磷脂酰乙醇胺的酶促合成及底物抑制動(dòng)力學(xué)

鄧楊敏，李冰麟，董文博，楊開(kāi)利，張小里，趙彬俠

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磷脂酰乙醇胺的酶促合成及底物抑制動(dòng)力學(xué)

鄧楊敏，李冰麟，董文博，楊開(kāi)利，張小里，趙彬俠

（西北大學(xué)化工學(xué)院，陜西西安 710069）

對(duì)磷脂酶D（phospholipase D，PLD）在有機(jī)溶媒-水兩相體系中催化磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）和乙醇胺（ethanolamine，EA）合成磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)機(jī)制進(jìn)行了研究。確定最佳反應(yīng)條件為：溫度28℃，pH 5.5，底物摩爾比（EA/PC）20∶1，在此條件下PE產(chǎn)率達(dá)87.2%。通過(guò)研究底物濃度對(duì)反應(yīng)速率的影響，確定反應(yīng)符合單底物抑制的Ping-Pang 機(jī)制。分別以Matlab軟件的Fminsearch函數(shù)與Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法求取動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果基本一致，底物乙醇胺EA的抑制常數(shù)為iB=1.50mmol/L。抑制機(jī)理為兩分子EA同時(shí)結(jié)合到一分子磷脂?；?PLD中間體上，生成磷脂?；?PLD-(EA)2死端復(fù)合物，符合競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)動(dòng)力學(xué)規(guī)律。該動(dòng)力學(xué)模型預(yù)測(cè)與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)吻合良好，對(duì)PLD催化合成PE反應(yīng)過(guò)程的操作及反應(yīng)器選型設(shè)計(jì)具有指導(dǎo)作用。

磷脂酰乙醇胺；磷脂酶D；磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)；動(dòng)力學(xué)；底物抑制效應(yīng)

磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）又稱腦磷脂，是神經(jīng)細(xì)胞膜的重要組成部分，對(duì)提高記憶力與增強(qiáng)大腦功能，減緩神經(jīng)衰弱、動(dòng)脈粥樣硬化、肝硬化和脂肪性病變等具有顯著功效，在食品、藥品等領(lǐng)域具有重要用途[1-2]。與傳統(tǒng)萃取法和化學(xué)合成法相比，酶催化轉(zhuǎn)化法具有條件溫和、反應(yīng)速率快、選擇性高、副產(chǎn)物少的特點(diǎn)，是合成高純磷脂的理想途徑[3-5]。

磷脂酶D（phospholipase D，PLD）是具有催化甘油磷脂分子磷酸二酯鍵水解活性的酶類，而一些特殊來(lái)源的PLD具有能催化含羥基化合物受體與磷脂?；Y(jié)合形成新磷脂的能力，可用于催化自然界中廣泛存在的磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）極性端基交換合成稀有磷脂[6-7]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注PLD催化的磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)。BRUZIK等[8]提出磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的兩步SN-2機(jī)理，形成共價(jià)鍵相連的磷脂?；?酶中間體，符合乒乓動(dòng)力學(xué)機(jī)制；為了增加磷脂酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)相對(duì)于水解反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)，通常合成新磷脂在高羥基底物濃度下進(jìn)行。PLD催化合成PE的反應(yīng)原理如圖1所示，研究表明，PE合成中增大底物乙醇胺（ethanolamine，EA）濃度，PE產(chǎn)率先增大后減小，呈底物抑制特征[5]。研究該抑制反應(yīng)動(dòng)力學(xué)規(guī)律，確定反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型及動(dòng)力學(xué)常數(shù)，對(duì)反應(yīng)條件優(yōu)化、反應(yīng)器設(shè)計(jì)和放大都具有重要的參考價(jià)值。

本文采用溶媒-水兩相體系制備PE、PC溶于有機(jī)相，PLD和EA溶于水相。在探討溫度、pH和底物組成等反應(yīng)條件影響基礎(chǔ)上，針對(duì)底物EA抑制效應(yīng)，建立單底物抑制乒乓動(dòng)力學(xué)模型，分別以Matlab軟件的非線性回歸功能與Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法估算動(dòng)力學(xué)參數(shù)，對(duì)比發(fā)現(xiàn)軟件求解方法簡(jiǎn)便快速且結(jié)果可靠。最后進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)值進(jìn)行對(duì)比，檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn) 確性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

恒溫?fù)u床（KYC100B），上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；分析天平（T-114），北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；智能掃描儀（Pro 800），佳能電器有限公司；薄層展開(kāi)缸（PQ），上海信儀儀器有限公司。磷脂酶D，由本實(shí)驗(yàn)室保存的鏈霉菌發(fā)酵制備[9]；乙醇胺，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；大豆卵磷脂（PC含量90%），北京美亞斯磷脂技術(shù)有限公司；PC、PE標(biāo)品，美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為市購(gòu)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 磷脂酰乙醇胺合成

76mg卵磷脂溶于20mL有機(jī)溶媒乙醚（PC濃度5mmol/L），EA溶于9mL水相（0.2mol/L乙酸緩沖溶液）。二者混合后加入1mL PLD（比活力8.88U/mg-蛋白質(zhì)），置于200r/min恒溫?fù)u床反應(yīng)，一定時(shí)間間隔取樣進(jìn)行薄層色譜法分析。溫度分別設(shè)定為20～36℃；反應(yīng)初始pH分別取4.5～7.5；EA濃度分別取25～250mmol/L，對(duì)應(yīng)底物摩爾比為（EA/PC）在(5～50)∶1。

1.2.2 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

以1.2.1節(jié)所確定的最佳反應(yīng)溫度、pH條件進(jìn)行磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，分別在2～10mmol/L和20～150mmol/L范圍內(nèi)改變底物PC和EA的濃度，測(cè)定底物PC及產(chǎn)物PE濃度隨時(shí)間的變化關(guān)系，確定一定底物濃度下的初始反應(yīng)速率。

1.2.3酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型驗(yàn)證

以1.2.1節(jié)所確定的最佳反應(yīng)溫度、pH條件進(jìn)行磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，取EA濃度為25mmol/L和125 mmol/L，在5～25mmol/L范圍內(nèi)改變底物PC濃度，分別測(cè)定對(duì)應(yīng)底物濃度下的初始反應(yīng)速率，與模型數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

1.3酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)估計(jì)

將1.2.2節(jié)所取得的反應(yīng)速率與底物PC、EA濃度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用單底物抑制乒乓機(jī)制動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行模擬，分別以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法和Matlab軟件優(yōu)化法[10]求取動(dòng)力學(xué)參數(shù)。其中雙倒數(shù)法是求取酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的常用方法，成熟、直觀；Matlab法采用優(yōu)化算法函數(shù)Fminsearch進(jìn)行無(wú)約束非線性回歸，簡(jiǎn)便、快捷；兩組結(jié)果進(jìn)行對(duì)照，確定模型參數(shù)。

1.4 磷脂分析方法

磷脂樣品以薄層色譜法進(jìn)行檢測(cè)分析，GF254硅膠制成薄層板，0.5mm×100mm毛細(xì)管點(diǎn)樣，采用氯仿∶甲醇∶水∶濃氨水=13∶5∶0.5∶0.25 （體積比）的展開(kāi)劑展開(kāi)，完成后取出晾干，碘蒸氣染色。染色后用掃描儀掃描，用Photoshop和Gel-Pro軟件處理分析，獲得斑點(diǎn)灰度值，計(jì)算出各種磷脂濃度。

磷脂酰甘油產(chǎn)率定義為：（生成磷脂酰甘油的摩爾量/初始磷脂酰膽堿的摩爾量）×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度對(duì)PE生成的影響

一般地，在酶穩(wěn)定溫度范圍內(nèi)，升高溫度可加快反應(yīng)速率，縮短反應(yīng)時(shí)間；但當(dāng)溫度超過(guò)酶耐受范圍時(shí)，升溫亦加快酶的失活速率，催化反應(yīng)速率甚至減慢。溫度對(duì)PLD催化合成PE的影響如圖2所示，當(dāng)溫度低于28℃時(shí)，隨著溫度的升高，反應(yīng)速率即PE產(chǎn)率隨之增大；而溫度超過(guò)28℃時(shí)，表示反應(yīng)速率的PE產(chǎn)率反而降低。說(shuō)明PLD在28℃以上發(fā)生較為顯著的構(gòu)型改變，導(dǎo)致酶活性降低。28℃為磷脂酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的最佳溫度，PE最大產(chǎn)率達(dá)78.7%。

[5mmol/L PC，75mmol/L EA，0.2mol/L乙酸緩沖溶液（pH 5.0）]

2.2 pH對(duì)PE生成的影響

pH影響PLD活性中心組氨酸殘基中咪唑基團(tuán)的解離程度，同時(shí)也影響底物的解離程度，從而影響酶分子對(duì)底物分子的結(jié)合和催化[8]。一般酶適用的pH范圍在4～8，不宜過(guò)高也不宜過(guò)低。pH影響PLD催化合成PE實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖3，由圖可見(jiàn)，當(dāng)pH為4.5～5.5時(shí)，PE產(chǎn)率隨酸度減小而增大；但酸度進(jìn)一步減小，PE產(chǎn)率則持續(xù)下降，尤其當(dāng)介質(zhì)呈弱堿性時(shí)，產(chǎn)率最低，這是由于堿性條件下，咪唑基幾乎不解離，酶活性顯著降低。因此最佳pH為5.5，此時(shí)PE產(chǎn)率達(dá)83.86%。

（5mmol/L PC，75mmol/L EA，0.2mol/L乙酸緩沖溶液，28℃）

2.3 底物摩爾比對(duì)PE生成的影響

底物摩爾比（EA/PC）對(duì)磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的影響如圖4所示。為避免水解反應(yīng)，本研究體系均保持EA過(guò)量。由圖4可知，在一定范圍內(nèi)PE產(chǎn)率隨EA比例的增加而增大，但當(dāng)EA比例增大到一定程度時(shí)，產(chǎn)率反而隨EA比例的增加而降低。當(dāng)EA與PC的摩爾比為20:1時(shí)，PE產(chǎn)率達(dá)最大值87.2%，之后隨底物摩爾比增大，PE產(chǎn)率則顯著下降。推測(cè)可能是由于過(guò)量EA存在時(shí)，導(dǎo)致兩分子親核底物同時(shí)結(jié)合到一分子磷脂?；?PLD中間體上，形成磷脂?；?PLD-(EA)2死端復(fù)合物，從而表現(xiàn)出對(duì)反應(yīng)的抑制效應(yīng)。因此，EA和PC最優(yōu)摩爾比為20∶1。

[5mmol/L PC，0.2mol/L乙酸緩沖溶液（pH 5.5），28℃]

3 動(dòng)力學(xué)方程

3.1 酶催化動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，搖床轉(zhuǎn)速在180r/min以上時(shí)，攪拌充分，可忽略擴(kuò)散作用，本實(shí)驗(yàn)以轉(zhuǎn)速200r/min進(jìn)行反應(yīng)，因此表觀速率可用來(lái)描述本征動(dòng)力學(xué)規(guī)律。固定EA的濃度，測(cè)定不同PC濃度下的初始磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)速率，反應(yīng)速率和底物濃度的雙倒數(shù)圖如圖5所示：隨著EA濃度的增加，直線的斜率逐漸增加，在1/軸上的截距減小，說(shuō)明此時(shí)動(dòng)力學(xué)行為符合單底物抑制的乒乓機(jī)制，這個(gè)抑制即為乙醇胺抑制。

[0.2mol/L乙酸緩沖溶液（pH 5.5），28℃]

3.2 酶催化動(dòng)力學(xué)模型

序列研究表明，鏈霉菌來(lái)源PLD具有高度相似的一級(jí)結(jié)構(gòu)，酶分子含有的兩個(gè)HxKxxxxD模體參與活性中心構(gòu)成，其中，H表示組氨酸，K表示賴氨酸，D表示天冬氨酸[11]。酶催化反應(yīng)過(guò)程如圖6所示。

過(guò)程簡(jiǎn)要描述為：①酶N端結(jié)構(gòu)域中組氨酸殘基的咪唑基親核進(jìn)攻磷原子，與磷脂底物形成一個(gè)負(fù)電荷五價(jià)磷的過(guò)渡狀態(tài)，C端結(jié)構(gòu)域組氨酸殘基質(zhì)子化，給離去基團(tuán)提供一個(gè)氫原子，釋放出膽堿；②C端結(jié)構(gòu)域組氨酸與底物醇作用去質(zhì)子化，活化醇作為第二親核體親核進(jìn)攻磷脂酰基-PLD中間體上的磷原子；③生成產(chǎn)物，同時(shí)PLD恢復(fù)到最初狀態(tài)，并繼續(xù)參與到下一輪反應(yīng)中[12]，符合乒乓機(jī)制。結(jié)合3.1節(jié)中的結(jié)果，猜測(cè)過(guò)量EA存在時(shí)可能導(dǎo)致兩分子親核底物同時(shí)結(jié)合到一分子磷脂酰 基-PLD中間體上，形成磷脂?；?PLD-(EA)2死端復(fù)合物，故在乒乓機(jī)制的基礎(chǔ)上引入單底物EA抑制常數(shù)iB進(jìn)行處理，動(dòng)力學(xué)方程如式(1)所示。

式中，為反應(yīng)速率；max為最大反應(yīng)速率；A和B分別表示PC和EA的濃度；mA和mB分別為PC和EA的結(jié)合常數(shù)；iB為EA的抑制常數(shù)。待求動(dòng)力學(xué)參數(shù)包括maxmAmB和iB。

3.3 動(dòng)力學(xué)模型求解

求解動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)的傳統(tǒng)方法為雙倒數(shù)法，本文利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法，將式(1)兩邊取倒數(shù)，整理為式(2)。

式(2)整理為式(3)。

利用Origin軟件對(duì)式(3)進(jìn)行非線性擬合，得到圖7所示兩個(gè)擬合方程，系數(shù)A、B和C均已知，由此建立方程組求解動(dòng)力學(xué)參數(shù)vmax、KmA、KmB和kiB，如表1所示。

表1 動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)

這種方法成熟、直觀，但推導(dǎo)過(guò)程繁瑣，尤其在體系較為復(fù)雜的情況下，運(yùn)算量大且易出錯(cuò)。因此，本文嘗試用Matlab軟件直接求解動(dòng)力學(xué)參數(shù)，動(dòng)力學(xué)方程特點(diǎn)為無(wú)約束條件、非線性，可選用Fminsearch函數(shù)進(jìn)行參數(shù)求解。對(duì)于雙底物酶催化反應(yīng)，方程中有兩個(gè)自變量A和B，以B=50mmol/L時(shí)的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，也可求得一組參數(shù)，如表1所示。

由表1對(duì)比可見(jiàn)，兩種方法所求參數(shù)別無(wú)二致，使用Matlab軟件求解結(jié)果準(zhǔn)確、方便快捷，可用來(lái)模擬PLD催化合成PE底物抑制動(dòng)力學(xué)，也為其他復(fù)雜動(dòng)力學(xué)模型求解提供參考。

將所求參數(shù)代入式(1)，得酶催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程，如式(4)。

4 動(dòng)力學(xué)模型驗(yàn)證

改變底物PC和EA濃度進(jìn)行動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證上述磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)底物抑制動(dòng)力學(xué)模型。結(jié)果如圖8所示，實(shí)線表示模型數(shù)據(jù)，散點(diǎn)表示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。由圖8可見(jiàn)，在較低PC濃度下，增加EA濃度反應(yīng)速率反而降低；而隨著PC濃度增高，EA的抑制作用減緩。證明了EA和PC分別通過(guò)增加或減少“死端復(fù)合物”濃度而影響反應(yīng)速率的機(jī)制。模型預(yù)測(cè)與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基本吻合，符合競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)動(dòng)力學(xué)規(guī)律。依據(jù)所得動(dòng)力學(xué)模型不僅可預(yù)測(cè)PLD催化PC制備PE反應(yīng)的進(jìn)程，而且可指導(dǎo)反應(yīng)操作方式優(yōu)選及反應(yīng)器設(shè)計(jì)。

5 結(jié)論

雙相反應(yīng)體系中，PLD催化PC磷脂酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)制備PE的最佳工藝條件為：溫度28℃、pH 5.5、底物摩爾比20∶1。高底物（EA）濃度下磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)速率出現(xiàn)降低趨勢(shì)，其原因是EA產(chǎn)生底物抑制，通過(guò)研究反應(yīng)機(jī)理，建立了符合單底物抑制乒乓機(jī)制的動(dòng)力學(xué)模型；運(yùn)用Matlab強(qiáng)大的數(shù)據(jù)分析與處理功能求解該復(fù)雜動(dòng)力學(xué)模型，求出動(dòng)力學(xué)參數(shù)，模型預(yù)測(cè)與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)吻合。該動(dòng)力學(xué)模型對(duì)PLD催化合成PE反應(yīng)過(guò)程的操作及反應(yīng)器選型設(shè)計(jì)具有指導(dǎo)作用。

[0.2mol/L乙酸緩沖溶液（pH 5.5），28℃]

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Synthesis of phosphatidylethanolamine by enzymatic catalysis and its substrate inhibition kinetics

DENG Yangmin，LI Binglin，DONG Wenbo,YANG Kaili，ZHANG Xiaoli，ZHAO Binxia

（College of Chemical Engeering，Northwest University，Xi’an 710069，Shaanxi，China）

Phosphatidylethanolamine（PE）was synthesized by phospholipase D（PLD）catalyzed transphosphatidylation from phosphatidylcholine（PC）and ethanolamine（EA）in bi-phasic system. The conditions of enzyme-catalyzed reaction were investigated，and the optimum conditions were as follows：reaction temperature 28℃，pH 5.5，and the mole ratio of EA to PC 20∶1. The highest yield of PE can reach 87.2%. In addition，the kinetic study indicated that phospholipids were catalyzed by PLD in a Ping-Pang manner. The kinetic model of PLD-catalyzed reaction considering the substrate inhibition was built，which based on the Ping-Pang Bi-Bi mechanism. The parameters of kinetic model were determined by unconstrained nonlinear regression of the Fminsearch function in Matlab software. It showed that the results from this method were identical with that from the double reciprocal Lineweaver-Burk plot，the inhibition constant for substrate EA wasiB=1.50mmol/L. Inhibition mechanism is a phosphatidyl-enzyme complex associating with two nucleophile molecules EA to form phosphatidyl-PLD-(EA)2dead-end complex，and the inhibition mechanism complied with the competitive inhibition of enzyme by EA during the transphosphatidylation reaction. The simulation results were well fitted to the experimental data for different conditions. Therefore，it is speculated that this model supports the hypothesis described above and can provide guidance for the phospholipid synthesis process and design of the devices.

phosphatidylethanolamine；phospholipase D；transphosphatidylation；kinetics；substrate inhibition

TQ033

A

1000–6613（2017）07–2601–06

10.16085/j.issn.1000-6613. 2016-2298

2016-12-13；

2017-01-20。

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2014JM2057）。

鄧楊敏（1994—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榇呋磻?yīng)工程。

聯(lián)系人：張小里，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樯锎呋^(guò)程。E-mail：xlzhang@nwu.edu.cn。