MALDI-TOF-MS對Y染色體上66個二等位基因的檢測

宋雨桐，李莉，張立男，朱如心，柳燕，林源

（1.司法部司法鑒定科學技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學重點實驗室上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200063；2.華東政法大學，上海 200063）

MALDI-TOF-MS對Y染色體上66個二等位基因的檢測

宋雨桐1，2，李莉1，張立男1，2，朱如心1，柳燕1，林源1

（1.司法部司法鑒定科學技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學重點實驗室上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200063；2.華東政法大學，上海 200063）

目的分析華東地區(qū)漢族人群Y染色體上66個二等位基因遺傳標記的多態(tài)性，并評價其法醫(yī)學應(yīng)用價值。方法采用多重PCR聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技術(shù)對華東地區(qū)205名漢族男性無關(guān)個體Y染色體上66個二等位基因遺傳標記進行分型研究，使用直接計數(shù)法統(tǒng)計待測位點的等位基因頻率，用公式計算基因多樣性和單倍型多樣性，用Arlequin v3.5.2.2軟件檢測該體系的單倍型并且進行群體遺傳學比較。結(jié)果其中60個二等位基因遺傳標記在華東地區(qū)漢族男性人群中呈多態(tài)性分布，基因多樣性為0.0385～0.5019，共檢測到85種單倍型，單倍型多樣性為0.9703。部分SNP位點的等位基因分布在華東地區(qū)漢族人群和新疆漢族人群、廣東漢族人群差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)論60個二等位基因遺傳標記及其檢測體系在親權(quán)鑒定和個體識別中可補充提供遺傳信息，MALDI-TOF-MS技術(shù)可以進行二等位基因遺傳標記的分型檢測。

法醫(yī)遺傳學；Y染色體；多態(tài)現(xiàn)象，遺傳；基質(zhì)輔助激光解吸電離；單核苷酸多態(tài)性；插入/缺失

Y染色體為男性特有，Y染色體遺傳標記在親權(quán)鑒定中具有獨特的應(yīng)用價值。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）作為第三代遺傳標記，近十年來引起越來越多研究者的關(guān)注；插入/缺失（insertion/deletion，InDel）多態(tài)性位點，是指基因組中插入或缺失不同大小的DNA片段所形成的多態(tài)性遺傳標記，此兩類遺傳標記通常為二等位基因遺傳標記。常用的SNP分型檢測方法有SNaPshot微測序技術(shù)[1]、TaqMan探針技術(shù)[2]、焦磷酸測序技術(shù)[3]和二代測序技術(shù)[4]等，上述技術(shù)具有步驟繁雜、測定位點單一、儀器設(shè)備昂貴等缺點；而分析InDel位點則常用傳統(tǒng)的毛細管電泳技術(shù)[5]。本研究結(jié)合文獻報道和實際情況，為完成華東地區(qū)漢族人群Y染色體上66個二等位基因遺傳標記的多態(tài)性分布調(diào)查，采用多重PCR聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技術(shù)進行研究，旨在為法醫(yī)學應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣本

在知情同意原則下，收集華東地區(qū)漢族男性無關(guān)個體血液樣本205份，取200μL，其余-4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑及儀器

QIAamp?DNA Blood Mini試劑盒（德國QIAGEN公司），Complete iPLEX?Gold Genotyping Reagent Set 96試劑盒（美國Agena Bioscience公司）。9700型PCR擴增儀（美國AB公司），MassARRAY?飛行時間質(zhì)譜儀、MassARRAY?RS1000納升點樣儀（美國Agena Bioscience公司），5810R離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取

應(yīng)用QIAamp?DNA Blood Mini試劑盒，按說明書提取血液樣本中的DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 位點的選擇、優(yōu)化及引物設(shè)計

根據(jù)2008年國際Y染色體協(xié)會公布的Y染色體系統(tǒng)樹[6]和美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫[7]的檢索，篩選出在東亞人群具有多態(tài)性［最小等位基因頻率（mirror allele frequency，MAF）≥0.01］的72個二等位遺傳標記，通過美國Agena Bioscience公司提供的在線工具[8]設(shè)計復合引物，并進行預實驗，將不適用于MALDI-TOF-MS平臺的6個位點刪去，最終保留66個位點（包含63個Y-SNP位點和3個Y-InDel位點）進行分型檢測。依據(jù)各個位點的物理距離，并避免引物相互干擾，分成3個復合體系，分別進行擴增檢測，依次命名為W1、W2和W3，各包含29、29和8個位點（表1），分別配置PCR擴增及延伸引物混合液。

表1 3個復合擴增體系所包含的二等位基因遺傳標記

1.2.3 PCR擴增

使用Complete iPLEX?Gold Genotyping Reagent Set 96試劑盒分別對上述三個體系進行PCR擴增，擴增體系均為5 μL，包括超純水1.4 μL、10×PCR緩沖液0.5 μL，25 mmol/L MgCl20.4 μL，25 mmol/L dNTP混合液0.1μL，PCR引物混合液0.5 μL，5 U/μL PCR酶0.1μL，模板DNA溶液2μL。用9700型PCR擴增儀按下列條件進行多重PCR擴增：95℃預變性2 min；95℃30 s，56℃30 s，72℃60 s，45個循環(huán)；72℃延伸5 min。擴增時以2800M（美國Promega公司）作為陽性對照。

1.2.4 產(chǎn)物的純化

為了去除PCR反應(yīng)后剩余的dNTP，在上述PCR擴增產(chǎn)物中加入超純水1.53 μL、1.7 U/μL蝦堿性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）0.30 μL和 SAP緩沖液0.17μL。在9700型PCR擴增儀上運行下列程序：37℃40min，85℃5min。

1.2.5 單堿基延伸反應(yīng)

在純化后的產(chǎn)物中加入超純水0.62 μL，10× iPLEX?pro buffer plus 0.2 μL，10×iPLEX?pro Termination Mix 0.2μL，單堿基延伸引物混合液0.94μL，iPLEX?酶0.04μL。用9700型PCR擴增儀按下列條件進行單堿基延伸反應(yīng)：94℃30 s；94℃5 s，52℃5 s，80℃5 s，52℃5 s，80℃5 s，52℃5 s，80℃5 s，52℃5 s，80℃5 s，52℃5 s，80℃5 s，40個循環(huán)；72℃延伸3min。

1.2.6 樣本脫鹽

在單堿基延伸反應(yīng)產(chǎn)物中加入超純水41 μL以及風干的潔凈樹脂15 mg，放在旋轉(zhuǎn)器上顛倒搖勻15min，然后以4400×g離心5min。

1.2.7 點樣

使用MassARRAY?RS1000納升點樣儀將上步反應(yīng)產(chǎn)物點樣至SpectroCHIP?Array 96芯片上，調(diào)整點樣時間和速度，將點樣量控制在8～12nL。

1.2.8 MALDI-TOF-MS檢測

將點樣完畢的芯片放入MassARRAY?飛行時間質(zhì)譜儀的真空倉中，使用設(shè)定好的自動程序進行質(zhì)譜檢測，用MassARRAY Typer 4.0軟件（美國Agena Bioscience公司）查看分型結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

表2 66個二等位基因遺傳標記的多態(tài)性及對照樣品（2800M）的基因型（n=205）

2.1 等位基因頻率和法醫(yī)學參數(shù)

本研究得到了Y染色體上66個二等位基因遺傳標記的等位基因頻率數(shù)據(jù)，其中的60個在華東地區(qū)漢族男性人群中具有多態(tài)性，各位點的等位基因頻率、GD值以及對照樣品（2800M）的分型結(jié)果見表2。

表2數(shù)據(jù)顯示，在所選擇的位點中，除M148、rs11575897、rs2032624、rs2032645、rs9306841、SRY8299這6個位點外，其余60個位點均具有多態(tài)性（MAF≥0.01），GD值為0.0385～0.5019，其中rs17269928的GD值最高（0.5019），M111、rs2032602、rs3848982、rs3906、rs9786479的GD值最低（0.0385）。

由于Y染色體上的遺傳標記存在連鎖，因此實際觀察到的單倍型種類數(shù)量遠遠小于統(tǒng)計學上可能出現(xiàn)的組合數(shù)[14]。本研究共發(fā)現(xiàn)85種單倍型，HD值達到0.9703，其中單倍型頻率最高的為0.0927，觀察次數(shù)是 19；單倍型最低的頻率僅為0.0049，觀察次數(shù)為1。

2.2 群體遺傳學比較

本研究中所涉及的66個二等位基因遺傳標記中，有19個在張愛平等[11]所建立的復合擴增體系中對廣東漢族人群進行過分析；黃代新等[12]曾建立26個YSNP位點檢測體系對湖北（武漢）漢族人群進行過檢測，與本研究相同的二等位基因遺傳標記有23個；本研究的部分二等位基因遺傳標記曾經(jīng)在新疆漢族人群中進行過群體遺傳學調(diào)查[13]，與上述三組數(shù)據(jù)進行群體遺傳學比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）的位點見表3。

表3 華東地區(qū)與中國不同地區(qū)漢族群體部分Y-SNP位點等位基因分布差異比較（P值）

3 討論

3.1 關(guān)于Y-SNP位點的選擇

本研究選定的Y染色體上的二等位基因遺傳標記既有SNP位點也有少部分InDel位點，沒有嚴格分開的原因為：首先，SNP和InDel位點具有相似的自然突變率，不會影響數(shù)據(jù)統(tǒng)計；其次，選擇的MALDITOF-MS平臺的分型原理對這兩類位點都適用[15]。因此決定嘗試將Y-SNP位點和Y-InDel位點在同一體系中進行分型檢測。

與先前報道[11，12]的兩個復合擴增體系相比，本次實驗所包含的位點個數(shù)較多，能提供更多的遺傳信息。此外，這66個位點涵蓋了《法醫(yī)SNP分型與應(yīng)用規(guī)范》（SF/Z JD0105003—2015）中建議選擇的20個Y-SNP位點中的19個，因此在司法鑒定實務(wù)中，具有很高的應(yīng)用價值。

3.2 關(guān)于分型方法的選擇

當前的報道[16]中，進行SNP分型檢測大都選用SNaPshot微測序技術(shù)，該技術(shù)較為成熟，在實踐中應(yīng)用較廣，但是具有引物設(shè)計要求嚴格、步驟繁復、無法進行高通量分析等局限性。

此外，也有研究人員運用TaqMan探針技術(shù)進行SNP分型，該方法靈敏度高，對DNA樣本的質(zhì)量要求較低，適合微量檢材的分析，實驗過程簡單，耗時短。但該技術(shù)更適用于大量樣本、單個SNP位點分型檢測，多用于醫(yī)學檢測[17]，顯然與此次研究目的不符。

本研究選擇了MALDI-TOF-MS平臺，利用最終產(chǎn)物被強激光激發(fā)所得離子的質(zhì)荷比不同，完成SNP和InDel位點的分型檢測。該方法具有多個位點同步檢測、結(jié)果實時讀出、數(shù)據(jù)處理簡單快捷等優(yōu)點，因此可以實現(xiàn)中高通量、自動化操作，在分析大量樣本時具有很強的優(yōu)勢。不過，在實驗中也發(fā)現(xiàn)，當多重PCR體系中位點較多時（如本研究的W1、W2），會有部分位點不能得出分型結(jié)果，此時可以采用拆分體系的方法，降低每個體系同時檢測的位點數(shù)。

3.3 體系的多態(tài)性及群體差異

本研究結(jié)果表明，所選的66個二等位基因遺傳標記中，有60個在華東地區(qū)漢族人群中具有遺傳多態(tài)性，GD值為0.0385～0.5019，其中多態(tài)性較高的位點（GD≥0.3）[13]共有15個，多態(tài)性中等的位點（0.2≤GD<0.3）共有31個，多態(tài)性較低的位點（0.01

由表3可看出，華東地區(qū)和新疆漢族人群之間，有5個位點的等位基因分布頻率差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；華東地區(qū)與廣東漢族人群之間，有13個位點的等位基因分布頻率差異具有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）；而華東地區(qū)和湖北（武漢）漢族人群之間，相同位點的等位基因分布頻率差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。由此可見，部分Y染色體上二等位基因遺傳標記的等位基因分布具有地域性差異。

3.4 應(yīng)用價值評估

本研究對華東地區(qū)205個漢族男性無關(guān)個體進行了Y染色體上66個二等位基因遺傳標記的分型檢測，共檢出85種單倍型，HD值為0.9703。雖然系統(tǒng)效能小于當前廣泛使用的包含了17個Y-STR基因座的Yfiler試劑盒[18]，但是也能提供較大的遺傳信息量，在涉及男性的個體識別和親權(quán)鑒定中具有較高的應(yīng)用價值。例如，在進行父系關(guān)系檢驗實踐中，有些案例單獨依據(jù)Y-STR分型結(jié)果難以出具明確的鑒定意見[19]，不能僅依據(jù)少數(shù)幾個Y-STR基因座的分型結(jié)果不一致而否定父系關(guān)系的存在，這種情形下，對高信息量Y-SNP和Y-InDel位點進行分型應(yīng)是一個可行的補充檢驗手段。另外，由于Y染色體上66個二等位基因遺傳標記的等位基因分布頻率與人群地域分布有關(guān)系，也可以用于協(xié)助判斷被鑒定人的居住地或人口遷移信息。

[1]Vallone PM，Decker AE，Butler JM.Allele frequencies for 70 autosomal SNP loci with U.S.Caucasian，African-American，and Hispanic samples[J].Forensic Sci Int，2005，149（2-3）：279-286.

[2]張素華，李莉，李成濤，等.TaqMan探針技術(shù)用于XSNP位點的分型[J].法醫(yī)學雜志，2010，26（1）：22-25.

[3]翟仙敦，劉之江，侯一平.焦磷酸測序技術(shù)及其法醫(yī)學應(yīng)用[J].中國司法鑒定，2009，（4）：39-42，63.

[4]韋貴將，鄒秉杰，陳之遙，等.新一代測序技術(shù)的研究進展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2012，12（19）：3789-3793.

[5]胡真，王正，張素華，等.30個InDel位點在華東漢族和畬族人群的法醫(yī)學應(yīng)用[J].法醫(yī)學雜志，2014，30（5）：337-341，345.

[6]Karafet TM，Mendez FL，Meilerman MB，et al.New binary polymorphisms reshape and increase resolution of the human Y chromosomal haplogroup tree[J]. Genome Res，2008，18（5）：830-838.

[7]The National Center of Biotechnology Information[DB/ OL].[2016-09-15].www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed.

[8]Agena Bioscience’s online design tools[Z/OL].[2016-08-20].www.mysequenom.com/Home.

[9]侯一平.法醫(yī)物證學[M].第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：23.

[10]Excoffier L，Lischer HE.Arlequin suite ver 3.5：a new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows[J].Mol Ecol Resour，2010，10（3）：564-567.

[11]張愛平，劉超，李越，等.23-plex Y-SNPs復合擴增體系在法醫(yī)學應(yīng)用的研究[J].中山大學學報（醫(yī)學科學版），2010，31（5）：685-691.

[12]黃代新，種書亞，易少華，等.微測序技術(shù)檢測武漢漢族群體26個Y-SNPs的遺傳多態(tài)性[J].華中科技大學學報（醫(yī)學版），2011，40（1）：64-70.

[13]Li L，Song YT，Liu Y，et al.Typing of 71 biallelic markers on Y chromosome in Xinjiang Han population of China[J].Forensic Science International：Genetics Supplement Series，2015，5：e156-e158.

[14]韓淑毅，高洪梅，張茂修，等.濟南漢族群體5個YSNP位點的多態(tài)性分析[J].法醫(yī)學雜志，2011，27（3）：205-207，210.

[15]Werner M，Sych M，Herbon N，et al.Large-scale determinationofSNPallelefrequenciesinDNA pools using MALDI-TOF mass spectrometry[J].Hum Mutat，2002，20（1）：57-64.

[16]李成濤，趙書民，柳燕.DNA鑒定前沿[M].北京：科學出版社，2011：67.

[17]王默進，周總光，王玲，等.運用TaqMan探針實時熒光PCR技術(shù)檢測AKAP10基因2073A/G單核苷酸多態(tài)性[J].四川大學學報（醫(yī)學版），2009，40（2）：275-278.

[18]翁瑋霞.17個Y-STR基因座單倍型調(diào)查、突變研究與法醫(yī)學應(yīng)用[D].廣州：南方醫(yī)科大學，2013.

[19]李莉，柳燕，林源，等.從實際案例探討父系關(guān)系鑒定中單獨檢驗Y-STR標記的局限性[J].中國司法鑒定，2015，（3）：112-113.

Sixty-six Biallelic Genetic Markers on Y chromosome by MALDI-TOF-MS

SONG Yu-tong1,2,LI Li1,ZHANG Li-nan1,2,ZHU Ru-xin1,LIU Yan1,LIN Yuan1
（1.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Shanghai Forensic Service Platform,Institute of Forensic Science,Ministry of Justice,PRC,Shanghai 200063,China;2.East China University of Political Science and Law,Shanghai 200063,China）

ObjectiveTo analyse the genetic polymorphisms of 66 biallelic genetic markers on Y chromosome in Eastern Chinese Han population,and evaluate their values in forensic application.MethodsGenotyping of 66 biallelic genetic markers on Y chromosome was studied in 205 unrelated males of Eastern Chinese Han population by multiplex PCR combined matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry（MALDI-TOF-MS）.The allele frequencies on the loci to be tested were calculated by direct counting method,and the gene diversity（GD）and haplotype diversity（HD）were calculated by corresponding formulas.The haplotypes of this system were tested by software Arlequin v3.5.2.2 and the comparison of population genetics were analyzed.ResultsA total of 60 biallelic genetic markers on Y chromosome were polymorphic in males of Eastern Chinese Han population,and the ranges of GD were from 0.0385 to 0.5019.Eighty-five different haplotypes were observed and the HD was 0.9703.The differences of partial SNP loci between the Han population of Eastern China and that of Xinjiang and Guangdong were statistically significance.ConclusionSixty biallelic genetic markers and the detection system can complementally provide genetic information in kinship testing and individual identification.The MALDI-TOF-MS technology is able to type biallelic genetic markers.

forensic genetics;Y chromosome;polymorphism,genetic;matrix-assisted laser desorptionionization;single nucleotide polymorphism;insertion/deletion

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.03.005

1004-5619（2017）03-0239-05

2016-10-28）

（本文編輯：張素華）

“十三五”國家重點研發(fā)計劃資助項目（2016YFC080 0701）；上海市法醫(yī)學重點實驗室資助項目（17DZ2273200）；上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺資助項目（16DZ2290900）；中央級公益性科研院所資助項目（GY2014G-6）

宋雨桐（1992—），女，碩士研究生，主要從事法醫(yī)物證學研究；E-mail：stystudy＠yeah.net

李莉，女，研究員，碩士研究生導師，主要從事法醫(yī)物證學科研、檢案和教學；E-mail：lil＠ssfjd.cn