG Ping,SHEN Min
（Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Shanghai Forensic Service Platform,Institute of Forensic Science,Ministry of Justice,PRC,Shanghai 200063,China）

ObjectiveTo analyse the metabolic changes in urine of rats with brodifacoum intoxication, and to reveal the molecular mechanism of brodifacoum-induced toxicity on rats.MethodsBy establishing a brodifacoum poisoning rats model,the urine metabolic profiling data of rats were acquired using high performance liquid chromatography-time of flight mass spectrometry（HPLC-TOF-MS）.The orthogonal partial least squares analysis-discrimination analysis（OPLS-DA）was applied for the multivariate statistics and the discovery of differential metabolites closely related to toxicity of brodifacoum.ResultsOPLS-DA score plot showed that the urinary metabolic at different time points before and after drug administration had good similarity within time period and presented clustering phenomenon.Comparing the urine samples of rats before drug administration with which after drug administration,twenty-two metabolites related to brodifacoum-induced toxicity were selected.ConclusionThe toxic effect of brodifacoum worked by disturbing the metabolic pathways in rats such as tricarboxylic cycle,glycolysis,sphingolipid metabolism and tryptophan metabolism,and the toxicity of brodifacoum is characterized of accumulation effect.The metabonomic method based on urine HPLC-TOF-MS can provide a novel insight into the study on molecular mechanism of brodifacoum-induced toxicity.

forensic toxicology;metabolomics;high performance liquid chromatography-time of flight mass spectrometry;brodifacoum;rats

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.03.007

1004-5619（2017）03-0247-05

2016-04-28）

（本文編輯：劉偉）

“十三五”國家重點研發(fā)計劃資助項目（2016YFC080 0704）；國家自然科學基金青年科學基金資助項目（81302614）；上海市自然科學基金資助項目（13ZR1443000）；中央級公益性科研院所資助項目（GY2013G-7）；上海市法醫(yī)學重點實驗室資助項目（17DZ2273200）；上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務平臺資助項目（16DZ2290900）

嚴慧（1984—），女，博士，副研究員，主要從事法醫(yī)毒物學研究；E-mail：yanh@ssfjd.cn

沈敏，女，研究員，博士研究生導師，主要從事法醫(yī)毒物學研究；E-mail：shenm@ssfjd.cn