芍藥內(nèi)酯苷對放射線輻照法致血虛免疫抑制小鼠的補血作用及機制研究

王成龍 王林元 朱映黎 瞿研 吳麗 王莎 費文婷 張建軍

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芍藥內(nèi)酯苷對放射線輻照法致血虛免疫抑制小鼠的補血作用及機制研究

王成龍 王林元 朱映黎 瞿研 吳麗 王莎 費文婷 張建軍

目的 研究芍藥內(nèi)酯苷對放射線輻照誘導(dǎo)血虛小鼠的補血作用及調(diào)控機制。方法 采用放射線輻照法復(fù)制小鼠血虛模型，以四物顆粒和芍藥苷為陽性對照藥，灌胃芍藥內(nèi)酯苷，檢測外周血象、脾臟指數(shù)及分離血清，用放射免疫法檢測其白細胞介素-1、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)的含量變化并采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測脾臟中GM-CSF和TNF-α的基因表達。結(jié)果 與模型組比較，芍藥內(nèi)酯苷30 mg/kg組對白細胞數(shù)、脾臟指數(shù)均有升高作用(P<0.05)，對GM-CSF含量水平亦有升高作用(P<0.05)，但降低TNF-α的含量水平(P<0.01)及脾臟中TNF-α mRNA的表達(P<0.01)。結(jié)論 芍藥內(nèi)酯苷作為白芍的特征性有效成分，通過對造血細胞因子的調(diào)控作用對抗放射線輻照所致的血虛狀態(tài)，提示其為白芍養(yǎng)血斂陰功效的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

芍藥內(nèi)酯苷； 放射線輻照法； 血虛證； 造血細胞因子

白芍[1]有養(yǎng)血斂陰之功，常用于血虛萎黃，月經(jīng)不調(diào)。赤芍[1]有清熱涼血之效，常用于熱入營血，血熱發(fā)斑。究其原因，可能與藥材的生長方式、地域分布、生態(tài)環(huán)境等因素密切相關(guān)[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明[3-4]，白芍含有單萜及其他苷類化合物，其中含量相對較多的兩個成分分別為芍藥苷與芍藥內(nèi)酯苷，中國藥典規(guī)定芍藥苷為白芍的標(biāo)志性成分,但芍藥苷同時也是赤芍的標(biāo)志性成分[1]。李強等[5]發(fā)現(xiàn)白芍對于失血法所致的小鼠血虛證的血紅蛋白、紅細胞、血細胞比容值均有升高作用；在環(huán)磷酰胺致血虛模型中同樣具有該作用[6]，高月等[7]采用基因芯片技術(shù)的研究顯示，芍藥苷可促進骨髓基質(zhì)細胞分泌造血因子粒細胞集落刺激因子、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、血小板衍生生長因子-α等；抑制造血抑制因子巨噬細胞炎性蛋白的分泌，從而發(fā)揮補血作用。朱映黎等[8-9]、屈勝勝等[10]及張建軍等[11]揭示芍藥內(nèi)酯苷可以作為區(qū)分赤芍和白芍的差異性成分，但由于芍藥苷制備方法較為成熟而芍藥內(nèi)酯苷難于分離純化，文獻中對芍藥內(nèi)酯苷的藥理研究報道較少。本實驗在課題組前期實驗研究的基礎(chǔ)上，通過芍藥內(nèi)酯苷對放射線輻照致血虛小鼠影響的研究，探討白芍特征成分芍藥內(nèi)酯苷補血作用的特點及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級健康雄性昆明種小鼠，體重(20±2) g，購自北京斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司[許可證號：SCXK(京)2014-0004]。并以清潔級小鼠維持飼料飼養(yǎng)，由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供[合格證號：京飼審(2012)06166]。小鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物房，整個實驗過程中大鼠自由攝食和飲水(特殊實驗期除外)，室溫20～22℃，相對濕度為60%～70%，燈照周期為12小時，7:00～19:00燈照，19：00～7：00黑暗。實驗符合相關(guān)倫理學(xué)要求。

1.2 照射單位及照射劑量

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，根據(jù)需要采用60Coγ射線全身輻照1次，輻照劑量3.5Gy，劑量率1.60 Gy/min。

1.3 實驗藥物

實驗用芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷：自制，純度均高于96%；陽性藥四物顆粒[吉泰安(四川)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：1307045]，經(jīng)本室HPLC測定，本品四物顆粒每袋含芍藥苷量為32 mg；芍藥內(nèi)酯苷含量為16.45 mg，符合2015版藥典四物顆粒規(guī)定要求[23]，并由本實驗室制成藥粉備用，用時根據(jù)實驗需要用去離子水配制成小鼠用藥所需濃度。

1.4 儀器與試劑

60Coγ放射源由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所提供；Beckman Coulter Ac.T5血細胞分析儀(美國Beckman Coulter Inc)；Beckman Coulter Ac.T5 diff Rinse(批號：05202C2)，Ac. T5 diff WBC Lyse(批號：20402B)，Ac. T5 diff Fix(批號：21802E)，Ac.T5 diff Hgb Lyse(批號：06902A2)；試劑由北京華英生物技術(shù)研究所提供，Stat Fax 2100全自動酶標(biāo)儀(Awareness Technology Inc.USA)；IL-1測試盒：北京華英生物技術(shù)研究所(批號：201510729)，GM-CSF測試盒：北京華英生物技術(shù)研究所(批號：201510730)，TNF-α測試盒：北京華英生物技術(shù)研究所(批號：201510732)。

表1 引物序列

1.5 動物分組與給藥方法

將72只小鼠隨機分成6個組，即空白組、模型組、四物顆粒2.5 g/kg組(相當(dāng)于人用量15 g/日，2.5 g四物顆粒中含芍藥內(nèi)酯苷8.225 mg、芍藥苷16 mg)、芍藥苷30 mg/kg組，芍藥內(nèi)酯苷30 mg/kg 組、芍藥內(nèi)酯苷15 mg/kg組，每組12只。預(yù)防給藥7天，按每10 g體重灌胃0.2 mL給藥，每天1次?？瞻捉M、模型組每天灌胃去離子水。

1.6 造模方法

動物適應(yīng)性喂養(yǎng)5天后，預(yù)先給藥7天，于第8天上午9：00-11：00按要求進行60Coγ射線全身輻照1次，輻照劑量3.5 Gy，劑量率1.60 Gy/min輻照，造成血虛證模型。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 一般觀察 觀察小鼠的口唇、眼睛、皮毛、尾巴的顏色，精神狀態(tài)等。

1.7.2 體重測試 實驗開始前測體重，以其原始體重作為隨機分組的參考標(biāo)準(zhǔn)，取材前一天，禁食不禁水12小時后測體質(zhì)量并記錄。

1.7.3 外周血象測定 輻照后小鼠連續(xù)灌胃14天，于第14天末，目內(nèi)眥取血1 mL，并室溫靜置3～4 小時后以4500 r/min離心20分鐘，移取上清液,測定外周血液中白細胞(white blood cell,WBC)、紅細胞(red blood cell,RBC)、血紅蛋白(hemoglobin,HGB)、紅細胞比容(hematocrit,HCT)數(shù)量。

1.7.4 血清中IL-1、GM-CSF、TNF-α含量測定 在體重稱重全部結(jié)束后,隨即用水合氯醛麻醉,摘眼球取血，EDTA抗凝，室溫下靜置、凝固、離心(3500 r/min,15分鐘)、取上清，樣品存于-20℃存放待測。用放射免疫法，按試劑盒說明書操作要求進行血清中IL-1、GM-CSF、TNF-α含量測定。

1.7.5 脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的測定 小鼠頸椎脫臼死亡后，迅速開腹腔并在冰上分離摘取脾臟和胸腺、快速取出脾臟及胸腺即用電子天平稱重，分別計算與體重的比值。指數(shù)計算采用以下公式：脾臟(或胸腺)指數(shù)=100×脾臟(或胸腺)重量/體質(zhì)量。

1.7.6 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RT-qPCR)檢測脾臟中CM-CSF、TNF-α mRNA表達 每組取3只小鼠脾臟組織按Trizol試劑說明，采用異硫氰酸胍一步法抽提總RNA，總RNA經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳確定其完整性，采用紫外分光光度計檢測總RNA的含量和純度。取3 μg總RNA為模板，加入Oligo(dT)和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶后以50 μL反應(yīng)體系在42℃下反應(yīng)1小時合成cDNA第一鏈，80℃加熱3分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。采用SYBR Green I熒光染料技術(shù)，在20 μL反應(yīng)體系中，加入cDNA 2 μL、ddH2O 13 μL、SYBR Green熒光定量PCR Mix 4 μL、相應(yīng)上下游引物各0.5 μL。反應(yīng)條件為：94℃ 10分鐘、94℃ 10秒、X℃(相應(yīng)基因退火溫度)10秒、72℃10秒，45個循環(huán)。同時做溶解曲線以確認(rèn)是否是單一峰。反應(yīng)結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴增產(chǎn)物是否符合原設(shè)計片段長度。PCR反應(yīng)及數(shù)據(jù)采集在Light Cycler 2.0系統(tǒng)上進行，記錄其循環(huán)閾值(CT)，基因表達結(jié)果采用相對定量公式2-ΔΔCT計算，其中Δ(Ct)值=靶基因的(Ct)值-β-actin的(Ct)值。測定脾臟組織CM-CSF、TNF-α mRNA表達水平。引物設(shè)計使用Primer 3.0軟件，計算機輔助設(shè)計，引物序列見表1。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 動物的一般體征觀察結(jié)果

模型組小鼠從輻照第3天后即出現(xiàn)耳朵、尾巴蒼白，喘促，逃避、尖叫、直立等現(xiàn)象減少，安靜時拱背，反應(yīng)遲鈍，大部分出現(xiàn)懶動，食量減少，毛蓬豎而少光澤，血色暗紅。四物顆粒組和芍藥苷組小鼠行動敏捷，腰背平直，眼睛明亮，鼻唇潔凈潮濕呈淡粉紅色，尾圓色粉紅，毛色正常，與空白組無明顯區(qū)別。從致病原因和模型組小鼠的一般體征及癥狀表現(xiàn)來看，本方法所建立動物模型能反映血虛證的特點和本質(zhì)。

2.2 芍藥內(nèi)酯苷對血虛小鼠體重和胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)的影響

與空白組相比，模型組體重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)顯著低于空白組(P<0.01，P<0.05，P<0.01)。與模型組相比，四物顆粒組體重、脾臟指數(shù)明顯高于模型組(P<0.01，P<0.01)；芍藥苷30 mg/kg和芍藥內(nèi)酯苷30 mg/kg組體重、脾臟指數(shù)明顯高于模型組(P<0.01)，除四物顆粒組外，各給藥組都有升高胸腺指數(shù)的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3 芍藥內(nèi)酯苷對血虛小鼠外周血象的影響

與空白組比較，模型組的WBC及RBC數(shù)量顯著降低(P<0.01)、HGB數(shù)量降低(P<0.05)、HCT百分比明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，四物顆粒組和芍藥苷30 mg/kg組WBC和RBC數(shù)量顯著升高(P<0.01，P<0.05)、HCT百分比明顯升高(P<0.01)；芍藥內(nèi)酯苷30 mg/kg組WBC和RBC數(shù)量明顯升高(P<0.01，P<0.01)、HCT百分比升高(P<0.05)。各給藥組HGB數(shù)有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表3。

表2 芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷對放射線輻照所致血虛小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響±s,n=12)

注： 與空白組比較，aP<0.05,bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05,dP<0.01。

表3 芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷對放射線輻照法所致血虛小鼠的WBC、RBC、HGB、HCT的影響

注： 與空白組比較，aP<0.05,bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05,dP<0.01。

表4 芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷對放射線輻照所致血虛小鼠的IL-1、GM-CSF、TNF-α的影響

注： 與空白組比較，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05,dP<0.01；

2.4 芍藥內(nèi)酯苷對血虛小鼠血清IL-1、GM-CSF、TNF-α含量變化的影響

與空白組比較，模型組GM-CSF的含量顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，四物顆粒組的GM-CSF的含量顯著升高(P<0.01)，芍藥苷30 mg/kg組和芍藥內(nèi)酯苷30 mg/kg組GM-CSF的含量明顯升高(P<0.05，P<0.05)。與空白組比較，模型組TNF-α的含量顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，四物顆粒組、芍藥苷30 mg/kg組及芍藥內(nèi)酯苷30 mg/kg組的TNF-α的含量明顯減少(P<0.01，P<0.05，P<0.05)，IL-1有升高的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),芍藥內(nèi)酯苷15 mg/kg組TNF-α的含量有減少的趨勢但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表4。

2.5 芍藥內(nèi)酯苷對放射線輻照法致血虛小鼠脾臟組織CM-CSF、TNF-αmRNA表達水平變化的影響

與空白組比較，模型組GM-CSF mRNA的含量顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，四物顆粒組GM-CSF mRNA的含量明顯升高(P<0.01)，芍藥苷30 mg/kg組GM-CSF mRNA含量升高(P<0.05)，芍藥內(nèi)酯苷30 mg/kg組GM-CSF mRNA含量有升高的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與空白組比較，模型組TNF-α mRNA的含量顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，四物顆粒組和芍藥苷30 mg/kg組TNF-α mRNA的含量減少(P<0.05，P<0.05)，芍藥內(nèi)酯苷30 mg/kg組TNF-α mRNA的含量明顯減少(P<0.01),芍藥內(nèi)酯苷15 mg/kg組TNF-α mRNA的含量的也有減少趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表5。

表5 芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷對放射線輻照所致血虛小鼠GM-CSF、TNF-αmRNA表達水平的影響

注： 與空白組比較，aP<0.05,bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05,dP<0.01。

3 討論

血虛證[12]是臨床常見病癥，現(xiàn)階段制作血虛證模型的實驗方法較多，常用的有綜合放血法、放射線輻照法和腹腔注射環(huán)磷酰胺法。其中放射線輻照法是公認(rèn)的動物血虛證模型的造模方法之一[13]，此法制備的血虛模型小鼠胸腺和脾臟萎縮，在一定程度上體現(xiàn)了血虛證的臨床表現(xiàn)特點和病理的基本變化，現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用于血虛發(fā)病機制和改善造血機能藥物篩選的研究[10]。四物湯為中醫(yī)治療血虛證的首選藥，由當(dāng)歸、白芍等四味藥組成，筆者采用其成方顆粒劑型作為陽性對照藥，并經(jīng)本實驗室HPLC測定芍藥內(nèi)酯苷(32 mg/袋)及芍藥苷含量(16.45 mg/袋)，表明在本實驗給藥劑量下，二者在四物顆粒成方制劑中的用量與本實驗二者的單一成分給藥劑量相當(dāng)。高月[14]、馬增春等[15]研究表明，四物湯治療血虛證與骨髓造血機制相關(guān)，主要通過促進骨髓造血干細胞的增殖和抑制骨髓造血干細胞的凋亡來實現(xiàn)。

放射線輻照法致血虛證的實質(zhì)為骨髓造血功能的損傷，使骨髓超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,造血微環(huán)境遭到破壞，骨髓造血重建活性下降，導(dǎo)致血細胞數(shù)量的減少[16]。藥物影響骨髓造血功能的反應(yīng)及表現(xiàn)，最終都會反映在血象上，所以通過觀察藥物對血象的影響，可以作為評價藥物對造血功能影響的重要指標(biāo)。本研究表明芍藥內(nèi)酯苷對放射線輻照法致血虛小鼠具有明確的補血作用，證實芍藥內(nèi)酯苷的補血作用與芍藥苷相似，二者均能升高血虛小鼠的白細胞且對脾臟指數(shù)也有提高作用，因本實驗所選輻照模型對白細胞敏感，但對紅細胞不穩(wěn)定，有時可減少，有時有變化但不大[7，10]。同時，骨髓造血功能受多種造血生長因子調(diào)節(jié)。GM-CSF是對早期造血祖細胞具有廣泛增殖促進活性的集落刺激因子，主要作用于髓系祖細胞，通過與其高親和力受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，使其迅速進入細胞周期向粒系及巨噬系分化，最后成為成熟細胞，并能延長成熟細胞的壽命，增強成熟細胞的功能[17]。TNF-α是一種單核因子，主要由單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，是一種重要的促炎因子和免疫調(diào)節(jié)因子，能抑制細胞克隆的形成，是造血系統(tǒng)的負(fù)向調(diào)控因子之一[7]。而IL-1是迄今為止對抗放射線效應(yīng)最強的細胞因子，其通過直接參與啟動造血干細胞、組細胞的活化過程[18-19]。因此，細胞因子的活化，能夠在一定程度闡明保護及修復(fù)造血干/祖細胞的機理[20-21]。脾臟是主統(tǒng)血，就與血液系統(tǒng)的關(guān)系而言,脾臟參與造血、貯血,并能調(diào)節(jié)外周血液的成分。因此本實驗依據(jù)血清中IL-1、GM-CSF、TNF-α檢測結(jié)果，選取脾臟中GM-CSF、TNF-α的基因表達進行研究。本實驗結(jié)果顯示，芍藥苷的補血作用與四物顆粒相似，均通過促進GM-CSF造血細胞因子的產(chǎn)生來實現(xiàn)。芍藥內(nèi)酯苷也能升高血清GM-CSF含量水平和脾臟中GM-CSF的基因表達，表明其三者的共有機制可能為通過刺激正向調(diào)控因子的分泌，在造血干/祖細胞增殖和分化、免疫細胞的成熟、活化和免疫調(diào)節(jié)等一系列過程中發(fā)揮作用。同時，芍藥內(nèi)酯苷與芍藥苷還能降低TNF-α的含量水平和脾臟中TNF-α的基因表達，且芍藥內(nèi)酯苷作用優(yōu)于芍藥苷，則提示白芍的補血作用可能還與通過降低TNF-α的含量和脾臟中TNF-α的基因表達，來促進造血細胞進入增殖周期，并抑制其過度表達Fas受體抑制早期造血功能[22]即對負(fù)向造血細胞因子抑制有關(guān)。據(jù)此結(jié)果推測，芍藥內(nèi)酯苷作為白芍的特征成分，能夠從調(diào)控正向、負(fù)向細胞因子2個方面來調(diào)節(jié)放射線輻照致小鼠血虛狀態(tài)；而其主要有效性成分芍藥苷更傾向于通過調(diào)控正向細胞因子來進行調(diào)節(jié)，這與本課題組前期研究結(jié)果相一致[7、23]，并提示芍藥內(nèi)酯苷的補血機制與骨髓造血系統(tǒng)及機體的免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。據(jù)筆者推測，因本次實驗中選擇的造模輻照劑量偏大，或給藥期間小鼠狀態(tài)欠佳等因素，導(dǎo)致本次血虛小鼠造模程度較重，而給藥組未能完全對抗其血虛狀態(tài)，提高給藥組小鼠RBC、HGB的數(shù)量以及血清中IL-1含量的水平。同時，為進一步研究芍藥內(nèi)酯苷對放射輻照法致血虛小鼠的補血作用及相關(guān)機制還需從免疫器官(包括胸腺、骨髓等淋巴器官組織)造血細胞因子基因及蛋白水平進行深入探討。

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(本文編輯： 禹佳)

Effects and mechanism of paeoniflorin on mouse model of blood deficiency syndrome induced by radioactive rays

WANGChenglong,WANGLinyuan,ZHUYingli,etal.

BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China

ZHANGJianjun,E-mail：zjj59@163.com

Objective To explore the effects and mechanism of paeoniflorin on mouse model of blood deficiency syndrome induced by60Co-γ irradiation. Methods Mouse model of blood deficiency syndrome induced by60Co-γ irradiation,Siwugranules and albiflorin was regarded as positive control. Paeoniflorin was given during modeling. The peripheral hemogram and index of thymus gland and spleen were detected, the levels of IL-1, GM-CSF, and TNF-α in serum were detected by radioimmunoassay. The mRNA expressions of hematopoietic-related factors in spleen were detected by RT-qPCR. Results Compared with the model group, the amount of WBC and the index of spleen in paeoniflorin group at the dose of 30 mg/kg were increased obviously (P<0.01,P<0.05) and the levels of GM-CSF in serum in paeoniflorin group(30 mg/kg) was increased obviously (P<0.01,P<0.05), but the level of TNF-α in serum in groups of 30 mg/kg paeoniflorin were reduced (P<0.05) and the expression of TNF-α mRNA in spleen were decreased (P<0.01). Conclusion Paeoniflorin is the characteristic effective constituents of paeoniae radix alba, has regulating effect on hematopoietic cytokine to against blood deficiency induced by radioactive rays. It reminders that paeoniflorin is one of the basic nourishing materials basis for nourishing blood and astringing yin in paeoniae radix alba.

Paeoniflorin; Irradiation; Blood deficiency syndrome; Hematopoietic cytokine

國家自然科學(xué)基金(81473370)

100029 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院[王成龍(碩士研究生)、王林元、朱映黎、瞿研、吳麗、王莎、費文婷、張建軍]

王成龍(1988- )，2014級在讀碩士研究生。研究方向：基于中藥基礎(chǔ)理論的藥效機理及物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail：18810900709@163.com

張建軍(1965- )，女，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，中華中醫(yī)藥學(xué)會中藥基礎(chǔ)理論分會秘書長。研究方向：基于中藥基礎(chǔ)理論的藥效機理及物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail：zjj59@163.com

R364.7

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.07.002

2016-07-03)