高效液相色譜法測定發(fā)酵液中的D-核糖與葡萄糖

崔鳳杰，胡婉君，周玨，孫文敬，魏轉(zhuǎn)，徐勤華，劉長峰

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北石家莊050026；3.山東德普化工科技有限公司，山東泰安271200）

高效液相色譜法測定發(fā)酵液中的D-核糖與葡萄糖

崔鳳杰1，胡婉君1，周玨1，孫文敬1，魏轉(zhuǎn)2，徐勤華3，劉長峰3

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北石家莊050026；3.山東德普化工科技有限公司，山東泰安271200）

以RID為檢測器，建立高效液相色譜法定量測定發(fā)酵液中葡萄糖和D-核糖的方法。該方法的測定條件為：柱型Shodex Suger SH1011，流動相為0.005 mol/L的稀硫酸溶液，柱溫為50℃，進(jìn)樣量為10 μL。底物葡萄糖和產(chǎn)物D-核糖的出峰時(shí)間分別為11.573 min和13.313 min。得到底物葡萄糖和產(chǎn)物D-核糖的回歸方程分別為Y=6.868 4X-0.069 1和Y=6.556 5X+0.004 6，其中Y為葡萄糖或D-核糖的質(zhì)量濃度，X為對應(yīng)的峰面積。線性范圍在2 g/L～45 g/L時(shí)，該法精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均良好；葡萄糖的平均回收率為99.27%，D-核糖的平均回收率為99.61%，RSD值分別為0.38%和0.14%，說明本方法準(zhǔn)確可行。

D-核糖；高效液相色譜法；糖類檢測

D-核糖又稱D-呋喃核糖，是一種功能性的五碳糖，廣泛存在于核糖核酸、NAD、NADP及FAD等中，具有抗衰老、調(diào)節(jié)體內(nèi)血糖、血脂含量等功能[1-3]。D-核糖也是諸多藥物或食品添加劑合成的中間體和平臺化合物[4-5]。在工業(yè)生產(chǎn)中，D-核糖的發(fā)酵底物一般為淀粉水解糖，其主要成分為葡萄糖。因此，在微生物發(fā)酵生產(chǎn)D-核糖過程中，主要涉及底物葡萄糖和產(chǎn)物D-核糖的檢測和分析。目前，國際上公認(rèn)的D-核糖的檢測方法主要有苔黑酚法[6]和HPLC法。苔黑酚法[7]雖然有較高的實(shí)用性和經(jīng)濟(jì)性，但樣品的處理過程比較復(fù)雜，檢測時(shí)間也偏長，并且樣品中的葡萄糖對檢測結(jié)果的干擾性較大，可能會導(dǎo)致測定誤差較大。近年來，相關(guān)的國外文獻(xiàn)中有關(guān)D-核糖的檢測方法均為HPLC法[8-10]。

本文研究了HPLC-RID法同時(shí)檢測發(fā)酵液中D-核糖和葡萄糖，并對其進(jìn)行方法學(xué)考察[11-14]，為建立快速、簡便、準(zhǔn)確的D-核糖和葡萄糖的定量分析方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Agilent1100型高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；FA1004型電子分析天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2F型雙人雙面垂直凈化工作臺：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；YXQ-WF32型臥式方形壓力蒸汽滅菌鍋：天水華圓醫(yī)療器械有限公司；HYL-C型組合式搖床：太倉市強(qiáng)樂試驗(yàn)設(shè)備有限公司；DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；TGL-18M型臺式高速冷凍離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）UJS0717：江蘇大學(xué)生物工程研究所選育并保藏。

D-核糖發(fā)酵液：江蘇大學(xué)生物工程研究所自制；D-核糖：純度≥99%，Sigma-Aldrich；葡萄糖、硫酸：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇：色譜級，美國Tedia公司；純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備

斜面培養(yǎng)基（g/L）：山梨醇 5，蛋白胨 10，NaCl 2，酵母膏2，瓊脂20，用1 mol/L的 HCl或1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。該培養(yǎng)基用于菌種保藏及活化。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 20，酵母膏 3，K2HPO43，KH2PO41，用1 mol/L的HCl或1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。該培養(yǎng)基用于發(fā)酵種子液的制備。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：玉米淀粉水解液120 g/L（以葡萄糖計(jì)），玉米漿 15，（NH4）2SO47.5，酵母粉 1.0，MnSO4·H2O 0.05，CaCO320。用5 mol/L的HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。該培養(yǎng)基用于發(fā)酵生產(chǎn)D-核糖。

1.2.2 菌種活化及保藏

將配好的斜面培養(yǎng)基在121℃下滅菌20 min，待冷卻后接入一環(huán)菌種，并置于36℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h?？蓪⑴囵B(yǎng)好的斜面放置于4℃的冰箱中保藏。

1.2.3 種子培養(yǎng)

挑取試管中的一環(huán)菌種接至種子培養(yǎng)基中（每250 mL錐形瓶中裝20 mL種子培養(yǎng)基），在36℃、240 r/min組合式搖床上培養(yǎng)20 h。

1.2.4 D-核糖發(fā)酵液制備

將培養(yǎng)好的種子液按照10%的接種量，接種至裝有20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中進(jìn)行發(fā)酵，在36℃、240 r/min組合式搖床上培養(yǎng)。

1.2.5 D-核糖和葡萄糖標(biāo)品溶液制備

準(zhǔn)確稱取適量的D-核糖標(biāo)品（純度≥99%）和葡萄糖標(biāo)品（純度99%），用0.005 mol/L的稀硫酸溶液配制成不同濃度的D-核糖和葡萄糖混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，稀釋成的濃度分別為 2、4、5、6、8、10、15、30、45 g/L。

1.2.6 HPLC條件

色譜柱：ShodexSugerSH1011（8.0mmI.D×300mm）；流動相：0.005 mol/L的稀硫酸溶液；流速：0.6 mL/min；檢測器：示差檢測器；柱溫：50℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.7 D-核糖發(fā)酵液樣品預(yù)處理

利用臺式高速離心機(jī)，將D-核糖的發(fā)酵液在4 200 r/min下離心15 min，來除去菌體和其他雜質(zhì)，并將上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后用0.45 μm的水系微孔濾膜過濾后備用。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 D-核糖和葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

先分別將葡萄糖和D-核糖的標(biāo)品溶液進(jìn)行HPLC分析，再在相同的條件下對底物葡萄糖和產(chǎn)物D-核糖的混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1和圖2所示。從圖中可以看出，葡萄糖的保留時(shí)間為11.573 min，D-核糖的保留時(shí)間為13.313 min。

相同色譜條件下，用HPLC依次測定濃度為2、4、5、6、8、10、15、30、45 g/L 的 D-核糖和葡萄糖的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并記錄不同的峰面積。再對混合液的色譜圖峰面積測定結(jié)果進(jìn)行線性回歸，得到的葡萄糖線性回歸方程為：Y=6.868 4X-0.069 1；D-核糖的線性回歸方程為：Y=6.556 5X+0.004 6，式中Y為葡萄糖或D-核糖的質(zhì)量濃度（g/L），X為對應(yīng)的峰面積。葡萄糖的線性回歸方程的決定系數(shù)R2=0.999 9，D-核糖的線性回歸方程的決定系數(shù)R2=0.999 8，t檢驗(yàn)和F檢驗(yàn)的結(jié)果都表示為顯著，說明葡萄糖和D-核糖在質(zhì)量濃度為2 g/L～45 g/L的范圍內(nèi)都成良好的線性關(guān)系，葡萄糖和D-核糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3和4所示。

2.2 精密度試驗(yàn)

隨機(jī)抽取一組樣品溶液來進(jìn)行精密度的測定。用HPLC對該樣品進(jìn)行連續(xù)重復(fù)測定5次，并記錄峰面積值，并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，具體結(jié)果如表1所示，葡萄糖和D-核糖的RSD值分別為0.68%和0.84%，表明本方法精密度良好。

圖1 葡萄糖和D-核糖標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖Fig.1 HPLC spectrum of glucose and D-ribose standands

圖2 葡萄糖和D-核糖混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖Fig.2 HPLC spectrum of mixed glucose and D-ribose standards

圖3 高效液相色譜測定葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of glucose determined by HPLC

圖4 高效液相色譜測定D-核糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of D-ribose determined by HPLC

表1 精密度結(jié)果Table 1 Precision of experiment results

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

穩(wěn)定性結(jié)果見表2。將樣品溶液在室溫下放置0、1、2、3、4 h后，在相同的色譜條件下用HPLC測定其峰面積值。再根據(jù)相應(yīng)的線性回歸方程來計(jì)算樣品溶液中的葡萄糖和D-核糖的質(zhì)量濃度，其RSD值分別為1.89%和1.94%，由表2分析可知樣品溶液在4 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

表2 穩(wěn)定性結(jié)果Table 2 Stability of experiment results

2.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取5份相同的D-核糖發(fā)酵液，在相同的色譜條件下，用HPLC測定并記錄峰面積值。依據(jù)線性回歸方程計(jì)算發(fā)酵液中葡萄糖和D-核糖的質(zhì)量濃度，其RSD值分別為1.23%和1.17%，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本法重現(xiàn)性較好（表 3）。

表3 重現(xiàn)性結(jié)果Table 3 Reproducibility of experiment results

2.5 加標(biāo)回收率

加標(biāo)回收率是檢驗(yàn)待測樣品在前處理和儀器檢測中的損失情況，以此來評估檢測方案的可行性。準(zhǔn)確吸取5份體積為25 mL，葡萄糖和D-核糖的質(zhì)量濃度分別為26.35 g/L和20.21 g/L的D-核糖發(fā)酵液于50 mL的容量瓶中，分別向這5份溶液中加入5 mL的葡萄糖和D-核糖的質(zhì)量濃度都為2.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液。用0.005 mol/L的稀硫酸溶液定容至50 mL后，用HPLC測定并記錄各峰面積值，再依據(jù)線性回歸方程來計(jì)算溶液中葡萄糖和D-核糖的質(zhì)量濃度。結(jié)果如表4所示，葡萄糖的平均回收率為99.27%，D-核糖的平均回收率為99.61%，RSD值分別為0.38%和0.14%，說明本方法準(zhǔn)確可行。

表4 加標(biāo)回收率結(jié)果Table 4 Recovery rates of experiment results

3 結(jié)論

本文以RID為檢測器，建立了HPLC-RID同時(shí)定量檢測了發(fā)酵液中D-核糖和葡萄糖的方法，方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好。所采用的色譜條件可將底物葡萄糖和產(chǎn)物D-核糖有效分離，顯著減少了葡萄糖對D-核糖檢測結(jié)果的干擾。該方法的建立為同時(shí)定量分析發(fā)酵液中D-核糖和葡萄糖和準(zhǔn)確評價(jià)生產(chǎn)菌株的葡萄糖利用效率和D-核糖合成得率提供了技術(shù)支持。

[1]王亞坤,孫文敬,秦麗,等.D-核糖功能與應(yīng)用研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2005,26(8)：486-489

[2]秦海宏,王小平,郭俊生,等.D-核糖對果蠅抗衰老和小鼠耐缺氧時(shí)間的影響[J].中國老年學(xué)雜志,2002,22(1)：49-51

[3]阿麗瑪,田明杰,韓濤,等.D-核糖對高脂喂飼小鼠胰島素抵抗的影響[J].營養(yǎng)學(xué)報(bào),2013,35(2)：142-145

[4]PARK YC,KIM SG,PARK K,et al.Fed-batch production of D-ribose from sugar mixtures by transketolase-deficient Bacillus subtilis SPK1[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2004,66(3)：297-302

[5]于文兵,嚴(yán)正,高麗麗,等.核糖與運(yùn)動能力[J].南京體育學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2002,1(3)：1-9

[6]寧正祥.食品成分分析手冊[M].北京：中國輕工業(yè)出版社,1998：20-21

[7]伍時(shí)華,方杰.地衣酚法定量測定發(fā)醇液中D-核糖的研究[J].廣西工學(xué)院學(xué)報(bào),2000,11(4)：55-58

[8]SRIVASTAVA RK,MAITI SK,DAS D,et al.Metabolic flexibility of d-ribose producer strain of Bacillus pumilus under environmental perturbations[J].Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology,2012,39(8)：1227-1243

[9]DE WULF P,SOETAERT W,SCHWENGERS D,et al.Screening and mutational improvement of a D-ribose secreting Candida pelliculosa strain[J].Journal of Fermentation and Bioengineering,1996,82(1)：1-7

[10]PARK YC,CHOI JH,BENNETT GN,et al.Characterization of D-ribose biosynthesis in Bacillus subtilis JY200 deficient in transketolase gene[J].Journal of Biotechnology,2006,121(4)：508-516

[11]鄒小娟,謝和兵,錢芳,等.HPLC法測定苦杏仁中苦杏仁苷含量的方法研究[J].中國藥事,2009(1)：33-36

[12]戴助.HPLC法測定眼用伏立康唑納米結(jié)晶混懸液含量[J].長江大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版：醫(yī)學(xué)(下旬),2014,11(8)：90-92

[13]張建輝,楊代明,吳廷瑞,等.HPLC法和紫外分光光度法測定葛根淀粉中葛根素含量的研究[J].食品與機(jī)械,2007,22(6)：110-112

[14]王靜,韓正洲,楊立偉,等.HPLC和UPLC法對比測定千里香藥材中九里香酮的含量[J].藥物分析雜志,2010(8)：1499-1501

Determination of D-Ribose and Glucose by High Performance Liquid Chromatography Detection

CUI Feng-jie1，HU Wan-jun1，ZHOU Jue1，SUN Wen-jing1，WEI Zhuan2，XU Qin-hua3，LIU Chang-feng3
（1.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，Jiangsu，China；2.Hebei Chemical and Pharmaceutical College，Shijiazhuang 050026，Hebei，China；3.Shandong Depu Chemical Technology Co.，Ltd.，Tai'an 271200，Shandong，China）

A rapid HPLC method for simultaneously and quantitatively determining the D-ribose and glucose with RID-detector was established as：Shodex Suger SH1011 column，0.005 mol/L of diluted sulfuric acid solution as the mobile phase，column temperature of 50 ℃ and the injection volume was 10 μL.Retention time of glucose and D-ribose was 11.573 min and 13.313 min，respectively.The regression equations of glucose and D-ribose were Y=6.868 4X-0.069 1 and Y=6.556 5X+0.004 6，respectively，in which Y means concentration of glucose/D-ribose and X means the peak area ratio.Within the linear range of 2 g/L-45 g/L，the precision，stability and reproducibility of the established method was good.The average coefficient of recovery of glucose and D-ribose were 99.27%and 99.61%，RSD were 0.38%and 0.14%respectively，which revealed that the method was accurate and credible.

D-ribose；high performance liquid chromatography（HPLC）；determination of saccharide

2016-10-09

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.031

山東省泰安市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（201340629）；江蘇大學(xué)“青年骨干教師培養(yǎng)工程”青年學(xué)術(shù)帶頭人培育計(jì)劃項(xiàng)目；江蘇大學(xué)高級專業(yè)人才科研啟動基金項(xiàng)目（08JDG029）

崔鳳杰（1980—），男（漢），教授，博士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。