滋陰補陽方序貫療法對多囊卵巢綜合征(PCOS)大鼠卵巢顆粒細胞(GC)分泌功能和細胞因子基因表達的影響

徐括琴，尹巧芝，黨麗英，侯玉華，楊小風

1.鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科(鄭州 450000),2.成都中醫(yī)藥大學婦科教研室(成都 610075)

滋陰補陽方序貫療法對多囊卵巢綜合征(PCOS)大鼠卵巢顆粒細胞(GC)分泌功能和細胞因子基因表達的影響

徐括琴1，尹巧芝2，黨麗英1，侯玉華1，楊小風1

1.鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科(鄭州 450000),2.成都中醫(yī)藥大學婦科教研室(成都 610075)

目的：研究滋陰補陽方序貫療法對多囊卵巢綜合征(PCOS)大鼠卵巢顆粒細胞(GC)分泌功能和細胞因子基因表達產(chǎn)生的影響。方法：利用隨機數(shù)字表法將實驗雌性性SD大鼠分為3組，包括空白對照組、滋陰組以及補陽組；選取6周齡同樣大鼠灌胃，調(diào)配空白血清與用藥血清；對PCOS大鼠GC及黃素化顆粒細胞進行分離培養(yǎng)，并以隨機方法分為10組，比較各組細胞培養(yǎng)液里面雌二醇(E2)、類胰島素增長因子(IGF-1)、干細胞因子(SCF)以及睪酮(T)水平，并觀察SCF mRNA表達情況。結(jié)果：模型組1GC里面E2水平明顯低于對照組(P<0.05)，且SCF水平明顯高于對照組；滋陰方組2 SCF與滋陰方組3 SCF水平均明顯低于模型組1(P<0.05)，而滋陰方組2 E2與滋陰方組3 E2水平均明顯高于模型組1(P<0.05)；模型組1大鼠GC SCF mRNA表達明顯高于對照組，且IGF-1灰度值明顯小于對照組(P<0.05)，滋陰方組2 與滋陰方組3 GC SCF mRNA表達均顯著低于模型組1(P<0.05)，滋陰方組3 IGF-1灰度值明顯高于模型組1(P<0.05)；模型組大鼠卵巢部位黃素化顆粒細胞里面T水平明顯高于對照組(P<0.05)；補陽方組2與補陽方組3 T水平明顯低于模型組(P<0.05)，而補陽方組1 T水平與模型組的比較無顯著差異(P>0.05)；對照組、模型組、補陽方組黃素化顆粒細胞里面SCF水平、SCF mRNA表達以及IGF-1灰度值比較無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論：對PCOS采取滋陰補陽方序貫療法，能提高GC分泌功能，同時可以降低卵泡期SCF基因在體內(nèi)的表達實現(xiàn)，可為PCOS排卵障礙臨床治療提供依據(jù)。

多囊卵巢綜合征(Polycystic ovarian syndrome，PCOS)是與各器官、系統(tǒng)正常內(nèi)分泌紊亂相關(guān)的疾病，患者臨床表現(xiàn)具有多樣化特點，現(xiàn)今其病理機制缺乏統(tǒng)一結(jié)論。有報道指出，育齡婦女群體PCOS發(fā)病率高達5%～10%，并且和75%左右無排卵性不孕患者密切相關(guān)[1]。亦有研究顯示，部分卵巢局部調(diào)節(jié)因子的表達和PCOS發(fā)病存在緊密聯(lián)系[2]。 干細胞因子(Stem cell factor，SCF)屬于卵巢局部相對重要的一種生長因子，可對細胞增殖分化產(chǎn)生促進作用?，F(xiàn)階段，與SCF在PCOS患者卵巢局部產(chǎn)生的促進作用相關(guān)研究較多，可是涉及SCF在PCOS臨床發(fā)病機制中作用的研究卻不多。本文以大鼠實驗，探討滋陰補陽方序貫療法對PCOS大鼠卵巢顆粒細胞(GC)分泌功能和SCF基因表達產(chǎn)生的影響，現(xiàn)匯報如下。

材料與方法

1 動物 選取84只雌性SD大鼠，每只日齡均為21日，體重為40～50 g；另選取50只雌性SD大鼠，每只6周齡，并且體重為170～180 g，所有大鼠均清潔級飼養(yǎng)，給予自然光照，控制室溫不超過20 ℃～25 ℃范圍。

2 藥物與主要試劑 由武漢遠城科技發(fā)展公司提供脫氫表雄酮(DHEA)；浙江田雨藥用油有限公司提供實驗注射大豆油；滋陰方組成成分為：紫河車、熟地黃、菟絲子、當歸、白芍以及山茱萸等中藥；補陽方組成成分為：淫羊藿、黨參、補骨脂、巴戟天以及川續(xù)斷等?；旌弦陨现兴?，置于水中浸泡1 h后，采用武火煮沸，然后用文火煮20 min，將其過濾，并且重復煎2次，最后合并濾液，置于55 ℃～60 ℃水浴條件下濃縮。實驗給藥量依據(jù)人鼠劑量[3]進行換算，其中滋陰方含生藥量為2.48 g/kg，對于補陽方，則含生藥量為2.20 g/kg，并將煎劑冷卻后放在4℃溫度下保存。

由HyClone公司提供DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶，由BioSource 公司提供10%胎牛血清；北京賽百盛生物工程公司提供SCF與β-actin引物，上海恒遠生物科技有限公司提供ELISA試劑盒；Bio-Teke公司提供RNA提取試劑盒，；SYBRPremix Ex Taq，TakaRa公司；上海博升生物科技有限公司提供孕馬血清促性腺激素(PMSG)，并由上海生物化學制藥廠提供人絨毛膜促性腺激素(HCG)。

3 實驗方法

3.1 構(gòu)建實驗PCOS大鼠模型:對84只雌性SD大鼠進行編號，將其隨機分成模型組(n=67)與空白對照組(n=17)。84只大鼠全部在21 d齡斷乳，實驗開始第1 天為適應(yīng)性喂養(yǎng)進行2 d后，即在23 d齡，模型組每天需定時在其頸背部采取皮下注射方式予以6 mg/100 g的DHEA以及0.2 ml量的注射用大豆油，并對對照組每天在頸背部采取皮下注射方式予以0.2 ml量的注射用大豆油，均持續(xù)應(yīng)用1月。模型組大鼠在注射第20 d需要每天獲取其陰道涂片，通過陰道涂片了解到大鼠正在動情間期，沒有動情周期變化以及排卵現(xiàn)象；2組均在第30 d進行眼眶靜脈采血，其中模型組大鼠血清激素睪酮水平升高表示造模成功，本實驗有7只造模失敗必須剔除。

3.2 分裂并且培養(yǎng)顆粒細胞：在第31天需對每只大鼠采取頸部皮下注射方式予以PMSG 50IU，并于48h后在模型組里面以隨機原則選30只大鼠，同時在空白對照組里面選10只大鼠，將其處死之后摘取卵巢，有效分離并且培養(yǎng)GC。對于模型組與對照組之中剩余大鼠，分別為30只與7只，均以頸部皮下注射方式給予HCG 25IU，并在注射后第6天將其處死，然后摘取卵巢有效分離并且培養(yǎng)卵巢部位黃素化顆粒細胞。處于無菌條件下對所取卵巢進行分離處理，去除附近脂肪組織，放于低倍顯微鏡下采取25號針頭將大鼠卵泡刺破，并且輕拍擠壓，確保卵母細胞與其顆粒細胞同時順利逸出。采用200目鋼篩進行過濾，并在離心處理后收集顆粒細胞。選用0.4%臺盼藍進行染色計數(shù)，如果鏡下沒有染為藍色，說明是死細胞[4]?？刂艷C密度數(shù)值為1.0×105/ml，并且接種于底面積25 cm2培養(yǎng)瓶里面，其中每培養(yǎng)瓶體積為1 ml，放在37℃且含5%CO2相應(yīng)培養(yǎng)箱內(nèi)部恒溫培養(yǎng)。待大部分細胞基本貼壁之后需首次更換培養(yǎng)液，之后應(yīng)該每隔48 h進行1次更換。待細胞培養(yǎng)48 h，需以0.1%胰酶消化，獲得單細胞懸液，采取磷酸緩沖液沖洗2次，并以4%多聚甲醛將其固定10 min。如果HE染色顯示細胞形態(tài)完整，外觀為多角形，同時核呈深藍色，此外胞漿淡紅色伴隨許多顆粒，且是GC，待其貼壁后備用[5]。

3.3 調(diào)配含藥血清：將所選50只6周實驗大鼠按照隨機原則分為補陽組、滋陰組以及空白對照組，采用中藥與0.9%NaCl溶液灌胃。對于灌胃給藥劑量，必須是正常大鼠劑量十倍，保證2次/d，間隔時間為12 h，控制灌胃藥總體積≤3 ml，且持續(xù)給藥3 d，注意第3 d取血樣前嚴格禁食12 h，同時1次給予全天劑量，并于給藥1 h后進行麻醉處理，再行心臟采血。離心處理血樣之后，同組血清混合，然后過濾，置于56 ℃溫度下滅活，放在-20 ℃條件存儲[6]。

3.4 分組與藥物干預： 對所培養(yǎng)獲得的顆粒細胞進行分組，共10組，且各組樣本包括5個復孔。具體干預措施為：空白對照組采用原代培養(yǎng)所獲得的正常大鼠GC；模型組1采用模型組大鼠GC；滋陰方組1采用含5%滋陰方藥相應(yīng)血清完全培養(yǎng)液，其中包含DMEM/F12、1%三抗以及10%FCS；滋陰方組2采用含10%滋陰方藥相應(yīng)血清完全培養(yǎng)液進行研究；滋陰方組3采用含20%滋陰方藥相應(yīng)血清完全培養(yǎng)液進行研究；補陽方組1采用含5%補陽方藥相應(yīng)血清完全培養(yǎng)液進行研究；補陽方組2采用含10%補陽方藥相應(yīng)血清培養(yǎng)液進行研究；補陽方組3采用含20%補陽方藥相應(yīng)血清培養(yǎng)液進行研究；空白對照組采用原代培養(yǎng)所得正常大鼠卵巢部位黃素化顆粒細胞進行研究；模型組采用模型組大鼠所得卵巢部位黃素化顆粒細胞進行研究。

3.5 檢測方法：以酶聯(lián)免疫吸附法對各組培養(yǎng)上清液內(nèi)SCF、E2以及T水平，嚴格依據(jù)試劑盒要求操作，各項測量數(shù)據(jù)必須獨立實驗重復超過3次，取均值；以逆轉(zhuǎn)錄PCR法(RT-PCR)[7]對大鼠SCF mRNA表達進行檢測，首選通過熒光定量方法檢測PCR，將RNA提取試劑盒所獲得的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，變?yōu)閏DNA，選擇β-actin作該過程內(nèi)參照平行管，并采用Real-time PCR完成SCF mRNA表達情況的檢測，待兩步法

PCR具體反應(yīng)程序完成后，利用StepOnePlus Software軟件自動獲取QR值。以熒光定量RT-PCR法[8]測定IGF-1表達灰度值。

4 觀察指標 觀察各組細胞培養(yǎng)液里面E2、SCF、T水平、IGF-1表達灰度值及SCF mRNA表達情況。

結(jié) 果

1 對照組、模型組1與滋陰方組GC里面E2、SCF水平比較 模型組1GC里面E2水平為(24.53±6.02)pmol/L，明顯低于對照組(33.54±6.09)pmol/L(P<0.05)，且SCF水平(2786.00±94.00)pg/ml，明顯高于對照組(2549.00±58.00)pg/mL；滋陰方組2 SCF(2489.00±127.00)pg/ml與滋陰方組3 SCF(2473.00±109.00)pg/mL均明顯低于模型組1(P<0.05)，而滋陰方組2 E2(33.28±3.57)pmol/L與滋陰方組3 E2(33.85±2.30)pmol/L均明顯高于模型組1(P<0.05)。

2 對照組、模型組1與滋陰方組大鼠GC SCF mRNA表達情況、IGF-1灰度值比較 模型組1大鼠GC SCF mRNA表達(1.02±0.03)明顯高于對照組(0.13±0.19)(P<0.05)，且IGF-1灰度值(154.93±8.17)明顯小于對照組(169.20±2.68)；滋陰方組2 GC SCF mRNA表達(0.23±0.07)與滋陰方組3 GC SCF mRNA表達(0.20±0.14)均顯著低于模型組1(P<0.05)，滋陰方組3 IGF-1灰度值(167.03±4.26)明顯高于模型組1(P<0.05)。

3 對照組、模型組與補陽方組大鼠卵巢部位黃素化顆粒細胞里面T、SCF水平比較 模型組大鼠卵巢部位黃素化顆粒細胞里面T為(4.89±0.45)ng/ml，明顯高于對照組(4.11±0.47)ng/ml(P<0.05)；補陽方組2 T(4.35±0.26)ng/ml與補陽方組3 T(4.32±0.29)ng/ml明顯低于模型組(P<0.05)，而補陽方組1 T水平與模型組的比較無顯著差異(P>0.05)；5組SCF水平比較無顯著差異(P>0.05)，見表1。

表1 對照組、模型組與補陽方組大鼠卵巢部位黃素化顆粒細胞里面T、SCF水平比較

注：與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

4 對照組、模型組與補陽方組大鼠卵巢部位黃素化顆粒細胞SCF mRNA表達、IGF-1灰度值比較 模型組大鼠黃素化顆粒細胞SCF mRNA表達與IGF-1灰度值均小于對照組，可比較無顯著差異(P>0.05)；補陽方組1、補陽方組2與補陽方組3大鼠黃素化顆粒細胞SCF mRNA表達及IGF-1灰度值稍高于模型組，但比較無顯著差異(P>0.05)，見表2。

表2 對照組、模型組與補陽方組大鼠卵巢部位黃素化顆粒細胞SCF mRNA表達、IGF-1灰度值比較

討 論

排卵障礙性不孕常見原因為PCOS，患者臨床表現(xiàn)特點、生化改變與具體發(fā)病機制存在高度異質(zhì)性[9]。PCOS所致生殖功能障礙現(xiàn)象核心為排卵異常，如果卵泡發(fā)育障礙，就無法形成優(yōu)勢卵泡，降低卵泡顆粒細胞水平，引發(fā)卵泡膜細胞增生現(xiàn)象，卵泡無法充分成熟，使得卵巢出現(xiàn)多囊性改變。對于卵巢局部因子，其主要經(jīng)細胞內(nèi)調(diào)節(jié)、自分泌以及旁分泌等方式于PCOS發(fā)病機制中占有重要地位[10]。促進鼠類卵泡發(fā)育主要啟動因子之一為SCF，卵巢組織中源于顆粒細胞SCF以及卵母細胞表面相應(yīng)SCF受體結(jié)合，利用磷酸肌醇3該類激酶通路于控制哺乳動物體內(nèi)卵母細胞生長以及卵泡激活或者發(fā)育方面產(chǎn)生著關(guān)鍵作用。相關(guān)實驗研究顯示，SCF能夠誘導原始卵泡發(fā)育，一旦SCF異常，可引起原始卵泡啟動障礙，導致不孕[11-12]。

PCOS多屬祖國醫(yī)學“不孕”、“閉經(jīng)”或者“月經(jīng)后期”范疇。由于病理環(huán)節(jié)關(guān)鍵在排卵異常，故談勇教授依據(jù)“經(jīng)水出諸腎”以及“腎主生殖”中醫(yī)理論，同時以夏桂成教授所提出的治療月經(jīng)周期異常理論為基礎(chǔ)，結(jié)合以往長期臨床以及實驗研究，發(fā)現(xiàn)滋陰補陽序貫法(即首先采取補精血滋陰方，然后配合補腎陽補陽方，進行序貫治療)既能改善PCOS患者臨床癥狀，又可優(yōu)化卵巢局部各類因素。本實驗前期結(jié)果顯示，采取滋陰補陽序貫法可以減少PCOS大鼠血清所含T、E2水平，并提高IGF-1的表達，有效逆轉(zhuǎn)內(nèi)分泌異常狀態(tài)，并且初步表明，實施滋陰補陽序貫法可影響PCOS模型卵巢部位卵泡發(fā)育情況與分泌功能，發(fā)揮改善下丘腦、垂體以及卵巢軸作用。

本研究表明，當PCOS模型大鼠處于卵泡發(fā)育期時，其GC所分泌產(chǎn)生的E2量顯著少于正常大鼠GC，且其分泌產(chǎn)生的SCF量明顯高于正常大鼠GC，合并顆粒細胞組織SCF mRNA表達上調(diào)現(xiàn)象。提示SCF已經(jīng)參與PCOS產(chǎn)生過程。其機制極有可能是當患者處于卵泡期的時候，顆粒細胞SCF實際表達提升可能和其卵巢過多出現(xiàn)早期卵泡生長存在聯(lián)系，因為卵泡發(fā)育早期，機體SCF可對腔前卵泡凋亡產(chǎn)生抑制作用，使得早期卵泡過多，引起卵巢多囊樣變化，從而和PCOS患者囊狀卵泡組織卵母細胞發(fā)育異常、持續(xù)沒有排卵現(xiàn)象緊密相關(guān)。對于黃體期大鼠，黃素化顆粒細胞產(chǎn)生T水平顯著高于正常對照組大鼠，然而該時期SCF水平與SCF mRNA表達情況并無明顯差異。對于滋陰方含藥血清，能夠緩解類PCOS大鼠體內(nèi)顆粒細胞所處功能性抑制狀態(tài)，降低SCF mRNA表達。10%與20%滋陰方組的這種效果最為明顯，提示中藥作用存在量效關(guān)系。本實驗補陽方含藥血清能夠抑制黃素化顆粒細胞產(chǎn)生T，其中10%濃度效果最明顯。此外，模型組1大鼠IGF-1灰度值明顯小于對照組，而滋陰方組3 IGF-1灰度值顯著高于模型組1，與王鈺等[13]研究結(jié)論一致。說明滋陰方可刺激 IGF-1分泌，上調(diào)其表達。

綜上所述，滋陰補陽方序貫療法可增強PCOS大鼠GC分泌功能，并且可能以下調(diào)卵泡期大鼠SCF基因具體表達、提高E2與IGF-1、降低T水平實現(xiàn)，從而對PCOS治療發(fā)揮指導作用。

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(收稿：2017-02-19)

多囊卵巢綜合征/中醫(yī)藥療法 @滋陰補陽方 大鼠 動物，實驗

R737.31

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.07.083