HIF-1α、VEGF-A在心律失常大鼠心肌組織中的變化

張圓，曹志鵬，毛瑞明，2，杜仲波，米麗，3，雒心怡，田美慧，朱寶利

（1.中國醫(yī)科大學法醫(yī)學院，遼寧沈陽 110122；2.遼寧省公安廳，遼寧沈陽 110032；3.河北北方學院，河北張家口 075000）

HIF-1α、VEGF-A在心律失常大鼠心肌組織中的變化

張圓1，曹志鵬1，毛瑞明1，2，杜仲波1，米麗1，3，雒心怡1，田美慧1，朱寶利1

（1.中國醫(yī)科大學法醫(yī)學院，遼寧沈陽 110122；2.遼寧省公安廳，遼寧沈陽 110032；3.河北北方學院，河北張家口 075000）

目的觀察大鼠心律失常后缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）和心肌血管內皮生長因子-A（vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A）的表達變化，探討心律失常與冠狀動脈供血不足引起的急性心肌缺血中兩指標表達規(guī)律的不同。方法利用CaCl2誘導大鼠心律失常，應用免疫組織化學染色、Western印跡法和實時熒光定量PCR檢測大鼠心律失常后6h內HIF-1α和VEGF-A的表達及變化情況。結果心律失常致死的大鼠心肌組織中HIF-1α及VEGF-A呈彌漫性表達，在心律失常發(fā)生的早期兩者表達均呈增加隨后下降；心律失常發(fā)生時即產生廣泛的心肌缺血且范圍不隨時間增大。結論HIF-1α和VEGF-A在心律失常大鼠心肌組織中均有表達，可為致死性心律失常和冠狀動脈供血不足引起的急性心肌缺血的鑒別診斷提供依據(jù)。

法醫(yī)病理學；心律失常，心性；心?。蝗毖跽T導因子 1；血管內皮生長因子-A；大鼠

心源性猝死（sudden cardiac death，SCD）在大多數(shù)國家是各年齡段心血管疾病的主要死因[1-3]。據(jù)報道，部分心源性猝死者的冠狀動脈病變并不是很嚴重，心臟僅有非特異的缺血性改變，心功能指標如腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）也并無特異性的升高，有些案例可能存在心肌缺血、壞死指標如肌酸激酶（creatine kinase，CK）及其同工酶（CK-MB）、心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cardiac troponinⅠ，cTnⅠ）的表達，推測這類猝死極有可能由致死性心律失常引起[3-5]。同時包括心肌缺血及心肌梗死在內的潛在心臟病變可引發(fā)心律失常[6]，心律失常反過來可以影響心泵功能從而減少心臟自身的血液供應。這就說明心律失常與心肌缺血存在一定聯(lián)系，心律失常發(fā)生時很可能有心肌缺血的參與。通過研究兩者之間的聯(lián)系，不但能為致死性心律失常的法醫(yī)學鑒定及死亡機制研究提供科學依據(jù)，還對兩者之間的鑒別診斷有所裨益。目前，致死性心律失常的法醫(yī)學診斷由于缺乏明顯的病理學改變，主要通過排除非心源性死因來獲得[1]。心肌缺血相關指標如缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）及血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）對于心肌缺血十分敏感并有一定特異性，是檢測心肌缺血是否發(fā)生的優(yōu)良指標[7-10]。HIF和VEGF在冠狀動脈供血不足引起的心肌病變中的表達規(guī)律已經有所報道[7，8，11]，為明確心律失常后心肌組織中HIF和VEGF的表達規(guī)律，本實驗通過檢測HIF家族中的HIF-1α及VEGF家族中的VEGF-A在CaCl2誘導大鼠心律失常模型中的表達特點，來研究心律失常中心肌缺血的參與程度，以期為心律失常的鑒定以及其與心肌缺血的鑒別診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

兔抗大鼠HIF-1α多克隆抗體（美國Proteintech公司），兔抗大鼠VEGF-A多克隆抗體（美國Abcam公司），SP-9001免疫組化染色試劑盒、ZLI9018濃縮型DAB試劑盒、多克隆山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司），RIPA裂解液（P0013B，上海碧云天生物技術有限公司），預染蛋白Marker（SM0671，立陶宛Fermentas公司），ECL發(fā)光液（SC-2048，美國Santa Cruz公司），RNAiso Plus（D9108A）、Prime-ScriptTMRT試劑盒（DRR037）、SYBR?PremixEx TaqTMⅡ（RR820A，日本TaKaRa公司）。

ML870 8通道PowerLab 8/30高速記錄儀（澳大利亞ADInstrument公司），ALC-IP900微量注射泵（上海奧爾科特生物科技有限公司），RM2235型石蠟切片機（德國Leica公司），CX31型光學顯微鏡（日本OLYMPUS公司），165-8001型電泳儀、轉印儀（美國BIO-RAD公司），紫外可見分光光度計（德國IMPLEN公司），TP600梯度PCR儀（日本TaKaRa公司），7500型實時熒光定量PCR儀（美國Life Technologies公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及分組

健康成年雄性SD大鼠72只，體質量300～350g。適應性飼養(yǎng)一周后，隨機分為生理鹽水對照組和CaCl2誘導心律失常實驗組，每個組再分成6個亞組（0min、15min、30min、1h、3h和6h組），每個亞組6只大鼠。

1.2.2 CaCl2誘導大鼠心律失常模型的制作

參照Salimbeni等[12，13]建立大鼠心律失常動物模型。采用4%水合氯醛溶液以0.75mL/100g腹腔注射麻醉，使大鼠仰臥位固定于手術臺上，連接PowerLab記錄儀，采用標準第Ⅱ導聯(lián)監(jiān)測心電。術前監(jiān)測正常心電5min。用手術刀切開頸部皮膚，鈍性分離頸部肌肉，暴露雙側頸靜脈。

實驗組用微量注射泵經頸靜脈按4 mg/100 g注射CaCl2溶液；15 min、30 min、1 h亞組每10 min注射一次；3h、6h亞組在第一小時每10min注射一次，之后每30min注射一次。注射后記錄心電圖變化，分別在0 min、15 min、30 min、1 h、3 h、6 h以兩倍劑量給入CaCl2溶液處死，并確保大鼠是由于致死性心律失常而致死。

生理鹽水對照組以等量生理鹽水代替CaCl2溶液，最后在相應時間點頸椎脫位處死動物。

動物死后灌流，取出心臟。將心臟橫斷分為兩部分，一部分經多聚甲醛固定用于HE染色和免疫組織化學染色，另一部分-80℃保存用于Western印跡法及mRNA檢測。

1.2.3 切片的制作

取大鼠心肌，經4%多聚甲醛（PBS溶液）固定，水洗、脫水、透明，石蠟包埋，進行常規(guī)石蠟切片，貼于經3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyl-triethoxysilane，APES）處理后的載玻片上。

1.2.4 HE染色

切片脫蠟，水化，蘇木素染色7min，1%鹽酸乙醇分化后，自來水返藍30min，1%伊紅染色1 min，蒸餾水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.5 免疫組織化學染色

切片脫蠟至水。3%過氧化氫孵育40min，以消除內源性過氧化物酶活性。滴加正常山羊血清工作液，孵育2 h。分別滴加1∶800兔抗大鼠HIF-1α抗體及1∶1000兔抗大鼠VEGF-A抗體，4℃過夜。滴加生物素二抗工作液，室溫孵育1h。滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育1 h。DAB顯色后經蘇木素染核，1%鹽酸乙醇分化，自來水返藍。切片脫水、透明、中性樹膠封片。染色中以PBS代替一抗作空白對照。

1.2.6 Western印跡法

取心肌組織約100 mg，加液氮將組織研磨成粉末，加蛋白裂解液及苯氟甲砜（phenyl-methylsulphonyl fluoride，PMSF），冰上勻漿，超聲破碎，4℃下以16000×g離心20min，共3次，取上清液，用BCA蛋白測定法測定蛋白濃度，-80℃保存?zhèn)溆?。蛋白樣品中加?×上樣緩沖液，置于100℃金屬浴中，加熱5min后進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（dodecyl sulfate sodium salt-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白。濕轉法將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上（110V，90min）。三羥甲基氨基甲烷緩沖液鹽-吐溫20（tris buffered saline with tween-20，TBST）緩沖液洗膜后，將PVDF膜浸入5%脫脂奶粉中封閉2h。加入1∶1000兔抗大鼠HIF-1α抗體及1∶3000兔抗大鼠VEGF-A抗體，塑料薄膜封閉，4℃過夜。TBST洗膜后，加入1∶4 000山羊抗兔IgG，塑料薄膜封閉，室溫孵育2h。TBST洗膜后，滴加ECL發(fā)光液進行發(fā)光。

1.2.7 mRNA的檢測

取心肌組織100 mg，加入液氮研磨成粉末，以TRIzol法按照說明書應用RNAiso Plus試劑盒提取細胞總RNA，用紫外可見分光光度計測定D260/D280值和RNA濃度，并將樣品部分RNA稀釋成0.5 μg/μL用于反轉錄。參照說明書應用PrimeScriptTMRT試劑盒配制反轉錄體系進行反轉錄，得到cDNA。參照說明書應用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ配制實時熒光定量PCR反應體系，上機進行實時熒光定量PCR。

1.3 結果判定及統(tǒng)計分析

Western印跡法以標準分子量Marker為標識，在70000～100000為HIF-1α目標陽性譜帶，在40000～50000為VEGF-A目標陽性譜帶。以各條帶平均光密度值與相應GAPDH譜帶的平均光密度值的比值來分析各時間段蛋白量。通過2-ΔΔCt法以GAPDH為內參計算cDNA的相對含量，分析各時間段HIF-1α及VEGF-A mRNA的表達量。

采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計分析，應用方差分析進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學處理，組間比較用最小顯著差異法（LSD檢驗），數(shù)據(jù)應用±s表示，檢驗水準α=0.05。

圖1 大鼠心律失常后心肌HIF-1α免疫組織化學染色×400

2 結果

2.1 心電監(jiān)測結果

心電監(jiān)測結果顯示，生理鹽水對照組大鼠心電未發(fā)生明顯改變；實驗組大鼠心電檢測結果可見不同類型的心律失常波形，大多數(shù)為竇性心動過速、竇性停搏及各種類型的傳導阻滯，部分大鼠出現(xiàn)輕微的室性心律失常，當通過兩倍劑量CaCl2處死大鼠時，可見到室性心動過速、心室顫動和心室撲動。

2.2 HE染色結果

對照組中各亞組的HE染色切片未見病理性改變，心肌結構清晰，細胞核完整，橫紋可見。實驗組中，15min亞組僅見少量心肌灶狀嗜伊紅染色增強；30min及1 h亞組可見大片狀心肌嗜伊紅染色；3 h亞組個別心肌細胞出現(xiàn)凝固性壞死；6h亞組心肌細胞腫脹明顯，橫紋不清，部分心肌細胞出現(xiàn)凝固性壞死。實驗組在30min、1h、3h亞組中可見心肌波浪樣變。

2.3 免疫組織化學染色結果以PBS代替一抗的空白對照切片，未見陽性染色。對照組大鼠心肌組織中，HIF-1α的染色見極個別細胞弱陽性表達，VEGF-A的染色未見表達。

實驗組中，HIF-1α及VEGF-A在組織中彌漫表達。HIF-1α的表達隨時間逐漸增強，1h和3h亞組表達強度明顯增強，6 h亞組表達明顯減弱（圖1）。VEGF-A的表達同樣隨時間逐漸增強，在30 min亞組表達強度增強明顯，1h及3h亞組強陽性表達，6h亞組表達明顯下降（圖2）。

此外，相同時間段中，HIF-1α及VEGF-A在左心室和右心室中的染色強度未見差異，HIF-1α及VEGF-A的表達范圍在不同實驗亞組中未見改變，均呈彌漫表達。

圖2 大鼠心律失常后心肌VEGF-A免疫組織化學染色×400

2.4 Western印跡法結果

以GAPDH（相對分子量36 000）作為內參，對HIF-1α及VEGF-A蛋白在心肌組織中的表達情況進行相對定量分析。

對照組中，兩指標表達量很少，HIF-1α幾乎不表達，各時間段的表達量沒有差異。實驗組中，HIF-1α及VEGF-A蛋白表達強度變化呈現(xiàn)時間規(guī)律性，從0min開始表達逐漸增強，30 min為表達的高峰，表達量急劇升高，6h顯著下降，表達量極少，低于對照組水平。統(tǒng)計學分析表明，HIF-1α各實驗亞組與對照組相應時間點比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；VEGF-A各實驗組與對照組相應時間點比較，30min、1h和3h亞組有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖3，表1）。

2.5 實時熒光定量PCR結果

以對照組中0min的GAPDH作為內參，對HIF-1α及VEGF-A mRNA在心肌組織中的表達情況進行相對定量分析。

對照組中，各時間段mRNA表達量一致且差異無統(tǒng)計學意義。實驗組中，HIF-1α mRNA的表達量在15min時迅速上升，1h下降，3h再次攀升，表達高峰出現(xiàn)在6h，各實驗組與對照組相應時間點比較，除0min組外，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；VEGF-A mRNA的表達量從30min開始到3h逐漸上升，表達高峰出現(xiàn)在3h，6h下降，各實驗組與對照組相應時間點比較，30min、1h、3h亞組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，表2）。

圖3 大鼠心律失常后各時間點HIF-1α和VEGF-A蛋白表達的Western印跡法結果

表1 不同時間點心肌HIF-1α和VEGF-A表達譜帶的灰度值變化（n=6，±s）

表1 不同時間點心肌HIF-1α和VEGF-A表達譜帶的灰度值變化（n=6，±s）

注：1）與對照組相應時間點比較，P<0. 05；2）與相鄰上個時間點比較，P<0.05

時間點HIF-1αVEGF-A對照組實驗組對照組實驗組0min0.028±0.0080.064±0.0071）0.075±0.0120.211±0.040 15min0.020±0.0070.097±0.0201）0.177±0.0360.331±0.0742）30min0.034±0.0110.302±0.0441）2）0.185±0.0440.553±0.0861）1h0.033±0.0110.269±0.0471）0.151±0.0070.489±0.0341）3h0.029±0.0040.239±0.0441）0.168±0.0180.497±0.0691）6h0.034±0.0070.012±0.0011）2）0.187±0.0150.106±0.0222）

表2 不同時間點HIF-1α和VEGF-A mRNA表達的相對表達量（n=6，±s）

表2 不同時間點HIF-1α和VEGF-A mRNA表達的相對表達量（n=6，±s）

注：1）與對照組相應時間點比較，P<0. 05；2）與相鄰上個時間點比較，P<0.05

時間點HIF-1α mRNAVEGF-A mRNA對照組實驗組對照組實驗組0min1.000±0.0000.999±0.0511.000±0.0000.792±0.021 15min0.592±0.0111.281±0.1111）2）0.816±0.0340.730±0.082 30min0.694±0.0351.276±0.0251）0.739±0.0541.163±0.0501）2）1h0.748±0.0251.152±0.0721）0.905±0.0021.404±0.0941）3h0.726±0.0111.229±0.0991）0.919±0.0031.650±0.1191）2）6h0.877±0.0651.498±0.0821）0.790±0.1170.687±0.0952）

3 討論

HIF-1是Semenza等[6]在研究EPO基因3′端增強子時發(fā)現(xiàn)的一種只有在缺氧時才會與之連接的蛋白復合體。HIF是一種與DNA相連接的異源二聚體蛋白[14]，由α亞基和β亞基組成，α亞基（主要是α1亞基）在缺氧的條件下發(fā)揮主要作用[15]。在正常狀態(tài)下HIF-1α會迅速地被E3泛素連接酶復合體降解[16]，而在缺氧的狀態(tài)下HIF-1α逃避了這種降解得以積累[17]。VEGF-A可以調節(jié)血管的新生與再生以及淋巴管的生成。HIF和VEGF均與缺血缺氧相關，可以在心肌缺血區(qū)域表達[18]。Nangaku等[19]研究發(fā)現(xiàn)，心肌中HIF的過表達能限制梗死區(qū)域，改善心臟功能并在缺血后血管新生中起作用。

鈣離子對于心肌的電活動及心內傳導非常重要，鈣離子濃度異常可以引起心律失常已得到廣泛認同。目前已經發(fā)現(xiàn)了一系列由高鈣血癥引起的心電異常，包括竇性停搏、房室阻滯、心動過速、室性顫動等[20-22]。在實驗中雖然不能控制注入CaCl2后所引起大鼠心律失常的類型，但可以保證的是，在實驗結束時用兩倍劑量CaCl2處死動物會出現(xiàn)惡性室性心律失常，如室性心動過速、室性顫動、心室撲動。本實驗并不是針對某種特定的心律失常進行研究，而是注重非特異性的致死性心律失常與心肌缺血的聯(lián)系。1985年Bayés等[23]曾分析157例猝死患者的動態(tài)心電圖，發(fā)現(xiàn)83.4%為室性快速型心律失常，16.5%為緩慢型心律失常；對其中的131例室性快速型心律失?；颊哌M一步歸類，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性室性纖維性顫動占8.28%、室性心動過速占62.42%、尖端扭轉型心律失常占12.7%，并且大部分室性纖維性顫動繼發(fā)于室性心動過速或是心室撲動。本實驗中，在大鼠最后致死過程中發(fā)生的心律失常類型與上述報道一致，說明應用CaCl2誘導心律失?？梢院芎玫啬M致死性心律失常的死亡過程。

CaCl2誘導心律失常的大鼠心肌HE染色并無特異性的改變，只能看到包括嗜伊紅染色增強、波浪樣變在內的非特異性改變，這些改變在急性心肌缺血中同樣可以見到。這樣的結果提示心律失常中可能存在著心肌缺血的改變，但并不能得出確切的結論。Zhu等[7]通過免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)，HIF、VEGF在心肌出現(xiàn)早期缺血改變的部位表現(xiàn)出強陽性，在出現(xiàn)壞死且不伴有炎癥浸潤的部位表達相對較弱，在缺乏形態(tài)學改變的SCD案例的心肌組織中偶見弱陽性表達。在本實驗中，發(fā)現(xiàn)HIF-1α和VEGF-A在心肌中呈現(xiàn)彌漫性表達，并且左、右心室在同一時間段沒有明顯區(qū)別，隨著時間的增加表達強度增加，但表達范圍未見改變。有文獻[8，9]報道，通過結扎冠狀動脈前降支造成冠狀動脈供血不足引起急性心肌缺血的大鼠心肌組織中，HIF-1α的陽性表達首先出現(xiàn)在左心室缺血區(qū)心內膜下，隨著缺血時間的延長，缺血范圍不斷擴大，HIF-1α的表達范圍也就逐漸增大，并由心內膜向心外膜滾動表達；VEGF-A最初為弱陽性表達，隨著缺血時間增加，表達逐漸增強，3h時廣泛表達于缺血區(qū)、缺血周邊區(qū)等心肌細胞及血管內皮細胞；兩者在右心室中未見陽性表達。上述改變與冠狀動脈的垂直供血方式有關，當相應冠狀動脈阻塞時，其支配的區(qū)域發(fā)生缺血。通過對比免疫組織化學染色結果可以得出結論，致死性心律失常大鼠心肌內HIF-1α和VEGF-A呈彌漫性表達，而冠狀動脈供血不足引起的急性心肌缺血中，HIF-1α和VEGF-A的表達集中在特定的冠狀動脈支配區(qū)域。

通過Western印跡法結果可以得出HIF-1α和VEGF-A蛋白的表達特點。實驗初期，HIF-1α表達立即上升，這說明心律失常一旦發(fā)生，心肌缺血就會相伴產生，而VEGF-A的表達升高則略有延遲。在缺氧狀態(tài)下培養(yǎng)的心肌細胞中，發(fā)現(xiàn)HIF-1可以使VEGF的量增加[24]，推測VEGF-A表達上的延遲來源于HIF-1對VEGF-A表達的誘導。6h時兩指標均出現(xiàn)明顯下降甚至低于對照組表達水平，這是由于長時間的心肌缺血導致心肌細胞合成mRNA的功能下降，相關文獻報道，在壞死的心肌細胞中，兩指標不表達[11，25]。HIF-1α和VEGF-A的表達貫穿整個心律失常的過程，說明整個過程中心肌處于持續(xù)缺血的狀態(tài)，最終使心肌由于長期缺血而合成mRNA的功能下降。本實驗中發(fā)現(xiàn)，HIF-1α的mRNA轉錄并不會立即增高，在15min才出現(xiàn)增高，mRNA的表達與蛋白質的表達有不同步的現(xiàn)象，推測0 min時HIF-1α蛋白量的升高正是由于早期缺血，是HIF-1α的積累作用，之后HIF-1α蛋白量的升高則來源于其表達的增加。HIF-1α和VEGFA mRNA的表達升高同樣說明在心律失常的整個過程中都有心肌缺血的參與。再次對比相關報道[8，9]中的實驗結果，發(fā)現(xiàn)HIF-1α和VEGF-A的表達規(guī)律在冠狀動脈供血不足引起的心肌缺血和心律失常中的不同；在心律失常致死的大鼠心肌組織中，兩種指標在早期的變化更為急驟，蛋白量的高峰出現(xiàn)較早，之后表達出現(xiàn)下降但仍處于高水平，而急性心肌缺血組在缺血發(fā)生后兩種指標的蛋白量不斷升高且變化比較平穩(wěn)，高峰出現(xiàn)較晚；6h時急性心肌缺血和心律失常中HIF-1α和VEGF-A蛋白量均下降，且在心律失常中下降幅度更大。推測可能是在心律失常的早期，由于心肌缺血是彌漫性的，對保護性指標的需求量瞬間增大，通過蛋白的積累和大范圍心肌細胞表達量的增加，使HIF-1α和VEGF-A的蛋白量在短時間內急劇增加；冠狀動脈供血不足引起的急性心肌缺血中缺血較為局限，僅局部缺血區(qū)的心肌細胞表達HIF-1α和VEGF-A，所以早期兩種指標的變化較平穩(wěn)。后期心律失常中缺血發(fā)生的范圍并沒有變化，雖然兩種指標仍是高表達，但由于不斷消耗和心肌細胞的損傷使得蛋白量出現(xiàn)了下降；冠狀動脈結扎引起的心肌缺血隨著時間的增加面積擴大，產生指標的細胞逐漸增多，兩種指標的表達量不斷增加。

通過研究大鼠心律失常后心肌組織中HIF-1α和VEGF-A的表達規(guī)律，我們可以確定在心律失常發(fā)生時可以引起心肌缺血，并且參與整個致死過程。進一步分析發(fā)現(xiàn)心肌缺血發(fā)生的區(qū)域和特點均與由冠狀動脈病變引起的急性心肌缺血不同：一是在致死性心律失常中，心肌缺血的發(fā)生是彌漫性的，心肌各處缺血情況無差別，而冠狀動脈病變引起的急性心肌缺血其缺血區(qū)域集中在發(fā)生病變的冠狀動脈支配區(qū)；二是心肌缺血發(fā)生在心律失常全過程中，早期即出現(xiàn)廣泛的嚴重心肌缺血，在這個過程中心肌缺血的區(qū)域并不發(fā)生變化，只是程度隨時間加重，而由冠狀動脈病變引起的急性心肌缺血是漸進性的，早期范圍小，隨著缺血時間延長范圍也逐漸擴大。

盡管在表達上VEGF-A略有延遲，但是至少在心律失常發(fā)生后的30 min可以檢測到HIF-1α和VEGF-A的蛋白表達和轉錄水平的升高。這種反應迅速的指標對致死性心律失常的死因鑒定提供了較為客觀、及時的依據(jù)。通過檢測一些敏感的、早期的缺氧、缺血相關指標如HIF-1α和VEGF-A，來明確心肌缺血的范圍和時間發(fā)展模式，結合心功能指標及形態(tài)學檢查，推斷此類心源性猝死是否由致死性心律失常引起，并且有助于致死性心律失常和冠狀動脈供血不足引起的急性心肌缺血的鑒別診斷。

[1]Basso C，Burke M，F(xiàn)ornes P，et al.Guidelines for autopsy investigation of sudden cardiac death[J].Virchows Arch，2008，452（1）：11-18.

[2]Wilms HR，Midgley DJ，Morrow P，et al.Evaluation of autopsy and police reports in the investigation of sudden unexplained death in the young[J]. Forensic Sci Med Pathol，2012，8（4）：380-389.

[3]Wang H，Yao Q，Zhu S，et al.The autopsy study of 553 cases of sudden cardiac death in Chinese adults[J].Heart Vessels，2014，29（4）：486-495.

[4]亢登峰，李曉英，王英元.1294例心源性猝死的回顧性分析[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2007，5（1）：63-65.

[5]王雷，陳驍，王曄，等.178例心源性猝死法醫(yī)組織病理學診斷分析[J].法醫(yī)學雜志，2007，23（3）：210-212.

[6]Semenza GL，Wang GL.A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation[J].Mol Cell Biol，1992，12（12）：5447-5454.

[7]Zhu BL，Tanaka S，Ishikawa T，et al.Forensic pathological investigation of myocardial hypoxia-inducible factor-1 alpha，erythropoietin and vascular endothelial growth factor in cardiac death[J].Leg Med（Tokyo），2008，10（1）：11-19.

[8]杜中波，毛瑞明，高衛(wèi)民，等.大鼠急性心肌缺血早期缺氧誘導因子-1α的表達[J].法醫(yī)學雜志，2012，28（5）：327-332.

[9]毛瑞明，杜中波，高衛(wèi)民，等.大鼠急性心肌缺血后血管內皮生長因子的表達變化[J].法醫(yī)學雜志，2012，28（3）：179-184.

[10]Blanco Pampín J，García Rivero SA，Otero Cepeda XL，et al.Immunohistochemical expression of HIF-1alpha in response to early myocardial ischemia[J].J Forensic Sci，2006，51（1）：120-124.

[11]Lee SH，Wolf PL，Escudero R，et al.Early expression of angiogenesis factors in acute myocardial ischemia and infarction[J].N Engl J Med，2000，342（9）：626-633.

[12]Salimbeni A，Manghisi E，F(xiàn)regnan GB，et al.Synthesis and antiarrhythmic activity of new 3-[2-（omegaaminoalkoxy）phenoxy]-4-phenyl-3-buten-2-onesand related compounds[J].J Med Chem，1987，30（5）：773-780.

[13]Grimaldi G，Maggi CA，Meli A.Influence of some psychotropic agents on CaCl2-induced arrhythmias in the rat[J].J Pharm Pharmacol，1981，33（3）：194.

[14]Wang GL，Jiang BH，Rue EA，et al.Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2tension[J].Proc Natl Acad Sci USA，1995，92（12）：5510-5514.

[15]Gu YZ，Hogenesch JB，Bradfield CA.The PAS superfamily：sensors of environmental and developmental signals[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol，2000，40：519-561.

[16]Jewell UR，Kvietikova I，Scheid A，et al.Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous[J].FASEB J，2001，15（7）：1312-1314.

[17]Jaakkola P，Mole DR，Tian YM，et al.Targeting of HIF-alpha to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation[J].Science，2001，292（5516）：468-472.

[18]Shibuya M，Claesson-Welsh L.Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis[J].Exp Cell Res，2006，312（5）：549-560.

[19]Nangaku M，Izuhara Y，Takizawa S，et al.A novel class of prolyl hydroxylase inhibitors induces angiogenesis and exerts organ protection against ischemia[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007，27（12）：2548-2554.

[20]Carpenter C，May ME.Case report：cardiotoxic calcemia[J].Am J Med Sci，1994，307（1）：43-44.

[21]Kiewiet RM，Ponssen HH，Janssens EN，et al. Ventricular fibrillation in hypercalcaemic crisis due to primary hyperparathyroidism[J].Neth J Med，2004，62（3）：94-96.

[22]Chang CJ，Chen SA，Tai CT，et al.Ventricular tachycardia in a patient with primary hyperparathyroidism[J].Pacing Clin Electrophysiol，2000，23（4 Pt 1）：534-537.

[23]Bayés de Luna A，Coumel P，Leclercq JF.Ambulatory sudden cardiac death：mechanisms of production of fatal arrhythmia on the basis of data from 157 cases[J].Am Heart J，1989，117（1）：151-159.

[24]Levy AP，Levy NS，Loscalzo J，et al.Regulation of vascular endothelial growth factor in cardiac myocytes[J].Circ Res，1995，76（5）：758-766.

[25]Zhao D，Zhu BL，Ishikawa T，et al.Real-time RT-PCR quantitative assays and postmortem degradation profiles of erythropoietin，vascular endothelial growth factor and hypoxia-inducible factor 1 alpha mRNA transcripts in forensic autopsy materials[J]. Leg Med（Tokyo），2006，8（2）：132-136.

The Changes of HIF-1α and VEGF-A in Myocardial Tissue of Rats with Arrhythmias

ZHANG Yuan1,CAO Zhi-peng1,MAO Rui-ming1,2,DU Zhong-bo1,MI Li1,LUO Xin-yi1,TIAN Mei-hui1, ZHU Bao-li1
（1.School of Forensic Medicine,China Medical University,Shenyang 110122,China;2.Public Security Department of Liaoning Provincial,Shenyang 110032,China;3.HeBei North University,Zhangjiakou 075000, China）

ObjectiveTo observe the expression changes of hypoxia inducible factor-1α（HIF-1α）and vascular endothelial growth factor-A（VEGF-A）in rats with arrhythmias,and to explore the differences of the expression pattern in the two indicators of acute myocardial ischemia caused by arrhythmias and coronary insufficiency.MethodsThe arrhythmia was induced by CaCl2,and the expression changes of HIF-1α and VEGF-A were detected by immunohistochemistry,Western blotting and real-time PCR within 6 h after the arrhythmia in rats.ResultsThe expression of HIF-1α and VEGF-A showed diffuse in the myocardial tissue of rats died from arrhythmias.Both of them increased in the early arrhythmia, then decreased.Extensive myocardial ischemia happened at the beginning of arrhythmia occurrence and its range didn’t expand with time.ConclusionThe expressions of HIF-1α and VEGF-A in myocardium of the rats with arrhythmia can provide evidence for the differential diagnosis of acute myocardial ischemia caused by fatal arrhythmia and coronary insufficiency.

forensic pathology;arrhythmias,cardiac;myocardium;hypoxia inducible factor 1;vascular endothelial growth factor-A;rats

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.03.002

1004-5619（2017）03-0225-07

2015-09-14）

（本文編輯：鄒冬華）

國家自然科學基金資助項目（81273343）

張圓（1988—），女，碩士研究生，主要從事法醫(yī)病理學研究；E-mail：zhangyuan0917@qq.com

朱寶利，男，教授，博士研究生導師，主要從事法醫(yī)病理學教學、研究及鑒定；E-mail：zhu1127@hotmail.com