Cyr61、MMP—3在痛風(fēng)性腎病大鼠腎臟中的表達(dá)

張寧寧　趙玉杰　牛效清

[摘要] 目的 研究富含半胱氨酸蛋白61（cysteine-rich 61，Cyr61/CCN1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-3（matrix metalloproteinases-3，MMP-3）在痛風(fēng)性腎病大鼠腎臟組織的分布及表達(dá)，探討Cyr61在腎間質(zhì)損傷中的作用。 方法 20只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為對照組和模型組。模型組大鼠給予含0.2%腺嘌呤和20%酵母浸粉的高嘌呤飼料喂飼，周期90 d。模型建立后行HE染色并用免疫組化法檢測Cyr61、MMP-3在腎組織的表達(dá)情況。 結(jié)果 光鏡下兩組MMP-3表達(dá)部位一致，主要分布于腎皮質(zhì)內(nèi)的小管上皮細(xì)胞胞漿中且以基底膜側(cè)表達(dá)為著，模型組陽性表達(dá)強(qiáng)度減弱（P<0.05）；兩組Cyr61均主要表達(dá)于近端小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)，模型組陽性表達(dá)增加（P<0.01）。 結(jié)論 在腎損傷末期Cyr61對MMP-3的誘導(dǎo)作用減弱，防護(hù)能力下降。

[關(guān)鍵詞] 富含半胱氨酸蛋白61；基質(zhì)金屬蛋白酶-3；痛風(fēng)性腎??；腎間質(zhì)損傷

[中圖分類號] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）17-0033-03

[Abstract] Objective To investigate the distribution and expression of cysteine-rich 61 and matrix metalloproteinases-3 in renal tissue of rats with gouty nephropathy， and to explore the role of Cyr61 in renal interstitial injury. Methods Twenty male Wistar rats were randomly divided into two groups： the control group and the model group. Rats in the model group were fed with high purine diets containing 0.2% adenine and 20% yeast extract for a period of 90 days. After the model was established， HE staining was performed and the expression of Cyr61 and MMP-3 in renal tissue was detected by immunohistochemistry. Results The expressions of MMP-3 in the two groups were mainly distributed in the cytoplasm of tubular epithelial cells which in the renal cortex， and the expression of MMP-3 in the model group was decreased（P<0.05） .Two groups of Cyr61 were mainly expressed in the cytoplasm of proximal tubule epithelial cells，and the positive expression in model group was increased（P<0.01）. Conclusion At the end of renal injury， the induction of MMP-3 by Cyr61 was weakened， and the protective ability decreased.

[Key words] Cyr61； MMP-3； Gouty nephropathy； Renal interstitial injury

痛風(fēng)（gout）是尿酸鹽沉積性炎性疾病，以血清尿酸水平升高伴急慢性關(guān)節(jié)炎、間質(zhì)性腎炎或腎結(jié)石為主要臨床表現(xiàn)?；|(zhì)金屬蛋白酶-3（matrix metalloproteinases-3，MMP-3）在炎癥反應(yīng)中占有重要地位，可使炎癥細(xì)胞聚集浸潤，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[1]，同時MMP-3還通過降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）參與腎臟纖維化的發(fā)生。富含半胱氨酸蛋白61（cysteine-rich 61，Cyr61/CCN1）是一種分泌型蛋白質(zhì)，其表達(dá)水平及生物學(xué)功能具有組織特異性[2]。研究發(fā)現(xiàn)Cyr61與腎小球疾病、腎血管疾病、腎小管間質(zhì)損傷和纖維化等密切相關(guān)，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究[3]。本文嘗試通過對痛風(fēng)性腎病大鼠腎組織中MMP-3、Cyr61分布及表達(dá)變化的研究，探討Cyr61在腎間質(zhì)損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型的制備及分組

6～8周齡清潔級雄性Wistar大鼠20只，體重188～220 g，購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK（黑）2013-001]，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)等分為對照組和模型組。對照組給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組給予含0.2%腺嘌呤和20%酵母浸粉的高嘌呤飼料喂飼，藥物劑量每只大鼠酵母浸粉20 g/（kg·d），腺嘌呤200 mg/（kg·d），依據(jù)體重限量投放飼料。兩組大鼠自由飲水，每周稱重1次，造模周期為90 d。

1.2 主要試劑

腺嘌呤產(chǎn)自Sigma公司；酵母浸粉產(chǎn)自北京奧博星生物公司；MMP-3、Cyr61多克隆抗體及即用型SABC免疫組化試劑盒均產(chǎn)自武漢博士德生物公司。

1.3 病理學(xué)檢測

1.3.1 蘇木素-伊紅（HE）染色 腎組織經(jīng)固定、脫水、透明以及石蠟包埋后，制成3 μm厚組織切片，HE染色后光鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)變化。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色 將石蠟組織切片脫蠟、脫水，然后抗原修復(fù)、孵育抗體、DAB顯色，最后在LEICA DM4000B顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選取10個視野拍攝圖片，應(yīng)用Image pro plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對圖像進(jìn)行分析，測量陽性區(qū)域的累積光密度值（IOD）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以中位數(shù)（M）、四分位數(shù)間距（QR）表示；對非正態(tài)分布或方差不齊的計(jì)量資料采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織病理觀察

對照組腎單位形態(tài)規(guī)則，間質(zhì)內(nèi)無炎性細(xì)胞浸潤。模型組腎組織結(jié)構(gòu)紊亂，腎小球萎縮；近端小管上皮細(xì)胞水腫，管腔擴(kuò)張，偶見顆粒管型及蛋白管型；髓袢和集合管內(nèi)可見棕黃色的沉積物；間質(zhì)纖維化，可見大量淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤，見封三圖5。

2.2 腎組織中MMP-3的表達(dá)部位及水平

光鏡下，對照組MMP-3主要分布于腎皮質(zhì)內(nèi)的小管上皮細(xì)胞胞漿中且以基底膜側(cè)表達(dá)為著。模型組MMP-3的陽性部位與對照組一致，但表達(dá)強(qiáng)度減弱，與對照組間存在顯著性差異（P<0.05），見表1、封三圖6。

2.3 腎組織中Cyr61的表達(dá)部位及水平

光鏡下，兩組Cyr61均主要表達(dá)于近端小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)。由于Cyr61分泌后與硫酸乙酰肝素蛋白多糖結(jié)合，蛋白構(gòu)象改變，抗原位點(diǎn)封閉，在ECM中不能利用免疫組化方法檢測[4]。本研究未觀察到Cyr61在小管間質(zhì)表達(dá)，與以往研究一致[4，5]。模型組陽性表達(dá)增加，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表1、封三圖7。

3 討論

MMP-3又稱間質(zhì)溶解素1（stromelysins-1），在腎臟主要由腎小管的上皮細(xì)胞以無活性的酶原形式分泌，只有被活化后才能降解基質(zhì)蛋白[6]。激活后的MMP-3可降解幾乎全部腎小球基底膜和ECM的組成成分[7]，并能夠激活其他MMPs家族成員，共同參與腎間質(zhì)ECM的降解和轉(zhuǎn)運(yùn)。正常情況下MMP-3的表達(dá)量極少[7]，而在炎癥、胚胎發(fā)生、血管形成、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移時其表達(dá)量上升。研究證實(shí)，在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑液中，MMP-3濃度高于非炎性關(guān)節(jié)疾病[8]；在中、重度系膜增生性腎炎患者的腎小球中MMP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)[9]。

紫外線、細(xì)胞因子和生長因子等可引起MMP-3發(fā)生轉(zhuǎn)錄水平的改變。白細(xì)胞介素1、神經(jīng)生長因子、表皮生長因子、血小板源性生長因子（PDGF）等可誘導(dǎo)MMP-3表達(dá)，而轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、糖皮質(zhì)激素則抑制MMP-3的表達(dá)[7，9]；此外，組織金屬蛋白酶抑制劑-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）通過與MMP-3的催化區(qū)域結(jié)合形成復(fù)合物，抑制MMP-3的活性[3-9]。

近年來，ECM降解機(jī)制的研究日益受到人們的重視。MMPs及TIMPs是調(diào)節(jié)ECM動態(tài)平衡的最重要的酶系之一，其活性的變化及比例的失衡是最終導(dǎo)致腎臟纖維化發(fā)生的主要機(jī)制。Cyr61作為整合素的配體，是抗纖維化中重要的一個環(huán)節(jié)[10]。

Cyr61是由上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞等多種間質(zhì)細(xì)胞，在血清、PDGF、TGF-β等刺激下生成的即刻蛋白[5]。Cyr61作為一種信號分子具有多種功能，能夠趨化細(xì)胞及促進(jìn)細(xì)胞增殖、粘附[2]；誘導(dǎo)MMP-1、MMP-3和TIMP1表達(dá)上調(diào)[11]，引起ECM重構(gòu)；調(diào)節(jié)多個基因的轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)和腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為等生理病理過程中發(fā)揮重要作用[12]。

本研究中我們通過喂飼大鼠含酵母及腺嘌呤飼料的方式來模擬人類痛風(fēng)性腎病的發(fā)病機(jī)制，并依據(jù)臨床急慢性腎病的判定時長設(shè)定造模周期，從而引發(fā)大鼠代謝異常相關(guān)的慢性間質(zhì)性腎炎。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)，MMP-3在腎組織中的陽性表達(dá)明顯減弱，同其他腎纖維化研究的結(jié)果一致[13，14]。然而Cyr61在腎組織中的陽性表達(dá)增加，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。由于活化的MMP-3能夠降解ECM成分，故在腎纖維化進(jìn)程中起保護(hù)性作用。PDGF可直接或間接通過刺激Cyr61的生成，促進(jìn)MMP-3在腎臟的表達(dá)；作為致纖維化的細(xì)胞因子TGF-β一方面可以降低MMP-3的表達(dá)量，另一方面又能刺激Cyr61的產(chǎn)生。由此我們認(rèn)為Cyr61作為機(jī)體抵抗纖維化的防御性蛋白，其表達(dá)增多是機(jī)體的一種代償機(jī)制。

有研究稱腎缺血損害后3～6 h Cyr61便可在近端腎小管直部誘導(dǎo)生成，并于6～9 h達(dá)峰后降低[15]。趙麗君等[13]的研究顯示，在腎損傷早期MMP-3的表達(dá)量同Cyr61一樣也呈現(xiàn)出先增高后逐漸降低的趨勢。推測MMP-3的早期升高可能與Cyr61的誘導(dǎo)作用相關(guān)。然而在本次實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)MMP-3與Cyr61的表達(dá)水平是相悖的，這說明Cyr61在腎損傷的末期對于MMP-3的促生成作用是不足的。同時由于Cyr61對MMP3及其活性抑制劑TIMP1均具有上調(diào)表達(dá)的作用，且在腎損傷末期TIMP仍能大量表達(dá)[14]，導(dǎo)致MMP-3的降解活性下降ECM積聚，進(jìn)一步削弱了Cyr61的抗纖維化作用。

腎損傷早期Cyr61雖通過誘導(dǎo)MMP-3的生成發(fā)揮抗纖維化作用，但其代償能力有限，在腎損傷末期誘導(dǎo)作用減弱，防護(hù)能力下降。ECM合成和降解失衡是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生與發(fā)展的重要機(jī)制之一。研究腎間質(zhì)損傷中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，對認(rèn)識疾病的本質(zhì)，為疾病的治療和基因靶向干預(yù)提供了依據(jù)。

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（收稿日期：2017-04-16）