茶葉提取物EGCG和GCG及ECG對(duì)B16細(xì)胞內(nèi)黑色素生成的抑制作用

張向娜，林勇*，黃建安*，劉仲華，梁丹丹

(1.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

茶葉提取物EGCG和GCG及ECG對(duì)B16細(xì)胞內(nèi)黑色素生成的抑制作用

張向娜1,2,3，林勇1,2,3*，黃建安1,2,3*，劉仲華1,2,3，梁丹丹3

(1.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

為研究茶葉提取物表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(gallocatechingallate, GCG)和表兒茶素沒(méi)食子酸酯(epicatechingallate, ECG)對(duì)體外培養(yǎng)B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞黑色素生成及酪氨酸酶活性的影響，分別用不同濃度的 EGCG、GCG、ECG和熊果苷(Arbutin,AR)處理細(xì)胞，觀察效應(yīng)物對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響，用溴化二苯四偶氮法(MTT法)測(cè)定茶葉提取物對(duì)細(xì)胞增殖率的影響，以左旋多巴(L-DOPA)為底物，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性，采用氫氧化鈉裂解法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)黑色素的含量。結(jié)果顯示，EGCG、ECG、GCG能顯著抑制B16細(xì)胞的黑色素生成和酪氨酸酶的活性，且呈劑量依賴關(guān)系；當(dāng)濃度為60 μg/mL時(shí)，細(xì)胞增殖率均低于50%，酪氨酸酶活性與對(duì)照組相比分別降低了26.67%、27.27%和32.71%，黑色素生成抑制率均在30%以上。結(jié)果表明，茶葉提取物能通過(guò)多種途徑抑制黑色素生成，且GCG的作用效果最優(yōu)，ECG的作用效果次之，三者的作用效果均優(yōu)于熊果苷的作用效果。

茶葉提取物；表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯；沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯；表兒茶素沒(méi)食子酸酯；B16黑色素瘤細(xì)胞；黑色素生成；酪氨酸酶

健康、白皙的肌膚是東方女性理想的肌膚狀態(tài)，而皮膚黑色素的含量及分布很大程度上影響著肌膚的呈色。皮膚黑色素主要由位于表皮基底層的黑色素細(xì)胞產(chǎn)生。皮膚受到紫外線照射后可激活黑色素細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性。隨黑色素生成量的增加，膚色變深變暗，所以，酪氨酸酶是黑色素合成反應(yīng)的關(guān)鍵酶，在黑色素的形成和沉積過(guò)程中起著重要作用[1-3]。隨著化妝品行業(yè)的發(fā)展與成熟，消費(fèi)者對(duì)美白產(chǎn)品的要求也不斷提高。天然植物提取物具有良好的美白效果，且安全性好，已成為藥學(xué)和化妝品行業(yè)研究的熱點(diǎn)[4-5]。

茶葉中的EGCG、ECG、GCG等兒茶素類物質(zhì)具有保健及藥用功能。目前已有關(guān)于茶葉提取物對(duì)體外酶活性抑制作用的研究[6-8]，而以體外培養(yǎng)黑色素細(xì)胞為對(duì)象研究茶葉提取物對(duì)黑色素生成影響的報(bào)道尚少。國(guó)內(nèi)僅有少數(shù)關(guān)于茶黃素(theaflavins,TFs)和EGCG美白效果的研究[9-10]。國(guó)外僅有GCG和ECG對(duì)體外蘑菇酪氨酸酶活性抑制作用的報(bào)道，而關(guān)于其對(duì)體內(nèi)黑色素生成和酪氨酸酶活性抑制作用的研究尚少。本試驗(yàn)中建立體外培養(yǎng)B16黑色素細(xì)胞模型，研究EGCG、GCG和ECG對(duì)細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的作用及對(duì)細(xì)胞黑色素生成的影響，并與常用的美白劑熊果苷進(jìn)行比較，以探明 EGCG、GCG及ECG的美白作用機(jī)制，為研制天然美白劑提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和設(shè)備

1.1.1 材料

B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞購(gòu)于上海博谷生物科技有限公司；GCG、ECG、EGCG和熊果苷均購(gòu)于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司。GCG、ECG、EGCG和熊果苷的純度均大于等于98%。

1.1.2 主要儀器與試劑

主要儀器： CO2培養(yǎng)箱(Nuaire，美國(guó))；倒置顯微鏡(Leica Microsystems，德國(guó))；全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀(Thermo Scientific，美國(guó))；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；多功能酶標(biāo)儀(Thermo，美國(guó))；普通離心機(jī)(Rotina，德國(guó))；水平振蕩儀(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)；精密電子天平(Starorius，瑞士)；電熱恒溫水浴鍋；高壓蒸氣滅菌鍋；烘箱。

主要試劑：PBS粉劑；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，Amresco，美國(guó))；二甲基亞砜(DMSO，Sigma，美國(guó))；RPMI-1640 培養(yǎng)基；胎牛血清(FBS，Hyclone，美國(guó))；胰蛋白酶(含0.05% EDTA，Gibco，美國(guó))；左旋多巴(L-DOPA)；TritonX-100(Sigma，美國(guó))；NaOH(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代

細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代參照文獻(xiàn)[11]中的方法進(jìn)行：在無(wú)菌條件下，將B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2、相對(duì)濕度98%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天更換新鮮培養(yǎng)液1次。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度為 80%～90%時(shí)，用 0.25%胰蛋白酶(含0.05%EDTA)消化細(xì)胞，傳代培養(yǎng)，收集復(fù)蘇后傳代培養(yǎng)3代以上的對(duì)數(shù)期細(xì)胞，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)的觀察

細(xì)胞形態(tài)的觀察參照文獻(xiàn)[12]中的方法進(jìn)行：待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合狀態(tài)，用0.25%胰蛋白酶消化，收集并制備單細(xì)胞懸液，用新鮮培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，細(xì)胞貼壁后棄上清液，用PBS漂洗1次，加入100 μL含有不同濃度受試物的新鮮培養(yǎng)液(GCG、ECG、EGCG、熊果苷的質(zhì)量濃度均為 20、40、60、80、100 μg/mL)，每一濃度均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組以等量的新鮮培養(yǎng)液代替，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后于倒置顯微鏡下觀察試驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)，并拍照記錄。

1.2.3 細(xì)胞增殖率的測(cè)定

細(xì)胞增殖率的測(cè)定參照文獻(xiàn)[13]中的方法進(jìn)行：待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合狀態(tài)，用0.25%胰蛋白酶消化，收集并制備單細(xì)胞懸液，用新鮮培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，細(xì)胞貼壁后棄上清液，用PBS漂洗1次，加入 100 μL含有不同濃度受試物的新鮮培養(yǎng)液(GCG、ECG、EGCG、熊果苷的質(zhì)量濃度均為5、10、20、40、60 μg/mL)，設(shè)對(duì)照組、GCG處理組、ECG處理組、EGCG處理組和熊果苷處理組，每一濃度均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組不加藥物，以等量的新鮮培養(yǎng)液代替，置于 CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 48 h后棄上清，每孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL及90 μL新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)基。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)基和MTT，向各孔中加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩15 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm下各孔的OD值，計(jì)算細(xì)胞的增殖率。細(xì)胞增殖率=(試驗(yàn)孔OD570nm－空白孔OD570nm)/(對(duì)照孔OD570nm－空白孔OD570nm)。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的測(cè)定

細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的測(cè)定參照文獻(xiàn)[14]中的方法進(jìn)行。細(xì)胞處理方法同1.2.3。培養(yǎng)48 h后棄上清液，每孔加入含1%TritonX-100的PBS緩沖液90 μL，加入 10 μL 1 mg/mL 的左旋多巴(L-DOPA)，37 ℃孵育60 min后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)475 nm下各孔的OD值。計(jì)算細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性。酪氨酸酶活性=(試驗(yàn)孔 OD475nm－空白孔 OD475nm)/(對(duì)照孔OD475nm－空白孔OD475nm)。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)黑色素含量的測(cè)定

細(xì)胞內(nèi)黑色素含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[15]中的方法進(jìn)行：待細(xì)胞生長(zhǎng)至 80%～90%融合狀態(tài)，用0.25%胰蛋白酶消化，收集并制備單細(xì)胞懸液，用新鮮培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×106個(gè)/mL，將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，細(xì)胞貼壁后棄上清液，用PBS漂洗1次。設(shè)對(duì)照組、GCG處理組、ECG處理組、EGCG處理組和熊果苷處理組，每一濃度均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，加入2 mL含有不同濃度受試物的新鮮培養(yǎng)液(GCG、ECG、EGCG、熊果苷的質(zhì)量濃度均為5、10、20、40、60 μg/mL)，對(duì)照組不加藥物，以新鮮培養(yǎng)液代替，將細(xì)胞置于二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后棄上清液，用PBS洗滌，用胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞于離心管中，1 500 r/min離心10 min，棄上清液，加入1 mL含10%DMSO的1 mol/L NaOH溶液，80 ℃水浴1 h后，分別移入96孔培養(yǎng)板中，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)405 nm處各孔的光密度值，計(jì)算細(xì)胞內(nèi)黑色素的含量。黑色素相對(duì)含量=(試驗(yàn)孔OD405nm－空白孔OD405nm)/(對(duì)照組OD405nm－空白孔OD405nm)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2010 和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各處理B16 細(xì)胞的形態(tài)

傳代培養(yǎng)的B16細(xì)胞多呈梭形貼壁生長(zhǎng)。由圖1可見(jiàn)，對(duì)照組細(xì)胞分裂現(xiàn)象明顯，透明度高，細(xì)胞形態(tài)飽滿，生長(zhǎng)旺盛；分別加入不同濃度的GCG、ECG、EGCG 和熊果苷后，B16 細(xì)胞的形態(tài)均出現(xiàn)了一定程度的變化，細(xì)胞發(fā)生團(tuán)縮，細(xì)胞間界限不清晰，并且隨著濃度的增大細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，細(xì)胞生長(zhǎng)處于明顯的抑制狀態(tài)；在相同濃度下，GCG對(duì)細(xì)胞形態(tài)的變化影響最大，熊果苷的影響最小。當(dāng)GCG、ECG 和EGCG 的質(zhì)量濃度均為60 μg/mL時(shí)細(xì)胞數(shù)目顯著減少，并有部分細(xì)胞漂浮；質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，大量細(xì)胞團(tuán)縮成球形，無(wú)法貼壁生長(zhǎng)。當(dāng)熊果苷的質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)呈抑制狀態(tài)。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量的觀察結(jié)果進(jìn)行判斷，GCG、ECG 和EGCG 的質(zhì)量濃度低于60 μg/mL時(shí)，細(xì)胞能夠正常生長(zhǎng)。

圖1 各處理B16細(xì)胞的形態(tài)Fig.1 Morphology of cells B16 under different treatments

2.2 各處理B16細(xì)胞的增殖率

由表1可見(jiàn)，3種茶葉提取物和熊果苷對(duì)B16細(xì)胞的增殖均有一定抑制作用，并隨著濃度的增加抑制作用越明顯。將對(duì)照組的細(xì)胞增殖率視為100%。ECG的作用效果最明顯，在低濃度時(shí)就表現(xiàn)出了一定的抑制作用，質(zhì)量濃度為5 μg/mL時(shí)細(xì)胞增殖率比對(duì)照組降低了27.61%；當(dāng)GCG和EGCG的質(zhì)量濃度為40 μg/mL、ECG質(zhì)量濃度為60 μg/mL時(shí)，B16細(xì)胞的增殖呈明顯的抑制狀態(tài)，細(xì)胞增殖率均低于50%。與茶葉提取物相比，相同濃度熊果苷對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用不明顯，熊果苷質(zhì)量濃度為 60 μg/mL時(shí)，細(xì)胞增殖率僅比對(duì)照組降低了15.95%。可見(jiàn)，茶葉提取物可能通過(guò)抑制黑色素細(xì)胞的生長(zhǎng)來(lái)達(dá)到美白的功效。

表1 各處理B16細(xì)胞的增殖率Table 1 Proliferation rate of cells B16 under different treatments

2.3 各處理B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性

由表2可見(jiàn)，3種茶葉提取物對(duì)B16 細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性均有不同程度的抑制作用，酶活性隨受試物濃度的升高而降低，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴關(guān)系。將對(duì)照組的酪氨酸酶活性視為100%。在相同濃度下，GCG 對(duì) B16 細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的抑制效果最明顯。當(dāng)質(zhì)量濃度為60 μg/mL時(shí)，GCG、ECG和EGCG細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性比對(duì)照組分別降低了32.71%、27.27%和26.67%。相同濃度下的熊果苷對(duì)細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性有抑制作用，其作用效果不如茶葉提取物的效果明顯。據(jù)此推測(cè)，茶葉提取物可能在一定程度上通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性來(lái)達(dá)到美白的功效。

表2 各處理B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性Table 2 Tyrosinase activity of cells B16 under different treatments

2.4 各處理B16 細(xì)胞內(nèi)黑色素合成的相對(duì)量

由表3可見(jiàn)，3種茶葉提取物和熊果苷均能明顯地抑制細(xì)胞內(nèi)黑色素的生成。將對(duì)照組的黑色素生成量設(shè)為 100%。在相同濃度條件下，茶葉提取物對(duì)B16細(xì)胞內(nèi)黑色素合成的抑制效果優(yōu)于熊果苷的作用效果，3種茶葉提取物質(zhì)量濃度為10 μg/mL時(shí)，其對(duì)細(xì)胞內(nèi)黑色素生成的抑制作用均大于或相當(dāng)于熊果苷質(zhì)量濃度60 μg/mL的作用效果?？傮w來(lái)看，GCG 對(duì)黑色素生成的抑制作用效果相對(duì)較大，ECG 和EGCG 的抑制作用次之。由此推測(cè)，茶葉提取物可能通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)黑色素的生成來(lái)達(dá)到美白的效果。

表3 各處理B16 細(xì)胞內(nèi)黑色素合成的相對(duì)量Table 3 Relative quantity of melanin in cell B16 under different treatments

3 結(jié)論與討論

對(duì)茶葉提取物EGCG、GCG和ECG對(duì)B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞增殖率、細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性及黑色素生成量影響的研究結(jié)果顯示：EGCG、ECG、GCG能顯著抑制B16細(xì)胞黑色素的生成和酪氨酸酶的活性，且呈劑量依賴關(guān)系，當(dāng)其質(zhì)量濃度為60 μg/mL時(shí)，細(xì)胞增殖率均低于50%；酪氨酸酶活性分別比對(duì)照組降低了26.67%、27.27%和 32.71%；黑色素生成抑制率均在 30%以上，且GCG的作用效果最明顯，ECG的效果其次。與熊果苷相比較，相同濃度條件下茶葉提取物對(duì)黑色素的抑制作用更明顯。低濃度條件下茶葉提取物對(duì)B16細(xì)胞幾乎不存在細(xì)胞毒性，對(duì)黑色素生成的抑制作用與較高濃度熊果苷的抑制作用相當(dāng)，表明茶葉提取物EGCG、GCG、ECG對(duì)黑色素的抑制作用優(yōu)于已被普遍認(rèn)可的美白添加劑熊果苷的抑制作用。

茶葉中的主要成分是兒茶素類物質(zhì)。兒茶素能有效清除人體自由基，抑制過(guò)氧化物，起到祛斑、防曬及抗皮膚色素沉著的作用[16]。本研究中，茶葉提取物EGCG、GCG和ECG對(duì)B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞增殖率、細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性以及黑色素的生成量均有一定的抑制作用，表明EGCG、GCG和ECG通過(guò)影響B(tài)16細(xì)胞的正常形態(tài)、抑制細(xì)胞增殖、抑制酪氨酸酶活性以及降低黑色素生成量等多途徑發(fā)揮美白功效。

綠茶提取物是一種強(qiáng)烈的酪氨酸酶抑制劑，主要活性成分為GCG、ECG和EGCG。沒(méi)食子?；沁@ 3個(gè)兒茶素單體的活性位點(diǎn)[17]。GCG是酪氨酸酶競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑[18]。本研究中，GCG對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用優(yōu)于EGCG的作用，推測(cè)GCG沒(méi)食子酸基團(tuán)的反式結(jié)構(gòu)可能有利于其美白功效的發(fā)揮。

對(duì)于生產(chǎn)企業(yè)來(lái)說(shuō)，添加茶葉提取物的成本比添加熊果苷的生產(chǎn)成本低，因此，茶葉提取物EGCG、GCG和ECG是一種理想的美白添加劑。

[1] 程樹(shù)軍，步犁，潘芳．基于黑色素形成機(jī)制的美白化妝品功效體外檢測(cè)方法[J]．中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2012(3)：259-262．

[2] 步犁，程樹(shù)軍，馬來(lái)記．黑色素形成分子調(diào)控及美白劑功效評(píng)價(jià)方法[J]．華南國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志，2012，26(4)：395-398．DOI：10.3969/j.issn.1009-2595.2012.04.037．

[3] 王白強(qiáng)．皮膚黑素成因分析與美白祛斑功效評(píng)價(jià)體系的研究[J]．化學(xué)工程與裝備，2008(2)：14-18．DOI：10.3969/j.issn.1003-0735.2008.02.005．

[4] 王穎異，郭寶林，張立軍．具美白祛斑活性植物成分的研究進(jìn)展[J]．中草藥，2009，40(11)：5-9．DOI：10.3321/j.issn：0253-2670.2009.11.051．

[5] CHANG T S，CHIA-HSIANG LIN V．Melanogenesis inhibitory activity of two generic drugs：cinnarizine and trazodone in mouse B16 melanoma cells[J]. International Journal of Molecular Sciences，2011(12)：8787-8796，DOI：10.3390/ijms12128787．

[6] JAE Kyung NO，DO YU SOUNG，YOU JUNG Kim，et al．Inhibition of tyrosinase by green tea components[J].Life Sciences，1999，65(21)：241-246．

[7] 吳曉慧，周潔，王崢，等．美白祛斑化妝品的功效評(píng)價(jià)與展望[J]．香料香精化妝品，2007(3)：33-36．DOI：10.3969/j.issn.1000-4475.2007.03.009．

[8] 劉錦梅，王艷麗，潘維．4種茶葉醇提物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用[J]．現(xiàn)代食品科技，2009，25(6)：610-611，616．DOI：10.3969/j.issn.1673-9078.2009.06.009．

[9] 陳貞純，賈玲燕，毛祖法，等．茶葉提取物對(duì)B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)及機(jī)理研究[J]．茶葉科學(xué)，2014，34(5)：465-472．DOI：10.3969/j.issn.1000-369X.2014.05.007．

[10] 曾亮，馬夢(mèng)君，官興麗，等．茶葉提取物EGCG對(duì)B16小鼠黑素瘤細(xì)胞的影響[J]．西南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2014，36(2)：171-177．

[11] 張瑋，高靜，張敏，等．7種美白化合物對(duì)皮膚黑素細(xì)胞的體外生物學(xué)效應(yīng)[J]．藥學(xué)實(shí)踐雜志，2011，29(1)：24-26，40．DOI：10.3969/j.issn.1006-0111.2011.01.008．

[12] MALLICK S，SINGH S K，SARKAR C，et al，Human placental lipid induces melanogenesis by increasing the expression of tyrosinase and its related proteins in vitro[J]．Pigment Cell Res，2005，18(1)：25-33．DOI：10.1111/j.1600-0749.2004.00193.x．

[13] 程?hào)|慶，尉曉冬，王遂泉．復(fù)方中藥對(duì)小鼠B-16黑素瘤細(xì)胞株黑素合成和酪氨酸酶的激活作用[J]．中華皮膚科雜志，2000，33(3)：173．DOI：10.3760/j.issn：0412-4030.2000.03.011．

[14] 宋康康．抑制劑對(duì)酪氨酸酶的效應(yīng)及其對(duì)黑色素生成調(diào)控的研究[D]．廈門(mén)：廈門(mén)大學(xué)，2007．10.7666/d.y1345379．

[15] AOKI Y，TANIGAWA T，ABE H，et al．Melanogenesis inhibition by an oolong tea extract in b16 mouse melanoma cells and UV-induced skin pigmentation in brownish guinea pigs[J]．Biosci Biotechnol Biochem，2007，71(8)：1879-1885．DOI：10.1271/bbb.70099．

[16] 劉超，陳若蕓．兒茶素及其類似物的化學(xué)和生物活性研究進(jìn)展[J]．中國(guó)中藥雜志，2004，29(10)：1017-1021.DOI：10.3321/j.issn：1001-5302.2004.10.036．

[17] NO J K，SOUNG D Y，KIM Y J，et al，Inhibition of tyrosinase by green tea components[J]．Life Sci，1999，65(21)：241-246．DOI：10.1016/s0024-3205(99)00492-0．

[18] 官興麗，羅理勇，曾亮．天然產(chǎn)物的美白作用及其機(jī)理研究進(jìn)展[J]．食品工業(yè)科技，2011，32(5)：432-435，439．

責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫(kù)

Inhibitory effects of tea extracts EGCG，GCG and ECG on the melanogenesis in melanoma cell B16

ZHANG Xiangna1,2,3，LIN Yong1,2,3*，HUANG Jianan1,2,3*，LIU Zhonghua1,2,3，LIANG Dandan3
(1.National Research Center of Plant Functional Composition Utilization, Changsha 410128, China; 2.Hunan Co-Innovation Center for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China; 3.College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

Inhibitory effects of tea extracts EGCG, GCG and ECG on melanoma cell B16 from mouse were studied in this paper. Cells were treated with different concentrations of GCG, ECG, EGCG and Arbutin, and their morphology was observed in an inverted microscope. The proliferation rate of B16 was determined using MTT method, tyrosinase activity was detected by using L-DOPA as substrate, and NaOH-lysis approach was employed to measure the melanin synthesis.The results showed that EGCG, ECG, GCG could significantly inhibit the melanogenesis and tyrosinase activity in cells B16 with a dose-dependent manner. The proliferation rate would be lower than 50% when the concentration was increased to 60 μg/mL. Compared with the control group, tyrosinase activities affected by the three substances were reduced by 26.67%, 27.27% and 32.71%, respectively, the melanin inhibition rates were all above 30%. In conclusion, tea extracts could efficiently inhibit melanogenesis. The inhibitory effect of GCG was best, followed by ECG, EGCG, and arbutin in turn.

tea extracts; epigallocatechin gallate (EGCG); galllocatechingallate(GCG); epicatechingallate(ECG); B16melanoma cell; melanogenesis; tyrosinase

Q946.84+1

A

1007-1032(2017)04-0405-06

2016-08-16

2017-05-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31100502)；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-23)

張向娜(1991—)，女，河南洛陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事茶葉加工及功能成分化學(xué)研究；*通信作者，黃建安，教授，主要從事茶葉審評(píng)與品質(zhì)化學(xué)研究，jian7513@sina.com；*通信作者，林勇，副教授，主要從事茶葉功能成分化學(xué)研究，ly2005306@163.com。