卵巢顆粒細胞中胰島素和雄激素對芳香化酶和5α-還原酶1影響的研究

張璐，李安迪，2，楊楠，2，蔣葭葭，孫玉潔，2*

(1.南京醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院細胞生物學系，南京 211166；2.江蘇省人類功能基因組學重點實驗室，南京 211166)

卵巢顆粒細胞中胰島素和雄激素對芳香化酶和5α-還原酶1影響的研究

張璐1，李安迪1，2，楊楠1，2，蔣葭葭1，孫玉潔1，2*

(1.南京醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院細胞生物學系，南京 211166；2.江蘇省人類功能基因組學重點實驗室，南京 211166)

目的 研究卵巢顆粒細胞中胰島素對睪酮激素轉(zhuǎn)化過程的影響。 方法 選用人卵巢顆粒細胞瘤樣細胞系(KGN)作為研究對象。應用RT-PCR分析KGN細胞在梯度睪酮(1.25、2.5、5、10、20 ng/ml)及胰島素(1、10、100 ng/ml)處理4 h后CYP19a1和5RD5A1 mRNA水平；Western-blot檢測高濃度睪酮(10、20 ng/ml)及梯度胰島素處理KGN細胞24 h后芳香化酶和5α-還原酶1蛋白水平；同步收集上清，應用放射性免疫法及酶聯(lián)免疫法檢測培養(yǎng)液上清睪酮、雌二醇及雙氫睪酮的濃度。 結(jié)果 胰島素劑量依賴性地上調(diào)CYP19a1的表達和活性，增加睪酮向雌二醇的轉(zhuǎn)化；同時抑制5RD5A1的表達和活性，抑制睪酮向雙氫睪酮的轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化比例改變但消耗水平不變，導致睪酮的異常累積。 結(jié)論 高雄激素環(huán)境下，胰島素可通過影響睪酮轉(zhuǎn)化酶促使睪酮轉(zhuǎn)化異常。本實驗為高胰島素及高雄激素水平在卵巢微環(huán)境相互作用加劇PCOS病程提出了可能的機制。

顆粒細胞瘤樣細胞系； 胰島素； 睪酮； 芳香化酶； 5α-還原酶1

(JReprodMed2017，26(7)：711-717)

在卵巢顆粒細胞中，睪酮不僅可以向雌二醇轉(zhuǎn)化，也可向雙氫睪酮轉(zhuǎn)化。5α-還原酶1是將卵巢和其他組織中的睪酮轉(zhuǎn)化為雙氫睪酮的關鍵酶，由5RD5A1基因所編碼。5RD5A1發(fā)揮功能的最適pH比較廣泛[14-15]，而5RD5A2是在一個狹窄的酸性最適pH下發(fā)揮功能[15-16]，在卵巢中5α-還原酶1為主要作用酶。5α-還原酶1表達水平和活性降低會導致睪酮向雙氫睪酮的轉(zhuǎn)化被抑制，因而推斷可能這條轉(zhuǎn)化途徑發(fā)生異常導致PCOS患者卵巢局部出現(xiàn)睪酮異常累積。另據(jù)報道，大約60%～70%的PCOS患者具有胰島素抵抗的癥狀并伴隨有代償性的高胰島素血癥[17-18]，卵泡在高胰島素環(huán)境下對FSH刺激的敏感性明顯增強，使顆粒細胞合成過多的雌二醇。而胰島素對于睪酮向雙氫睪酮轉(zhuǎn)化的影響目前缺少明確報道。PCOS患者具有高雄激素水平的同時也伴隨著高胰島素水平，因而猜想高胰島素水平能夠?qū)е滦奂に剞D(zhuǎn)化異常，本研究選擇卵巢顆粒細胞瘤樣細胞系作為研究對象，探討高胰島素水平是否在促進睪酮向雌二醇轉(zhuǎn)化的同時抑制睪酮向雙氫睪酮的轉(zhuǎn)化導致睪酮的異常累積。

材料和方法

一、材料

1.研究對象：人顆粒細胞瘤樣細胞系(Human granulose-like tumor cell line，KGN)，由母義明教授惠贈。

2.主要試劑：DMEM/F12(1：1)培養(yǎng)基(GIBCO，美國)；胎牛血清(GIBCO，美國)；β-Actin抗體(Sigma，美國)；芳香化酶抗體(Santa Cruz，美國)；5α-還原酶1抗體(Abcam，美國)；HRP標記的羊抗兔IgG二抗(Santa Cruz，美國)；HRP標記的羊抗鼠IgG二抗(Santa Cruz，美國)；HRP標記的兔抗羊IgG二抗(Santa Cruz，美國)；睪酮，胰島素(Sigma，美國)。

二、方法

1.人顆粒細胞瘤樣細胞系KGN培養(yǎng)：KGN細胞以10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基(青霉素200 U/ml；鏈霉素100 μg/ml)條件培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。細胞密度達到90%時，應用含0.02% 乙二胺四乙酸(EDTA)·Na2的0.1% 胰酶消化，終止消化后細胞以3×105個/孔種于3.5 cm皿中。待細胞貼壁后，換含0.2% BSA的無酚紅的DMEM/F12饑餓培養(yǎng)12 h。分別按照空白對照組、梯度濃度胰島素(1、10、100 ng/ml)處理組、梯度濃度睪酮(1.25、2.5、5、10、20 ng/ml)進行加藥，處理4 h和24 h用于檢測CYP19a1和5RD5A1 mRNA及蛋白水平的變化；睪酮 (10、20 ng/ml)和胰島素(1、10、100 ng/ml)合并處理4 h及24 h進行相同檢測；24 h組同步檢測培養(yǎng)液上清中睪酮、雌二醇及雙氫睪酮的濃度。

對于物流配送企業(yè)來說，在高水平地滿足客戶對時間要求的前提下實現(xiàn)配送成本最低是其追求的主要目標，這就需要通過物流配送路徑優(yōu)化來實現(xiàn)。從配送中心到特定客戶配送活動可以通過運用科學的物流配送路徑優(yōu)化，實現(xiàn)企業(yè)的人工調(diào)度和車輛安排合理化，使得其運作效率更高的情況下，配送成本也能夠得到很好的控制，使物流配送企業(yè)獲得更有持續(xù)發(fā)展能力、更健康的發(fā)展前景。

2.RNA提取和實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time PCR)：采用Trizol法提取RNA，測濃度后以500 ng為模板按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Master Mix，TAKARA，日本)說明書進行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。以cDNA為模板進行RT-PCR，檢測CYP19a1和5RD5A1 mRNA表達水平。Real-time PCR按照(Roche Fast Start Universal SYBR Green Master，Roche，瑞士)說明書進行，計算方法如下：ΔCt=Ct(目的基因)—Ct Actin；ΔΔCt=ΔCt(處理組)—ΔCt(對照組)；轉(zhuǎn)錄水平=2-ΔΔCt×100%。引物合成序列如表1所示。

表1 引物序列

3.蛋白質(zhì)印跡檢測(Western blot)：細胞經(jīng)RIPA裂解液裂解提取蛋白，全程在冰上操作，運用BCA蛋白檢測法對蛋白進行定量檢測，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，室溫5%脫脂牛奶封閉1 h。然后加入一抗4℃孵育過夜，再加入HRP標記的二抗室溫孵育1 h?；瘜W發(fā)光成像系統(tǒng)(Chemiscope 350V，上海勤翔)檢測，Quantity One軟件對條帶進行灰度掃描檢測。目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參蛋白的灰度值校正誤差，得到目的蛋白相對表達量。

4.放射性免疫實驗及酶聯(lián)免疫吸附實驗：處理細胞的上清液經(jīng)收集后以12 000 r/min在4℃離心10 min，取上清分裝凍存在-80℃。睪酮及雌二醇水平采用I125標記的放射性免疫法測定，依照購于中國北方生物技術有限公司試劑盒說明書，使用γ測量儀檢測。雙氫睪酮采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測，按說明書的步驟使用酶標儀檢測(BioTek，美國)，檢測試劑盒購于美國ALPCO公司。

三、統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)應用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學分析。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行比較，組內(nèi)兩兩之間比較采用q檢驗；以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、胰島素對KGN細胞CYP19a1和5RD5A1表達的影響

使用單純的梯度濃度胰島素(1、10、100 ng/ml)處理KGN細胞4 h，胰島素濃度的選擇以低于、近似及高于人的生理濃度胰島素為參照[19]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)10及100 ng/ml的胰島素能夠顯著上調(diào)CYP19a1的mRNA表達(P<0.05)，而5RD5A1的mRNA表達沒有明顯變化(P>0.05)(圖1A)；梯度濃度的胰島素處理KGN細胞24 h時，檢測芳香化酶以及5α-還原酶1的蛋白表達水平(圖1B)，胰島素(10、100 ng/ml)能夠上調(diào)芳香化酶蛋白水平的表達(P<0.05)，而且劑量依賴性下調(diào)5α-還原酶1蛋白水平的表達(P<0.05)(圖1C)。結(jié)果提示，胰島素上調(diào)CYP19a1 mRNA和蛋白水平的表達，對5RD5A1的mRNA水平無顯著影響，但能夠抑制其蛋白水平的表達。

A：Real-time PCR檢測梯度濃度胰島素處理KGN細胞4 h后 CYP19a1及5RD5A1 mRNA水平；B～C：Western blot檢測梯度濃度胰島素處理KGN細胞24 h的芳香化酶和5-α還原酶1的蛋白水平；與胰島素0 ng/ml處理組比較，*，#P<0.05，**，##P<0.01 圖1 胰島素處理KGN細胞中CYP19a1和 5RD5A1 mRNA及蛋白水平

二、睪酮對KGN細胞CYP19a1及5RD5A1表達的影響

應用梯度濃度睪酮(1.25、2.5、5、10、20 ng/ml)處理KGN細胞4 h，CYP19a1的mRNA水平呈睪酮劑量梯度依賴性升高，在5、10、20 ng/ml劑量組均有顯著上升(P<0.05)；而5RD5A1的mRNA并沒有明顯變化(P>0.05)(圖2A)。同樣的，選取梯度濃度睪酮處理KGN細胞24 h，檢測睪酮對芳香化酶及5α-還原酶1蛋白水平的影響(圖2B)，結(jié)果顯示隨著濃度的升高，睪酮對芳香化酶及5α-還原酶1均顯示劑量依賴性上調(diào)作用(P<0.05)(圖2C)。

A：Real-time PCR檢測梯度濃度睪酮處理KGN細胞4 h后CYP19a1和5RD5A1的mRNA水平；B～C：Western blot檢測梯度濃度睪酮處理KGN細胞24 h芳香化酶及5α-還原酶1的表達水平；與睪酮0 ng/ml處理組比較，*，#P<0.05，**，##P<0.01睪酮換算至法定單位nmol/L，系數(shù)為0.0347圖2 睪酮處理KGN細胞中CYP19a1和 5RD5A1 mRNA及蛋白水平

三、高雄激素環(huán)境下，胰島素對KGN細胞CYP19a1及5RD5A1表達的影響

使用高濃度睪酮(10、20 ng/ml)模擬高雄激素環(huán)境，合并梯度濃度胰島素(1、10、100 ng/ml)處理KGN細胞4 h和24 h，檢測CYP19a1和5RD5A1的mRNA及蛋白水平的表達。結(jié)果顯示高濃度睪酮存在的情況下，胰島素處理能夠進一步劑量依賴性上調(diào)CYP19a1基因的表達(P<0.05)(圖3A)；同時劑量依賴性下調(diào)5RD5A1 mRNA的表達(圖3B)。與mRNA結(jié)果一致，Western blot(圖3 C、D、E)結(jié)果顯示高胰島素濃度能夠促進芳香化酶蛋白水平的表達(P<0.05)，且在睪酮20 ng/ml處理組更明顯；同時劑量依賴性抑制5α-還原酶1蛋白水平的表達(P<0.05)，同樣在高濃度睪酮20 ng/ml處理組更為明顯。

四、高雄激素環(huán)境下胰島素對睪酮轉(zhuǎn)化作用的影響

在睪酮(10、20 ng/ml)合并梯度濃度胰島素(1、10、100 ng/ml)處理24 h情況下，同步收集了細胞培養(yǎng)上清，檢測睪酮及睪酮的兩個轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(雌二醇和雙氫睪酮)的水平。結(jié)果顯示，上清中雌二醇的水平隨著胰島素濃度呈劑量依賴性增加(P<0.05)(圖4C)；雙氫睪酮的濃度在睪酮(20 ng/ml)處理時隨著胰島素濃度增高而降低(P<0.05)(圖4B)；而細胞培養(yǎng)上清未經(jīng)轉(zhuǎn)化的剩余睪酮濃度在梯度胰島素處理的情況下并沒有明顯的差異(P>0.05)(圖4A)。

討 論

PCOS是影響育齡期婦女最常見的內(nèi)分泌紊亂性疾病，主要表現(xiàn)在雄激素過多及排卵功能障礙，同時也存在胰島素抵抗及高胰島素血癥等代謝異常。目前胰島素抵抗在PCOS作用多集中在外周及經(jīng)典的靶器官，卵巢局部雄激素水平與胰島素抵抗的相互關系仍待研究。

胰島素抵抗被認為是PCOS發(fā)病的核心因素，具有胰島素抵抗的患者會伴隨有代償性的高胰島素血癥。據(jù)報道，PCOS患者外周血中的胰島素水平和雄激素水平呈正相關關系[20]，然而兩者在卵泡液中的相關性并不明確。高水平的胰島素可以刺激促性腺激素細胞激活而介導雌鼠不育；抑制胰島素信號之后可以明顯改善肥胖誘導的雌鼠不育[21]。在卵巢中，胰島素的作用包括促進激素合成、刺激葡萄糖代謝、影響基因轉(zhuǎn)錄等。據(jù)報道，高胰島素能夠直接刺激卵巢膜細胞中雄激素合成酶—P450C17，促進雄激素生成[12]；同時能夠降低雄激素結(jié)合球蛋白的產(chǎn)生[9]，從而增加游離睪酮的濃度。其機制可能是通過胰島素作用于垂體的胰島素受體，增強黃體生成素釋放并促進卵巢[10]和腎上腺[11]分泌雄激素。另有實驗證實二甲雙胍—胰島素增敏劑—可改善高胰島素血癥，進而降低雄激素水平，最終導致雌二醇水平的降低，促進卵泡有序生長[7，22]。在卵巢顆粒細胞中，胰島素能夠上調(diào)芳香化酶的表達，促進睪酮向雌二醇的轉(zhuǎn)化[23]，而這種刺激作用可能是由胰島素生長因子受體直接調(diào)節(jié)的。

A：Real-time PCR檢測高濃度睪酮合并胰島素處理KGN細胞中CYP19a1的mRNA水平；B：Real-time PCR檢測高濃度睪酮合并胰島素處理KGN細胞中5RD5A1的mRNA水平；C～E：Western blot檢測高雄激素水平下胰島素處理KGN細胞的芳香化酶及5α-還原酶1的表達水平；與胰島素0 ng/ml處理組比較，*，#P<0.05，**，##P<0.01,睪酮換算至法定單位nmol/L，系數(shù)為0.0347圖3 高雄激素環(huán)境下胰島素處理KGN細胞中CYP19a1和5RD5A1 mRNA和蛋白水平

A：培養(yǎng)液上清中睪酮的濃度；B：培養(yǎng)液上清中雙氫睪酮的濃度；C：培養(yǎng)液上清中雌二醇的濃度；與胰島素0 ng/ml處理組比較，*，#P<0.05，**，##P<0.01 睪酮換算至法定單位nmol/L，系數(shù)為0.0347圖4 高雄激素環(huán)境下胰島素對睪酮轉(zhuǎn)化作用的影響

高胰島素與高雄激素血癥一直是研究的熱點。睪酮也會影響到一些組織和細胞的胰島素敏感性，在培養(yǎng)女性脂肪細胞和子宮內(nèi)膜細胞時發(fā)現(xiàn)睪酮能夠降低細胞對葡萄糖的攝取，不論是在胰島素基底水平還是較高水平都有這種作用[24-25]。所以高胰島素和高雄激素之間是相互影響的。雄激素對于卵巢正常功能的發(fā)揮和女性生殖能力是必須的，對卵泡募集和生長具有促進作用，但過量的雄激素可致大量卵泡閉鎖。在高濃度的睪酮長期處理的鼠模型中，出現(xiàn)了大量卵泡閉鎖的現(xiàn)象[4]，與PCOS婦女人群出現(xiàn)的多囊卵巢類似。關于PCOS的高雄激素血癥的發(fā)病機制目前有多種解讀，主要為高胰島素血癥、卵巢膜細胞的活性過度增強造成的雄激素合成過多。而本研究對睪酮的轉(zhuǎn)化與高雄激素水平的維持增加了新的認識。

總之，本研究結(jié)果表明，在高雄激素環(huán)境的卵巢顆粒細胞中，高胰島素一方面上調(diào)CYP19a1基因和蛋白的表達，促進睪酮向雌二醇的轉(zhuǎn)化；另一方面抑制5RD5A1基因和蛋白的表達，睪酮向雙氫睪酮的轉(zhuǎn)化被抑制；睪酮轉(zhuǎn)化成雌二醇和雙氫睪酮的比例改變，但消耗并未增加，造成睪酮的異常“累積”。根據(jù)本結(jié)果可以推斷，卵巢局部高胰島素是導致卵巢局部維持高雄激素水平和高雌激素水平的重要誘因，為PCOS患者卵巢局部的高雄激素微環(huán)境的產(chǎn)生提出了新的機制，未來可在臨床中進行進一步的驗證。

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[編輯：羅宏志]

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《生殖醫(yī)學雜志》編輯部

Double-faced functions of insulin on CYP19a1 and 5RD5A1 under hyperandrogenism in ovarian granulosa cell

ZHANGLu1，LIAn-di1，2，YANGNan1，2，JIANGJia-jia1，SUNYu-jie1，2*

1.DepartmentofCellBiology，NanjingMedicalUniversity，Nanjing2111662.KeyLaboratoryofHumanFunctionalGenomicsofJiangsuProvince，Nanjing211166

Objective：To explore the effect of insulin on the aromatase (CYP19A1) and 5α-reductase1 (5RD5A1) under hyperandrogenism during the process of testosterone (T) transformation.

Methods：The mRNA expression levels of CYP19A1 and 5RD5A1 were measured by quantitative real-time PCR after 4 hours treatment of gradient insulin(1，10，100 ng/ml)and T (1.25，2.5，5，10，20 ng/ml) in KGN cells，and the protein expression of aromatase and 5α-reductase1 were detected by Western blot.Meantime，the supernatants of the cells were collected，and then T and estradiol(E2) levels were detected by radioactive immunoassay (RIA)，and dihydrotestosterone (DHT) was measured with enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).

Results：Insulin enhanced the aromatase expression in a concentration dependent manner.And this effect was elevated under the environment of high levels of T (10 and 20 ng/ml)，thus increasing the conversion of T to E2.Meanwhile，higher concentration of insulin suppressed the conversion of T to DHT through down-regulation of 5RD5A1 mRNA and protein level.The double effects lead to abnormal accumulation of testosterone.

Conclusions：High level of insulin defects T transformation process by affecting the aromatase and 5α-reductasse1.Our data offered a possible mechanism which interaction between hyperinsulinemia and hyperandrogenism exacerbates polycystic ovary syndrome (PCOS) condition.

KGN cell； Insulin； Aromatase； 5α-reductase 1； Testosterone

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.07.018

2017-03-06；

2017-03-19

國家科技部重點973 項目(2012CBA01306)

張璐，女，山東滕州人，碩士，細胞生物學專業(yè).(*

，Email：yujiesun@njmu.edu.cn)