大興安嶺金蓮花不同部位黃酮抗氧化活性研究

劉洋，周鴻立，馬先紅，鄧敏君，覃媚媚，隋新，*

（1.吉林化工學院生物與食品工程學院，吉林吉林132022；2.吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林吉林132022）

大興安嶺金蓮花不同部位黃酮抗氧化活性研究

劉洋1，周鴻立2，馬先紅1，鄧敏君1，覃媚媚1，隋新1，*

（1.吉林化工學院生物與食品工程學院，吉林吉林132022；2.吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林吉林132022）

對金蓮花花瓣和花莖中黃酮進行抗氧化對比研究。用醇提法分別提取金蓮花花瓣和花莖黃酮，采用D101大孔樹脂進行純化，以L-抗壞血酸（VC）作對比，分別用還原力法、DPPH法、羥基自由基法、ABTS法對其進行抗氧化性進行研究。結(jié)果顯示：花瓣與花莖的總黃酮含量分別為14.83%和13.3%?；ò昱c花莖黃酮對DPPH自由基與ABTS自由基都有較好的清除作用。其中花瓣黃酮與花莖黃酮在選定濃度范圍內(nèi)，對DPPH自由基清除能力差異不顯著，但都低于VC的清除率；當濃度大于0.16 mg/mL時，花瓣黃酮清除ABTS自由基略高于花莖黃酮，接近VC的清除率?；ò昱c花莖黃酮的還原能力與清除羥基自由基能力較弱，遠低于照品VC的抗氧化能力。

金蓮花；黃酮；抗氧化

金蓮花為毛莨科植物長瓣金蓮花的干燥花，多分布于我國北方高山地區(qū)，資源豐富，株高30cm～100 cm[1-2]。目前對金蓮花的研究多集中于花瓣提取物的提取及活性，大量研究表明，花瓣中富含黃酮類、多糖等多種活性物質(zhì)，具有抗菌消炎、治療咽炎及上呼吸道感染等作用[3-5]，研究表明，其主要活性成分為金蓮花黃酮類物質(zhì)。金蓮花黃酮多分布于植物的莖葉及花瓣中，少部分以游離形式存在，多數(shù)研究證實，金蓮花黃酮具備較好的抗氧化作用[6-9]。但由于目前對金蓮花的研究多集中于花瓣，花瓣提取物也多用于藥物開發(fā)，民間也常以花代茶飲用的習慣，而對金蓮花莖的研究較為少見。若金蓮花30 cm～100 cm高的花莖與花瓣類似，具有同樣的活性成分及作用，實現(xiàn)花莖的開發(fā)與利用，將會提升金蓮花附加值，實現(xiàn)變廢為寶[10-12]。本文以大興安嶺地區(qū)野生金蓮花為研究對象，分別提取金蓮花花瓣、花莖黃酮，并對其抗氧化活性進行對比研究，這將為金蓮花花瓣、花莖在食品、醫(yī)藥、保健領域的開發(fā)與應用，奠定良好的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

野生金蓮花：采自大興安嶺地區(qū)，經(jīng)過干燥、分離花瓣與花徑，碾磨粉碎后備用。

1.2 試驗設備

JYL-D0料理機：九陽股份有限公司；AL204電子天平（0.0001 g）：梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；AKHL-Ⅲ.5804R離心機：德國Eppendo公司；UV-6100型紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司。

1.3 標準曲線的確定

精密稱取120℃干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁標準品75.0 mg，用體積分數(shù)60%乙醇溶液定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度0.75 mg/mL的標準品溶液。精密吸取上述標準品溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 分別置于10 mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.4 mL，搖勻放置6 min，加入10%Al（NO3）3溶液0.4 mL，搖勻，放置6 min，加入4%NaOH溶液4 mL，搖勻放置15 min，定容后，在510nm波長處測定吸光度A值，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標、吸光度A值為縱坐標繪制標準曲線。

1.4 黃酮的提取及測定

分離金蓮花花瓣和花莖，碾磨粉碎，以團隊前期研究所得最佳提取工藝條件進行提?。阂掖紳舛葹?0%，溫度為70℃，提取時間為3.5 h，料液比為1∶60（g/mL），分別提取金蓮花花瓣和花莖粗黃酮。分別吸取上述金蓮花花瓣和花莖黃酮提取液0.2 mL置于10 mL容量瓶中，按1.3步驟進行含量測定。利用回歸方程，計算出總黃酮濃度。

式中：C為根據(jù)標準曲線計算出的總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；n為提取溶液稀釋倍數(shù)；m為提取金蓮花的質(zhì)量，g。

1.5 黃酮的純化

依據(jù)前期研究所選用的最佳純化工藝進行純化：選用D101大孔樹脂吸附金蓮花黃酮的最佳工藝條件（上樣濃度為2.7 mg/mL、上樣流速為2.50 BV/h、上樣pH 5.09）分別對金蓮花花瓣和花莖黃酮進行純化。

1.6 抗氧化試驗方法

1.6.1 還原力法

依次在試管中加入濃度為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL金蓮花花瓣和花莖的黃酮樣品溶液和濃度為0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL 的 VC樣品溶液 1.0 mL，磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L，pH=6.6）2.5 mL和1%鐵氰化鉀2.5 mL，置于50℃水浴中反應20 min，然后加入10%的三氯乙酸（TCA）2.5 mL，混勻后以3 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL和2.5 mL的蒸餾水，搖勻后在700 nm處測定吸光值，每個濃度3個平行，取平均值。

1.6.2 DPPH法

依次在試管中加入濃度為 0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL金蓮花花瓣、花莖和VC樣品液1 mL，再加入5 mL濃度為0.2 mmol/L的DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）醇溶液（無水乙醇配制），混勻后在室溫下避光反應30 min，在517 nm下測定吸光度，空白組中用1 mL蒸餾水代替樣品液，根據(jù)如下公式計算樣品和VC對DPPH自由基清除率：

式中：Ao為空白組吸光度；Ax為樣品組吸光度。

1.6.3 清除羥基自由基法

水楊酸比色法：在試管中加入濃度為0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL金蓮花花瓣、花莖和VC樣品液2 mL，加入 1 mL 2.5 mmol/L 的 FeSO4，1 mL 2.5 mmol/L的水楊酸溶液，在37℃下水浴30 min。再加入1 mL 2.5mmol/L的H2O2，37℃下水浴30min，再分別加入1mL蒸餾水，在530 nm處測其吸光度。

式中：Ao為空白組吸光度；Ax為樣品組吸光度。

1.6.4 ABTS法

向20 mL5 mmol/L ABTS（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）溶液中加入1 g MnO2，在室溫下保存30 min，形成ABTS儲備液，向儲備液中加入pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液，至混合液的吸光度為7.0±0.02，即為ABTS工作液。依次在試管中加入濃度為 0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL金蓮花花瓣、花莖和VC樣品液0.1 mL，加入7 mL ABTS溶液，以蒸餾水作為空白組對照，將溶液混合均勻，避光保存10 min，在734 nm處測吸光度。按下式計算樣品對ABTS自由基的清除率。

式中：Ao為空白組吸光度；Ax為樣品組吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 金蓮花總黃酮標準曲線

對照品蘆丁標準曲線，如圖1所示。

從圖1中曲線可以得出蘆丁濃度與吸光度A值之間的回歸方程：y=10.4x-0.035，相關系數(shù)R2=0.999 75。y為樣品液在波長510 nm處的吸光度A值，x為總黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL）。結(jié)果表明，在蘆丁質(zhì)量濃度為0.015 mg/mL～0.090 mg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

圖1 對照品蘆丁的標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 金蓮花花瓣、花莖總黃酮含量

根據(jù)式（1），測定時定容體積為10 mL，提取液定容體積為500 mL，吸取測定體積為0.2 mL，樣品質(zhì)量為10 g，計算花瓣、花莖黃酮含量分別為14.83%與13.3%。

2.3 金蓮花花瓣、花莖黃酮純化前后純度變化

經(jīng)過純化后的金蓮花花瓣、花莖純度變化如表1所示。

表1 金蓮花花瓣、花莖黃酮純化結(jié)果Table 1 Purification results of flavonoids in lotus petals，stems

金蓮花花瓣純化前純度為55.76%，純化后純度為82.8%，純度提高了0.48倍；金蓮花花莖純化前純度為52.2%，純化后純度為79.09%，純度提高了0.51倍。

2.4 抗氧化試驗結(jié)果

2.4.1 金蓮花花瓣、花莖黃酮還原力作用

采用還原力方法，對金蓮花花瓣、花莖黃酮進行抗氧化研究，并以L-抗壞血酸（VC）作對比。按上述1.6.1的方法測得吸光值，并建立濃度與吸光值曲線如圖2所示。

從圖2可知，金蓮花花瓣和花莖黃酮具有一定的還原能力，其還原能力隨著樣品濃度的增大而增大。在濃度為0.04 mg/mL時，花瓣、花莖和VC的還原能力差別不是很大；當濃度大于0.04 mg/mL時，VC的還原能力遠遠大于花瓣和花莖黃酮的還原能力。金蓮花花瓣、花莖黃酮雖然具備一定的還原能力，但是都遠低于VC的還原能力。

2.4.2 金蓮花花瓣、花莖DPPH自由基清除作用

圖2 金蓮花不同部位黃酮和VC的還原能力作用Fig.2 Effect of reduction ability of Trollius flavonoids and VCin different parts

采用清除DPPH自由基方法對金蓮花花瓣、花莖黃酮進行抗氧化研究[10-11]，并以VC作對比。按照1.6.2的方法測定吸光度并計算出其對DPPH自由基清除率，建立濃度與清除率的曲線，結(jié)果如圖3所示。

圖3 金蓮花不同部位黃酮和VC清除DPPH自由基作用Fig.3 DPPH radical scavenging activity of flavonoids and VCin different parts of Trollius

由圖3可知，金蓮花花瓣與花莖黃酮對DPPH自由基清除率隨著其濃度的增加而逐漸升高。當濃度小于0.08 mg/mL時，花莖黃酮的清除率與VC差距比較小，且兩者的清除率高于花瓣黃酮的清除率；當濃度大于0.08 mg/mL時，花莖黃酮的清除率逐漸與花瓣黃酮清除率接近，但小于VC的清除率。當濃度為0.08 mg/mL～0.16 mg/mL時，花瓣黃酮的清除率與花莖差距逐漸減小，差別不顯著。當濃度為0.20mg/mL時，花瓣黃酮、花莖黃酮、VC的DPPH清除率分別為80.42%、78.90%、95.78%。此結(jié)果表明花瓣和花莖中黃酮對DPPH自由基具有一定的清除作用，但兩者對DPPH清除率都低于VC，且兩者差異不顯著。

2.4.3 金蓮花花瓣、花莖黃酮清除羥基自由基作用

采用清除羥基自由基方法對金蓮花花瓣、花莖黃酮進行抗氧化研究，并以VC作對比[12-13]。按照1.6.3的方法測定吸光度并計算出其對羥基自由基清除率，建立濃度與清除率的曲線，結(jié)果如圖4所示。

圖4 金蓮花不同部位黃酮和VC清除羥基自由基作用Fig.4 Hydroxyl radical scavenging activity of flavonoids and VCin different parts of Trollius

由圖4可知，金蓮花花瓣、花莖黃酮都具有清除羥基自由基的能力，且隨著黃酮質(zhì)量濃度的逐漸增加。當濃度為0.04 mg/mL時，花莖黃酮的清除率與VC差距較小，且都高于花瓣黃酮的清除率，當濃度大于0.04 mg/mL時，花莖黃酮的清除率與VC差距逐漸增大，且花莖黃酮的清除率始終高于花瓣黃酮的清除率。當濃度為0.20 mg/mL時，金蓮花花瓣、花莖黃酮和L-抗壞血酸的清除率分別為25.55%、38.34%、97.23%。此結(jié)果表明金蓮花花瓣、花莖黃酮具有一定的清除羥基自由基的能力，但清除率不超過40%，遠遠低于VC的清除羥基自由基能力。

2.4.4 金蓮花花瓣、花莖黃酮清除ABTS自由基能力

ABTS 自由基（ABTS+·）是由 ABTS-（NH3）2通過強氧化劑氧化而得的一種相對穩(wěn)定的自由基，當向溶液中加入自由基清除劑時，溶液在752 nm處的吸光度變小或消失，其變化程度與樣品濃度呈良好的線性關系[14-15]。按照1.6.4的方法測定吸光度，對金蓮花花瓣、花莖黃酮進行抗氧化活性的研究，并用VC作對比，計算出其對ABTS自由基清除率，建立濃度與清除率的曲線，結(jié)果如圖5所示。

圖5 金蓮花不同部位黃酮和L-抗壞血酸的清除ABTS自由基能力Fig.5 ABTS free radical scavenging ability of flavonoids and VCin different parts of Trollius

由圖5可知，金蓮花花瓣、花莖黃酮都具有清除ABTS自由基能力，并且隨著黃酮濃度的增加，清除ABTS自由基能力也隨之增強。在濃度為0.04 mg/mL時，花莖黃酮與花瓣黃酮的清除率相差較小，且花莖黃酮的清除率高于花瓣黃酮的清除率；當濃度大于0.12 mg/mL時，花瓣黃酮的清除率逐漸大于花莖黃酮的清除率，且差距越來越大；當濃度0.08 mg/mL～0.16 mg/mL時，金蓮花花瓣、花莖黃酮清除率與VC差距較大；當濃度大于0.16 mg/mL時，花瓣黃酮的ABTS自由基清除率與VC差距越來越小，且VC的ABTS自由基清除能率始終高于金蓮花花瓣和花莖的清除率。當濃度為0.20 mg/mL時，金蓮花花瓣、花莖黃酮和VC的ABTS自由基清除率分別為64.18%、46.09%、71.07%，結(jié)果表明金蓮花瓣黃酮與VC都有良好的清除ABTS自由基能力，花莖黃酮的清除ABTS自由基能力較弱。當濃度低于0.12 mg/mL時，花瓣黃酮與花莖黃酮都較低，且差異不顯著。當濃度大于0.12 mg/mL時，花瓣黃酮的清除ABTS自由基能力高于花莖黃酮的清除ABTS自由基能力。

3 結(jié)論

本試驗采用醇提法分別對金蓮花花瓣和花莖進行提取，采用D101大孔樹脂進行純化，并以VC作對比，對純化后的金蓮花花瓣、花莖進行抗氧化研究。結(jié)果顯示：花瓣與花莖的總黃酮含量分別為14.83%和13.3%?；ò昱c花莖黃酮對DPPH自由基與ABTS自由基都有較好的清除作用。其中花瓣黃酮與花莖黃酮在選定濃度范圍內(nèi)，對DPPH自由基清除能力差異不顯著，但都低于VC的清除率；當濃度大于0.16 mg/mL時，花瓣黃酮清除ABTS自由基略高于花莖黃酮，接近VC的清除率?；ò昱c花莖黃酮的還原能力與清除羥基自由基能力較弱，與對照品VC的差距較大。

通過對比研究發(fā)現(xiàn)，金蓮花花莖中的黃酮含量與花瓣中黃酮接近，兩者對DPPH自由基與ABTS自由基都有較好的清除作用，抗氧化能力接近。這為金蓮花莖的開發(fā)與利用提供了一定的理論支撐。

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Total Flavonoids Antioxidation Activity of Trollius chinensis Bunge in Different Parts

LIU Yang1，ZHOU Hong-li2，MA Xian-hong1，DENG Min-jun1，QIN Mei-mei1，SUI Xin1，*
（1.College of Biological and Food Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022，Jilin，China；2.College of Chemical and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022，Jilin，China）

Trollius chinensis Bunge；flavonoids；antioxidation

2016-10-12

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.003

吉林市科技發(fā)展計劃資助項目（20162011）；吉林化工學院校級項目（2016065）

劉洋（1984—），男（漢），講師，博士，研究方向：天然產(chǎn)物開發(fā)及現(xiàn)代食品檢測技術。

*通信作者：隋新，副教授，主要研究方向：真菌資源化開發(fā)與利用。

Abstract：In this paper mainly，comparative study of antioxidant flavonoids in stems and flower petals of Trollius chinensis Bunge was studied.Ethanol extraction and D101 macroporous resin were used to extract and purified flavonoids respectively.Reducing power method，DPPH，hydroxyl free radical，ABTS method were used to study the anti-oxidation activity of flavonoids in stems and flower petals of Trollius chinensis Bunge，compared with L-ascorbic acid （VC）.The results shows that：total flavonoids content of petals and stems were 14.83%and 13.3%.They have strong scavenging effect on DPPH radical with ABTS.In the selected concentration range，the DPPH free radical scavenging ability difference of them is not significant，but lower than the VCclearance rate；when the concentration is larger than 0.16 mg/mL，petal flavonoids scavenging ABTS free radical was stronger than that the stems flavonoids，close to VCclearance rate.Petals and stems of flavonoids in reducing capacity and scavenging ability is weak，far less than the antioxidant capacity of VC.