鮮地黃花不同部位環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分含量測(cè)定

于文娜，張振凌，李柯柯，劉艷，王勝超，趙丹

（河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南鄭州450003）

鮮地黃花不同部位環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分含量測(cè)定

于文娜，張振凌*，李柯柯，劉艷，王勝超，趙丹

（河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南鄭州450003）

比較鮮地黃花不同部位梓醇，毛蕊花糖苷，地黃苷D及益母草苷含量，為地黃花的藥用及食用提供一定參考。采用 HPLC法測(cè)定，Waters-Symmetry ShieldTMRP18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），梓醇：流動(dòng)相乙腈-水（1∶99），流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣10 μL。毛蕊花糖苷：流動(dòng)相乙腈-0.1%醋酸溶液（18∶82），流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 334 nm，柱溫 30 ℃，進(jìn)樣 20 μL。地黃苷 D、益母草苷：SunFireTMC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，乙腈-水（3∶97）為流動(dòng)相；流速 1 mL/min；柱溫 30℃；檢測(cè)波長(zhǎng) 203 nm；進(jìn)樣 20 μL。梓醇含量：花瓣>花梗>花托，最高為9.52%；毛蕊花糖苷含量：花瓣>花托>花梗，最高為0.53%；地黃苷D含量：花瓣>花梗>花托，最高為0.09%；益母草苷含量：花托>花梗>花瓣，最高為0.19%。地黃花中不同部位其有效成分含量存在顯著差異。

地黃花；不同部位；梓醇；毛蕊花糖苷；地黃苷D；益母草苷

地黃花為玄參科植物地黃的花蕾，其功效與作用為治消渴，腎虛腰痛[1]?！侗静輬D經(jīng)》記載：“為末服食，功同地黃?！薄毒V目》曰：“治腎虛，腰脊痛，為末酒服方寸匕，日三。”且《圣濟(jì)總錄》中有地黃花粥的記載。近年來(lái)，地黃花也被用于藥膳偏方之中，如地黃花粥可治療消渴癥等。環(huán)烯醚萜苷類(lèi)化合物梓醇和苯乙醇苷類(lèi)化合物毛蕊花糖苷是地黃藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)性成分。且現(xiàn)代藥理研究表明梓醇具有神經(jīng)保護(hù)、降血糖、利尿、緩瀉、抗癌、抗炎等作用[2]；毛蕊花糖苷具有雄性激素樣作用[3]，以及抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)心血管活性等作用[4]；地黃苷等環(huán)烯醚萜苷成分研究較多，具有明顯的補(bǔ)血作用，尤其對(duì)骨髓造血功能具有促進(jìn)作用[5]。因此本試驗(yàn)通過(guò)HPLC法測(cè)定地黃花不同部位梓醇，毛蕊花糖苷，地黃苷D及益母草苷含量，并進(jìn)行比較分析，以期為地黃花的藥用及食用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

FW-200型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；e2695型高效液相色譜儀：美國(guó)Waters公司。

1.2 材料與試劑

鮮地黃花采自河南省溫縣宛西地黃種植基地，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)科董誠(chéng)明教授鑒定為玄參科植物地黃（Rehmannia glutinosa Libosch）的新鮮花蕾（冷凍干燥品）；梓醇標(biāo)準(zhǔn)品（生產(chǎn)批號(hào)110808-201210）、毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（生產(chǎn)批號(hào)111530-201411）：中國(guó)食品藥品檢定研究院；地黃苷D標(biāo)準(zhǔn)品（生產(chǎn)批號(hào)Y19J6F1）、益母草苷標(biāo)準(zhǔn)品（生產(chǎn)批號(hào)L10A6Y2298）：上海源葉生物科技有限公司；乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 梓醇色譜條件

Waters-Symmetry ShieldTMRP18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-水（1 ∶99）為流動(dòng)相，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫30℃。進(jìn)樣量10 μL，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 鮮地黃花HPLCFig.1 HPLC of fresh rehmanniae flowers

2.1.2 毛蕊花糖苷色譜條件

Waters-Symmetry ShieldTMRP18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-0.1%醋酸溶液（18∶82）為流動(dòng)相，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)334 nm，柱溫30℃。進(jìn)樣量20 μL，色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2Fig.2 HPLC of fresh rehmanniae flowers

2.1.3 地黃苷D、益母草苷色譜條件

SunFireTMC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，乙腈-水（3∶97）為流動(dòng)相；流速 1 mL/min；柱溫 30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；進(jìn)樣量：20 μL，色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 鮮地黃花HPLCFig.3 HPLC of fresh rehmanniae flowers

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱(chēng)取適量梓醇及毛蕊花糖苷對(duì)照品于5 mL和10 mL容量瓶中，地黃苷D及益母草苷標(biāo)準(zhǔn)品于2 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.93 mg/mL的梓醇對(duì)照品溶液，1.01 mg/mL的毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液，0.29 mg/mL的地黃苷D對(duì)照品溶液及0.39 mg/mL的益母草苷對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 梓醇及毛蕊花糖苷供試品溶液制備

分別取地黃花瓣，花托及花梗0.8 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱(chēng)定重量，加熱回流提取1.5 h，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液（梓醇10 mL，毛蕊花糖苷20 mL）于蒸發(fā)皿中，60℃水浴濃縮至近干，殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶解并定容至10 mL（梓醇）和5 mL（毛蕊花糖苷）容量瓶中，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，備用。

2.3.2 地黃苷D及益母草苷供試品溶液制備

分別取地黃花瓣，花托，花梗約1.0 g，精密稱(chēng)定，置于150 mL具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇水溶液100 mL，輕輕振搖使其與溶劑充分接觸并混勻，稱(chēng)定重量，超聲輔助提?。?0 kz，500 W）40 min，取出冷卻至室溫，稱(chēng)定重量，以提取溶劑補(bǔ)足失重，過(guò)濾，棄去初濾液，精密量取20 mL續(xù)濾液于蒸發(fā)皿中，60℃水浴濃縮至近干，以流動(dòng)相溶解并定容至5 mL容量瓶中，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，備用。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取梓醇，毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液1、5、10、15、20 μL，地黃苷 D 及益母草苷對(duì)照品溶液 1、3、5、7、9 μL，按 2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，得線性回歸方程分別為Y=260 336X-39 493（R2=0.999 8），Y=2×106X-690 748（R2=0.999 9），Y=513 027X-46 894（R2=1.000），Y=542 565X-71 693（R2=1.000），線性范圍依次為 0.93 μg～18.6 μg、1.01 μg～20.2 μg、0.29 μg～2.61 μg、0.39 μg～3.51 μg。

2.5 精密度試驗(yàn)

取地黃花瓣供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，計(jì)算梓醇，毛蕊花糖苷，地黃苷D及益母草苷峰面積積分值的RSD分別為0.91%、0.52%、1.47%、1.88%。說(shuō)明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取地黃花瓣樣品，按2.3項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果梓醇，毛蕊花糖苷，地黃苷D及益母草苷峰面積積分值的RSD分別為0.58%、1.72%、0.34%、0.27%。說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取地黃花瓣供試品溶液，分別在 0、2、4、8、12、24 h按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果梓醇，毛蕊花糖苷，地黃苷D及益母草苷峰面積積分值的RSD分別為1.15%、0.47%、0.46%、0.30%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取地黃花托6份，每份0.4 g，分別精密加入梓醇（4.01 mg/mL）5 mL，毛蕊花糖苷（1.47 mg/mL）對(duì)照品溶液1 mL，以2.3.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液；取地黃花托6份，每份0.5 g，分別精密加入地黃苷D（0.26 mg/mL）1 mL，益母草苷（0.97 mg/mL）1 mL對(duì)照品溶液，以2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果梓醇，毛蕊花糖苷，地黃苷D及益母草苷回收率RSD值分別為1.28%、1.23%、0.80%、0.93%，說(shuō)明回收率良好，該方法準(zhǔn)確可靠。梓醇及毛蕊花糖苷具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 梓醇及毛蕊花糖苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Recovery tests of catalpol，verbascoside in fresh of rehmanniae flowers

2.9 樣品測(cè)定

取地黃花瓣，花托，花梗樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行3份，根據(jù)水分測(cè)定結(jié)果換算為干燥品計(jì)算地黃花不同部位中梓醇，毛蕊花糖苷，地黃苷D及益母草苷的含量，取平均值，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 地黃花不同部位梓醇，毛蕊花糖苷，地黃苷D及益母草苷含量測(cè)定Table 2 Contents of catalpol，verbascoside ，rehmaionoside D and leonuride in rehmanniae flowers

結(jié)果表明梓醇，毛蕊花糖苷及地黃苷D以地黃花瓣中含量最高，益母草苷在地黃花托中含量為最高。

3 討論

本試驗(yàn)在藥典法的基礎(chǔ)上，對(duì)地黃花不同部位梓醇及毛蕊花糖苷進(jìn)行含量測(cè)定，對(duì)梓醇含量測(cè)定流動(dòng)相進(jìn)行調(diào)整，最終采用乙腈-水（1∶99）；同時(shí)調(diào)整毛蕊花糖苷含量測(cè)定流動(dòng)相比例為乙腈-0.1%醋酸（18∶82）。在相關(guān)研究文獻(xiàn)[6-7]的基礎(chǔ)上，采用HPLC法同時(shí)測(cè)定地黃花中地黃苷D及益母草苷3種有效成分含量，并適當(dāng)調(diào)整流動(dòng)相比例，最終確立采用乙腈-水（3 ∶97）。

本研究采用的新鮮地黃花樣品，因其不易保存，故均通過(guò)本試驗(yàn)室冷凍干燥設(shè)備自制成地黃花冷凍干燥品，以備試驗(yàn)使用。由試驗(yàn)結(jié)果可知，地黃花不同部位梓醇等有效成分含量雖存在很大差異，但其含量均較高。其中梓醇，毛蕊花糖苷及地黃苷D含量在地黃花瓣中為最高，分別為9.52%、0.53%、0.09%，益母草苷含量則在地黃花托中為最高，0.19%。這不僅說(shuō)明在以地黃花為材料的藥膳偏方對(duì)于相關(guān)疾病的輔助治療方面有一定現(xiàn)實(shí)應(yīng)用價(jià)值，而且也為地黃花的使用提供理論和科學(xué)依據(jù)。且梓醇，毛蕊花糖苷等是地黃中的主要有效成分，通過(guò)比較地黃花不同部位（花瓣，花托及花梗）有效成分含量，發(fā)現(xiàn)均超過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]鮮地黃中梓醇等有效成分含量，可考慮將地黃花入藥或者作為提取物的制備原料，為地黃擴(kuò)大藥源及食品相關(guān)領(lǐng)域提供參考。

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Determination of the Content of Iridoid Glycosidein from Different Parts of the Fresh Rehmanniae Flowers

YU Wen-na，ZHANG Zhen-ling*，LI Ke-ke，LIU Yan，WANG Sheng-chao，ZHAO Dan
（Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450003，Henan，China）

Compared the contents of catalpol，verbascoside ，rehmaionoside D and leonuride in rehmanniae flowers，for the flower's medicinal and edible aspects provide certain reference.Contents of catalpol，verbascoside ，rehmaionoside D and leonuride were determined by HPLC，Waters-Symmetry ShieldTMRP18 column（4.6 mm × 250 mm，5 μm），catalpol：a mobile phase of acetonitrile-water （1 ∶99）was used，flow rate was 1 mL/min，column temperature was set at 30 ℃ ，a UV detector was applied with wavelength of 210 nm，sample volume10μL.Verbascoside：a mobile phase of acetonitrile-0.1%acetic acid solution （18 ∶82）as mobile phase，flow rate was 1 mL/min，column temperature was set at 30 ℃ ，a UV detector was applied with wavelength of 334 nm，sample volume 20 μL.Rehmaionoside D and leonuride：SunFireTMC18 column（4.6 mm × 250 mm，5 μm），a mobile phase of acetonitrile-water （3 ∶97）was used，flow rate was 1 mL/min，column temperature was set at 30 ℃ ，a UV detector was applied with wavelength of 203 nm，sample volume 20 μL.The content of catalpol content：petals>pedicel>receptacle，as high as 9.52%；verbascoside content：petals>receptacle>peduncle，up to 0.53%；rehmaionoside D levels：petals>pedicel>receptacle，as high as 0.09%；leonuride content：receptacle>pedicel>petals，as high as 0.19%.There are significant differences among different parts of the active ingredient content of rehmanniae flowers.

fresh rehmannine flowers；different parts；catalpol；verbascoside；rehmaionoside D；leonuride

2016-10-24

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.028

公益性科研專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目（201507002）；科研創(chuàng)新基金項(xiàng)目（教科計(jì)[2013]638號(hào)）

于文娜（1990—），女（漢），在讀研究生，研究方向：中藥飲片及新藥研究。

*通信作者：張振凌，從事中藥飲片及新藥研究。