固定化纖維素酶提取牡丹葉黃酮的研究

李佩艷，尹飛

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽471023；2.河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南洛陽471023）

固定化纖維素酶提取牡丹葉黃酮的研究

李佩艷1，尹飛2

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽471023；2.河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南洛陽471023）

以大孔樹脂DM130為載體，考察給酶量、戊二醛濃度、固定化溫度、固定化時(shí)間4個單因素對固定化纖維素酶提取牡丹葉黃酮的影響，通過正交試驗(yàn)確定固定化纖維素酶提取牡丹葉黃酮的最佳提取工藝。試驗(yàn)結(jié)果表明，DM130大孔吸附樹脂固定化纖維素酶的最佳工藝參數(shù)為：纖維素酶濃度為1.25 mL/g固定化載體、戊二醛濃度為2%、固定化溫度為50℃、固定化時(shí)間為3 h，牡丹葉黃酮提取率可達(dá)1.95%。制備的固定化酶使用4次后牡丹葉黃酮提取率仍達(dá)固定化酶第一次提取時(shí)的85.13%，說明制備的固定化纖維素酶在牡丹葉黃酮提取中具有良好的效果。

纖維素酶；大孔樹脂；固定化；牡丹葉；黃酮

大孔樹脂是人工合成的多孔立體結(jié)構(gòu)聚合物，比表面積較大，具有不溶于酸、堿、有機(jī)溶劑等特點(diǎn)，已廣泛用于多種活性成分的提取[1-2]。大孔樹脂可作為固定化酶載體，可通過范德華力或氫鍵等分子間作用力對酶分子進(jìn)行吸附，再通過交聯(lián)劑戊二醛提高其吸附穩(wěn)定性而制備固定化酶[3]。目前已有很多研究報(bào)道表明采用大孔樹脂固定化脂酶[4]、果膠酶[5]、脂肪酶[6-7]、核酸酶[8]，均取得較好的固定化效果。由于大孔樹脂價(jià)格低廉，制備固定化酶方法簡便，極易回收利用，且重復(fù)利用次數(shù)多，因此大孔樹脂作為固定化酶的載體越來越受到關(guān)注。

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.），毛莨科、芍藥屬，是重要的觀賞植物和藥用植物。牡丹種質(zhì)資源豐富，種植面積大，在我國已經(jīng)成為廣泛栽培的一種經(jīng)濟(jì)作物，主要分布于河南、山東、湖北、甘肅、重慶、安徽等省[9]。對牡丹的研究大都集中在牡丹花上[10-12]，對于牡丹葉的研究報(bào)道較少。牡丹葉是牡丹的主要副產(chǎn)品，其產(chǎn)量也相當(dāng)可觀，每年花期過后大量的牡丹葉無人問津，造成了極大的浪費(fèi)。牡丹葉含有黃酮等多種活性物質(zhì)[13-14]，開發(fā)利用價(jià)值大，若對其進(jìn)行深加工利用，則會產(chǎn)生極大的經(jīng)濟(jì)效益。

酶法提取是黃酮類化合物提取常用的方法之一，它在有機(jī)溶劑提取的基礎(chǔ)上，利用纖維素酶、果膠酶等將細(xì)胞壁降解，使植物中的有效成分暴露出來，從而提高其提取效果[15]；其中纖維素酶在黃酮類化合物提取中應(yīng)用較多，很多文獻(xiàn)報(bào)道纖維素酶可提高植物黃酮提取得率[16-17]。然而，目前酶法提取牡丹葉黃酮大都采用游離酶提取[18]，酶不能回收反復(fù)利用，因此酶消耗量大，造成了極大的浪費(fèi)；如果將酶制備成固定化酶則可重復(fù)利用，這將大大降低黃酮提取過程中酶的用量，減少不必要的浪費(fèi)，降低黃酮提取的成本。因此，本試驗(yàn)采用大孔樹脂為載體固定纖維素酶，并將制備的固定化酶應(yīng)用到牡丹葉黃酮的提取，為牡丹葉黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡丹葉：采摘于河南科技大學(xué)，品種為“洛陽紅”；大孔樹脂（S-8、D101、AB-8、DM130、X-5 樹脂）：安徽三星樹脂科技有限公司；纖維素酶（酶活力單位為10 000 U/mL）：和氏璧生物技術(shù)有限公司；戊二醛、氫氧化鈉：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙醇：天津市鼎盛鑫化工有限公司；亞硝酸鈉：天津市福晨化學(xué)試劑廠；硝酸鋁：天津市化學(xué)試劑三廠；鹽酸：陜西化學(xué)試劑一廠；3，5-二硝基水楊酸（DNS）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器

101-2-BS電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；722N 722N型分光光度計(jì)：上海市精科儀器廠；HH-4恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市億通電子有限公司；臺式循環(huán)水真空泵：河南省鞏義市英峪儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 固定化纖維素酶的制備方法及酶活力測定

大孔樹脂預(yù)處理方法參照趙玉芬等[19]方法進(jìn)行。將經(jīng)過預(yù)處理的大孔樹脂抽干，準(zhǔn)確稱取1.0 g樹脂于三角瓶中，加入1 mL纖維素酶溶液（酶活力單位為100 00 U/mL），混勻，將三角瓶置于搖床上，室溫下吸附一段時(shí)間后加入戊二醛交聯(lián)，之后收集樹脂并抽干，洗滌后得到固定化纖維素酶。

采用王華等[20]方法測定固定化纖維素酶活性。在50℃、pH 4.8條件下，取1 g固定化酶，加入2 mL 1%羧甲基纖維素鈉溶液，50℃水浴30 min，加入6 mL DNS試劑振搖后，沸水浴10 min，冷卻，加蒸餾水定容至50 mL，用紫外分光光度法測定溶液在540 nm下的吸光度值。固定化纖維素酶活定義為：1 g固定化酶在50℃、pH 4.8條件下，每分鐘水解底物羧甲基纖維素鈉產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需的酶量為1個酶活性單位（U）。

1.3.2 牡丹葉黃酮提取及測定方法

固定化纖維素酶法提取牡丹葉黃酮參照李佩艷等[14]方法進(jìn)行。準(zhǔn)確稱取牡丹葉粉末1.0 g，加入蒸餾水40 mL，調(diào)節(jié)pH值為4.5，加入1 g固定化纖維素酶，酶解溫度為45℃下酶解4 h，30目篩過濾，加入60%乙醇溶液在70℃下浸提3 h，定溶至100 mL，測定牡丹葉黃酮含量，按下式計(jì)算牡丹葉黃酮提取率。

牡丹葉黃酮提取率/%=牡丹葉中提取黃酮質(zhì)量/牡丹葉質(zhì)量×100

1.3.3 纖維素酶固定化載體的篩選

以 S-8、D101、AB-8、DM130、X-5 大孔吸附樹脂作為固定化纖維素酶的載體，各取上述大孔樹脂1.00 g，按照1.3.1方法固定化纖維素酶，按1.3.2方法測定不同固定化纖維素酶對牡丹葉黃酮提取率的影響，確定纖維素酶的最佳固定化載體。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

分別考察給酶量（0、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5 mL/g固定化載體）、戊二醛濃度（1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%）、固定化溫度（30、40 、50、60、70 ℃）、固定化時(shí)間（1、2、3、4、5、6、7 h）對牡丹葉黃酮提取率的影響。

1.3.5 正交試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)，得出固定化纖維素酶提取牡丹葉黃酮的最佳工藝參數(shù)。

1.3.6 固定化纖維素酶重復(fù)利用次數(shù)對牡丹葉黃酮提取率的影響

按1.3.2方法進(jìn)行牡丹葉黃酮提取，1.0 g牡丹葉粉末，加入1 g固定化酶進(jìn)行酶解提取，之后將固定化酶回收，用蒸餾水清洗3遍，重復(fù)使用，考察固定化纖維素酶重復(fù)利用次數(shù)對牡丹葉黃酮提取率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化載體的選擇

不同載體制備固定化纖維素酶對牡丹葉黃酮提取率的比較見表1。

由表1可看出，以DM130為載體制備的固定化纖維素酶對牡丹葉黃酮提取效果最好，牡丹葉黃酮提取率可達(dá)1.56%，因此選用DM130作為纖維素酶的最佳固定化載體。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 給酶量對牡丹葉黃酮提取率的影響

給酶量對牡丹葉黃酮提取率的影響見圖1。

表1 不同載體制備固定化纖維素酶對牡丹葉黃酮提取率的比較Table 1 Comparison of immobilized cellulase prepared by different carrier on peony leaves flavonoids extraction yield

圖1 給酶量對牡丹葉黃酮提取率的影響Fig.1 The amount of cellulose on the extraction efficiency of flavonoids from peony leaves

牡丹葉黃酮提取率隨著纖維素酶給酶量的增加而迅速增加，當(dāng)給酶量達(dá)到1 mL/g固定化載體時(shí)，牡丹葉黃酮提取率最高，這是因?yàn)槊笣舛容^低時(shí)，酶分子和大孔樹脂的結(jié)合效應(yīng)占主導(dǎo)，酶濃度越大，結(jié)合效應(yīng)也越大，相應(yīng)的固定化纖維素酶活性也越高，牡丹葉黃酮提取率也越高；之后隨著纖維素酶濃度的增加酶活性逐漸緩慢降低，這可能是由于纖維素酶濃度達(dá)到一定程度后，大孔樹脂上的酶分子密度增加，活性基團(tuán)趨于飽和，結(jié)合的酶分子過多會造成酶作用的空間位阻增加，導(dǎo)致酶活性下降，牡丹葉黃酮提取率也下降，這與前人研究大孔樹脂固定化酶結(jié)果一致[5，21]。因此，選擇1 mL/g固定化載體為固定化酶最佳給酶量。

2.2.2 戊二醛濃度對牡丹葉黃酮提取率的影響

戊二醛濃度對牡丹葉黃酮提取率的影響見圖2。

隨戊二醛濃度的增加牡丹葉黃酮提取率也逐漸增加，當(dāng)戊二醛濃度為2%時(shí)，固定化纖維素酶對牡丹葉黃酮提取率最高，但隨著戊二醛濃度的進(jìn)一步增加，固定化纖維素酶活性逐漸下降，牡丹葉黃酮提取率也逐漸下降。這可能是因?yàn)榇罅康奈於┦估w維素酶分子之間發(fā)生高度交聯(lián)，導(dǎo)致酶活性中心構(gòu)型發(fā)生變化，酶活性下降[21]。所以確定2%濃度的戊二醛為固定化纖維素酶的最佳濃度。

圖2 戊二醛濃度對牡丹葉黃酮提取率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of glutaraldehyde on the extraction efficiency of flavonoids from peony leaves

2.2.3 固定化溫度對牡丹葉黃酮提取率的影響

固定化溫度對牡丹葉黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 固定化溫度對牡丹葉黃酮提取率的影響Fig.3 Effects of different immobilized temperature on the extraction efficiency of flavonoids from peony leaves

隨著固定化溫度的升高，牡丹葉黃酮提取率逐漸升高，當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)，牡丹葉黃酮提取率最高，之后隨著固定化溫度的進(jìn)一步升高，牡丹葉黃酮提取率反而快速下降，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的吸附是吸熱過程，在溫度較低時(shí)不容易吸附到樹脂上，固定化溫度的升高有利于酶在大孔樹脂上的吸附，從而提高固定化酶的活性，但是溫度上升到一定程度時(shí)，溫度過高會導(dǎo)致纖維素酶失活而引起固定化酶活性的降低，從而導(dǎo)致牡丹葉黃酮提取率的下降。因此，選擇50℃為固定化酶的最佳固定溫度。

2.2.4 固定化時(shí)間對牡丹葉黃酮提取率的影響

固定化時(shí)間對牡丹葉黃酮提取率的影響見圖4。

牡丹葉黃酮提取率隨著固定化時(shí)間的延長逐漸增加，當(dāng)固定化3 h后，牡丹葉黃酮提取率達(dá)到最大值，此時(shí)固定化載體對纖維素酶的吸附達(dá)到了平衡，之后隨著固定化時(shí)間的延長固定化酶活性逐漸下降，牡丹葉黃酮提取率也逐漸下降。這可能是由于固定化時(shí)間過長導(dǎo)致酶自身穩(wěn)定性降低、固定化過程中交聯(lián)程度過高，從而影響了酶促反應(yīng)速率，導(dǎo)致固定化酶活性下降，從而引起牡丹葉黃酮提取率的下降。因此，選擇固定化3 h作為固定化酶的最佳固定化時(shí)間。

圖4 固定化時(shí)間對牡丹葉黃酮提取率的影響Fig.4 Effects of different immobilized time on the extraction efficiency of flavonoids from peony leaves

2.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對固定化纖維素酶提取牡丹葉黃酮做進(jìn)一步優(yōu)化，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，固定化酶提取牡丹葉黃酮正交試驗(yàn)方差分析見表3。

表2 大孔吸附樹脂對牡丹葉黃酮吸附條件的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results and layout of orthogonal test on adsorption conditions of flavonoids from peony leaves

表3 固定化酶提取牡丹葉黃酮正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Analysis of variance of the orthogonal array design for optimization of flavonoid extraction

極差分析表明：四因素對固定化纖維素酶提取牡丹葉黃酮影響的主次順序?yàn)椋篈>C>B>D，即：給酶量＞固定化溫度＞戊二醛濃度＞固定化時(shí)間，而且由表3方差分析結(jié)果可看出，給酶量、固定化溫度、戊二醛濃度、固定化時(shí)間4個因素對固定化酶提取牡丹葉黃酮的影響均達(dá)到了顯著水平。由正交試驗(yàn)得到固定化纖維素酶提取牡丹葉黃酮的最佳提取條件為A3B2C2D2，即纖維素酶給酶量為1.25 mL/g固定化載體、戊二醛濃度為2%、固定化溫度為50℃、固定化時(shí)間為3 h，根據(jù)此最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到固定化纖維素酶提取牡丹葉黃酮提取率為1.95%。

2.4 固定化纖維素酶重復(fù)利用次數(shù)對牡丹葉黃酮提取率的影響

固定化酶使用次數(shù)對牡丹葉總黃酮提取量的影響見圖5。

圖5 固定化酶使用次數(shù)對牡丹葉總黃酮提取量的影響Fig.5 Effects of cycle time on the extraction of flavonoids from peony leaves

如圖5所示，隨著固定化纖維素酶使用次數(shù)的增加，牡丹葉黃酮提取率逐漸降低，固定化纖維素酶重復(fù)使用4次，牡丹葉黃酮提取率為1.66%，為固定化酶第一次提取時(shí)的85.13%。固定化酶使用4次后牡丹葉黃酮提取率迅速降低，固定化纖維素酶使用6次后，牡丹葉黃酮提取量仍為固定化酶第一次提取時(shí)的51.79%，說明本試驗(yàn)制備的固定化纖維素酶對于提取牡丹葉黃酮具有很好的效果。固定化纖維素酶可多次重復(fù)使用，使用固定化纖維素酶提取牡丹葉黃酮更節(jié)約成本。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以DM130大孔吸附樹脂為載體制備固定化纖維素酶，并將其應(yīng)用到牡丹總黃酮提取，通過正交試驗(yàn)得到了固定化纖維素酶提取牡丹葉黃酮的最佳工藝：給酶量1.25 mL/g固定化載體、戊二醛濃度2%、固定化溫度50℃、固定化時(shí)間3 h，在此條件下牡丹葉黃酮提取量為1.95%。固定化纖維素酶使用4次，牡丹葉黃酮提取量仍達(dá)85.13%，說明制備的固定化纖維素酶在牡丹葉黃酮的提取中具有良好的效果，能重復(fù)利用。

采用大孔樹脂固定化纖維素酶方法簡單易行，價(jià)格低廉，可以重復(fù)使用，節(jié)約成本，便于工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。本試驗(yàn)通過正交試驗(yàn)得到固定化酶提取牡丹葉黃酮的最佳工藝，不僅可為牡丹葉黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的數(shù)據(jù)支持，也為牡丹葉的深加工利用提供提供新的思路和方法。

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Study of Immobilized Cellulose Extraction Flavanoids from Peony Leaves

LI Pei-yan1，YIN Fei2
（1.College of Food and Bioengineering，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471023，Henan，China；2.College of Agronomy，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471023，Henan，China）

DM130 macroporous resin as the carrier，the effects of cellulose amount，glutaraldehyde concentration，immobilized temperature and immobilized time on the extraction ratio of flavanoids from peony leaves were investigated.The optimum technology of extracting flavanoids from peony leaves by immobilized cellulose was determined by orthogonal experiments.The results showed that the most appropriate immobilized conditions of DM130 macroporous resin were：cellulose amount 1.25 mL/g macroporous resin，glutaraldehyde concentration 2%，immobilized temperature 50℃，immobilized time 3 h，and the extraction ratio of peony leaves flavanoids was 1.95%.Immobilized cellulose could be used for 4 batches and its extraction ratio of peony leaves flavanoids was up 85.13%of the immobilized cellulose extraction for the first time，which suggested that immobilized cellulose had a good effect on extracting total flavanoids from peony leaves.

cellulase；macroporous resin；immobilization；peony leaves；flavanoids

2016-11-01

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.010

河南科技大學(xué)博士科研啟動基金項(xiàng)目（4009-13480053）；河南科技大學(xué)青年科學(xué)基金項(xiàng)目（2015QN035）；農(nóng)產(chǎn)品高值化利用與快速檢測技術(shù)項(xiàng)目（2015XTD007）

李佩艷（1977—），女（漢），講師，博士，研究方向：食品質(zhì)量與安全控制、果蔬貯藏與保鮮。