絲氨酸對(duì)葡萄酒釀造過(guò)程中釀酒酵母產(chǎn)H2S的形成研究

張玉潔，李瑩，秦義，2，宋育陽(yáng)，2，劉延琳，2*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西楊凌712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌712100）

絲氨酸對(duì)葡萄酒釀造過(guò)程中釀酒酵母產(chǎn)H2S的形成研究

張玉潔1，李瑩1，秦義1，2，宋育陽(yáng)1，2，劉延琳1，2*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西楊凌712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌712100）

為探究絲氨酸對(duì)葡萄酒釀造過(guò)程中釀酒酵母產(chǎn)H2S的影響，以自主篩選的本土釀酒酵母32y12為研究對(duì)象，分別在正常氮源（300 mg N/L）和低濃度氮源（150 mg N/L）條件下，比較了外源絲氨酸的添加對(duì)釀酒酵母32y12發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)H2S的影響。結(jié)果顯示，相對(duì)于正常氮源水平，低氮條件下外源添加140.8 mg/L（5倍）和281.5 mg/L（10倍）絲氨酸時(shí)，H2S釋放量顯著增加，分別達(dá)到573.1 μL/L和798.6 μL/L。為了進(jìn)一步研究酵母自身絲氨酸合成對(duì)H2S產(chǎn)生的影響，借助Cre-Loxp系統(tǒng)敲除了絲氨酸合成關(guān)鍵基因SER33，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同氮源水平下，基因SER33的敲除均顯著降低H2S產(chǎn)量（P＜0.05），并且外源添加不同濃度絲氨酸也并不會(huì)顯著增加基因SER33敲除菌株的H2S釋放量（P＞0.05）。該結(jié)果為工業(yè)生產(chǎn)中針對(duì)低氮葡萄原料選擇發(fā)酵助劑提供了理論支持。

釀酒酵母；絲氨酸；硫化氫；基因敲除；氮源

在葡萄酒釀造過(guò)程中，由酵母代謝產(chǎn)生的香氣物質(zhì)是影響葡萄酒質(zhì)量及感官的重要因素之一。其中，葡萄酒中的揮發(fā)性硫化物以其強(qiáng)揮發(fā)性、低閾值而受到廣泛關(guān)注[1]。揮發(fā)性硫化物主要分為兩類：一類為揮發(fā)性硫醇，大部分揮發(fā)性硫醇具有不良?xì)馕?，少部分具有熱帶水果及黃楊木的味感[2]，和葡萄柚與熱帶水果的香氣[3-4]；另一類為具有較強(qiáng)的揮發(fā)性、給葡萄酒帶來(lái)臭雞蛋味的硫化氫（H2S），該物質(zhì)不僅具有較低的嗅覺(jué)閾值（50～80 μg/L），并且其不良?xì)馕逗茈y被掩蓋[5]。

有研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，葡萄酒中H2S的主要來(lái)源是發(fā)酵過(guò)程中釀酒酵母代謝產(chǎn)生的。在釀酒酵母硫代謝途徑中，S2-合成與消耗速率決定了釀酒酵母H2S產(chǎn)生量。若S2-能夠與來(lái)源于氮代謝的O-乙酰高絲氨酸完全結(jié)合，則S2-會(huì)合成酵母正常生長(zhǎng)所需要的含硫氨基酸（如甲硫氨酸、半胱氨酸等），否則將以H2S形式釋放。因此，氮源是影響酵母H2S產(chǎn)生的重要因素之一[8]。

葡萄汁中的總氮含量與H2S的產(chǎn)量之間存在負(fù)相關(guān)性[9]。在葡萄酒釀造過(guò)程中，常會(huì)采用補(bǔ)充足量的可同化氮源，以確保足夠的氨基酸前體物質(zhì)，來(lái)限制H2S的形成[10-11]。但是過(guò)高的可同化氮會(huì)產(chǎn)生有害物質(zhì)，如氨基甲酸乙酯、生物胺等，同時(shí)也會(huì)促進(jìn)有害微生物的生長(zhǎng)。因此，為避免過(guò)高氮源的添加對(duì)葡萄酒釀造的風(fēng)險(xiǎn)，探究不同氮源種類對(duì)H2S的釋放具有實(shí)際意義。盡管目前已有報(bào)道[12]，添加谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸等不同氨基酸會(huì)造成菌株H2S產(chǎn)量的顯著差異，但是作為參與硫代謝下游途徑的關(guān)鍵物質(zhì)的絲氨酸，對(duì)釀酒酵母產(chǎn)H2S特性的相關(guān)研究仍缺乏。

基于以上分析，為探究絲氨酸與H2S產(chǎn)生的關(guān)系，以本課題組篩選的野生二倍體釀酒酵母（Saccharomyces cereviviae）32y12為研究對(duì)象，分別比較在正常氮源（300mg N/L）和低濃度氮源（150 mg N/L）條件下，添加不同濃度絲氨酸對(duì)釀酒酵母產(chǎn)H2S的影響；此外，通過(guò)敲除絲氨酸合成途徑關(guān)鍵基因SER33，弱化釀酒酵母絲氨酸合成能力，進(jìn)一步探究絲氨酸與H2S合成的關(guān)系，研究結(jié)果將為葡萄酒釀造中降低H2S產(chǎn)量提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株和質(zhì)粒

釀酒酵母（Saccharomycescereviviae）32y12、質(zhì)粒pUG6、質(zhì)粒pSH65：本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 引物

脫氧核糖核酸（deoxyribose nucleic acid，DNA）測(cè)序和合成由上海生工完成，本實(shí)驗(yàn)所用引物見(jiàn)表1。

表1 敲除菌株的構(gòu)建及驗(yàn)證引物Table 1 Establishment of knockout strains and primers validation

1.1.3 主要試劑

DNA聚合酶、SD-UraDOSupplement：TAKARA（大連）有限公司；葡萄糖、果糖、肌醇、麥角固醇、L-精氨酸、L-脯氨酸、DL-色氨酸等氨基酸（純度均＞99%）、無(wú)氨基酵母氮源（yeast nitrogen base，YNB）：北京索萊寶科技有限公司；L-（+）酒石酸、L-（-）蘋果酸、檸檬酸（純度均＞99%）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；半乳糖、水解酪蛋白（純度均＞99%）：美國(guó)Sigma公司；蛋白胨、酵母浸粉、Tween-80、無(wú)水氯化鈣、磷酸銨、氫氧化鉀等為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，固體YPD培養(yǎng)基添加2%瓊脂粉。

YPD-遺傳霉素（geneticin）G418培養(yǎng)基：在YPD培養(yǎng)基中添加G418至終質(zhì)量濃度為300 mg/L，固體YPD-G418培養(yǎng)基添加2%瓊脂粉。

酵母浸出粉胨半乳糖（yeast extract peptone galactose，YPG）培養(yǎng)基：半乳糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，固體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂粉。

酵母缺陷型培養(yǎng)基（SD-Ura）：葡萄糖20 g/L，無(wú)氨基酵母氮源YNB1.7g/L，SD-Uradosupplement0.77g/L，pH6.8。

Triple M培養(yǎng)基：參照SPIROPOULOS A等[6]的配方。

TripleM培養(yǎng)基中不同氨基酸含量參考BELTRANB等[13]研究進(jìn)行調(diào)整。Triple M培養(yǎng)基的正常氮源（包括120 mg N/L的無(wú)機(jī)銨鹽與180 mg N/L的混合氨基酸）質(zhì)量濃度為300 mg N/L時(shí)，Triple M培養(yǎng)基中絲氨酸濃度（將該濃度設(shè)為1倍）為56.3 mg/L（7.5 mg N/L），因此0倍、5倍和10倍絲氨酸的添加分別為0、281.5 mg/L（37.5 mg N/L）及562.9 mg/L（75 mg N/L）。Triple M培養(yǎng)基的低氮源質(zhì)量濃度為150 mg N/L（包括60 mg N/L的無(wú)機(jī)銨鹽與90 mg N/L的混合氨基酸），此時(shí)Triple M培養(yǎng)基中絲氨酸質(zhì)量濃度（將該濃度設(shè)為1倍）為28.2 mg/L（3.8 mg N/L），因此0倍、5倍和10倍絲氨酸的添加分別0、140.8 mg/L（18.8 mg N/L）及281.5 mg/L（37.5 mg N/L）。

1.2 儀器與設(shè)備

MJPS-250型恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏儀器有限公司；ZWY2102全溫?fù)u床：上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；FRESC017高速冷凍離心機(jī)、ND 1000微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)Thermo公司；DYY-10C電泳儀：北京市六一儀器廠；C1000 PCR儀：美國(guó)Bio-Rad公司；GBOX-EF凝膠成像系統(tǒng)：印度Syngene公司；SS325高壓蒸汽滅菌鍋：日本Tomy公司；Cary60紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)安捷倫公司；YBL10-71103血球計(jì)數(shù)板：上海求精生化試劑儀器有限公司；H2S檢測(cè)管：上海豫東電子科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 釀酒酵母的發(fā)酵特性及H2S表型檢測(cè)

采用正常質(zhì)量濃度氮源（300 mg N/L）和低質(zhì)量濃度氮源（150 mg N/L）Triple M培養(yǎng)基發(fā)酵，并按比例分別添加0倍、281.5 mg/L（5倍）和562.9 mg/L（10倍）絲氨酸進(jìn)行模擬發(fā)酵。發(fā)酵體積為300 mL，發(fā)酵溫度為20℃，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min。酵母菌的接種量為5×105CFU/mL（利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)對(duì)數(shù)期培養(yǎng)的菌株以控制接種量），每株酵母菌進(jìn)行3個(gè)平行發(fā)酵。發(fā)酵每24 h稱量發(fā)酵損失質(zhì)量，監(jiān)測(cè)CO2質(zhì)量損失，以未接菌的發(fā)酵瓶為對(duì)照，直到連續(xù)兩次質(zhì)量損失不變，此時(shí)認(rèn)為發(fā)酵中止。硫化氫的檢測(cè)使用H2S檢測(cè)管，單位以μL/L計(jì)，每8 h檢測(cè)一次H2S產(chǎn)量。裝置參考王春曉等[14]方法，將H2S檢測(cè)管用橡膠管連接于球形彎管上，每次取樣時(shí)讀取H2S檢測(cè)管上的變色刻度即為H2S的產(chǎn)生量，當(dāng)檢測(cè)管變色刻度接近最大量程時(shí)更換新的檢測(cè)管。

1.3.2 野生二倍體酵母SER33敲除菌株構(gòu)建

利用Cre-Loxp基因編輯系統(tǒng)，首先構(gòu)建SER33第一次敲除框：在基因SER33的讀碼框外設(shè)計(jì)45 bp同源臂與pUG6中的Loxp-KanMX-Loxp引物融合后對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增得到（引物為SER33-D1-F/R，DNA聚合酶為PrimeSTAR HS DNA Polymerase高保真酶，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）條件按照TAKARA官網(wǎng)中該酶的使用建議，并將退火溫度調(diào)整為59℃，后續(xù)PCR均按照此方法）；第二次敲除框在基因SER33的讀碼框內(nèi)設(shè)計(jì)45 bp同源臂，并按照第一次設(shè)計(jì)原理進(jìn)行敲除框的擴(kuò)增；將兩次PCR產(chǎn)物純化后測(cè)序保存在-20℃待轉(zhuǎn)化。

采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[15]，將第一次敲除框轉(zhuǎn)入32y12 Δura3，利用YPD培養(yǎng)基復(fù)蘇24h，而后涂布于添加了300mg N/L YPD-G418培養(yǎng)皿上，30℃培養(yǎng)48 h，挑取轉(zhuǎn)化子，用驗(yàn)證引物（SER33-A-F、SER33-KanB-R、SER33-KanC-F、SER33-D-R，分別位于SER33讀碼框上游、KanMX中前、KanMX中后及SER33讀碼框下游）進(jìn)行PCR驗(yàn)證，得到轉(zhuǎn)化子。將pSH65質(zhì)粒轉(zhuǎn)入上一步得到的轉(zhuǎn)化子，利用YPG培養(yǎng)基復(fù)蘇24 h后涂布于YPG平板，30℃培養(yǎng)48 h后影印于YPD-G418平板。隨后30℃靜置培養(yǎng)24 h，挑取在影印培養(yǎng)皿上不能生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

采用同樣的方法將第二次敲除框轉(zhuǎn)入并經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證最終得到二次敲除的菌株，轉(zhuǎn)入pSH65質(zhì)粒切除KanMX標(biāo)記得到32y12的SER33基因敲除菌株。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，方差分析采用Duncan檢驗(yàn)法，每組實(shí)驗(yàn)3組重復(fù)，Origin8.0用于繪制發(fā)酵曲線等。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源添加絲氨酸對(duì)S.cereviviae32y12產(chǎn)H2S量的影響

為了探究外源絲氨酸的添加（0倍、5倍、10倍）是否會(huì)影響菌株的生長(zhǎng)及硫化氫產(chǎn)生，分別在正常質(zhì)量濃度氮源（300 mg N/L）和低質(zhì)量濃度氮源（150 mg N/L）的Triple M模擬汁中進(jìn)行發(fā)酵，在不同氮源條件下的發(fā)酵特性及H2S釋放量，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1A可知，在正常氮源（300mgN/L）條件下，添加不同質(zhì)量濃度的絲氨酸，并不會(huì)改變S.cereviviae 32y12的CO2釋放量；而在低質(zhì)量濃度氮源（150 mg N/L）條件下，雖然添加不同質(zhì)量濃度絲氨酸沒(méi)有顯著改變菌株的發(fā)酵速率（CO2釋放量分別達(dá)到27.5g、27.6g、26.5 g），但是相比于正常氮源（300 mg N/L），S.cereviviae32y12的發(fā)酵速率均減緩，且結(jié)束發(fā)酵時(shí)間均延長(zhǎng)至240 h，較正常濃度氮源下的發(fā)酵時(shí)間多48 h。

由圖1B可知，在正常氮源（300mgN/L）條件下，外源添加絲氨酸不會(huì)顯著增加H2S的釋放，尤其當(dāng)外源絲氨酸添加至10倍時(shí)，S.cereviviae32y12的H2S釋放與未添加絲氨酸沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。而在低濃度氮源下（150mgN/L）未添加絲氨酸時(shí)，H2S釋放379.8 μL/L，而當(dāng)添加5倍和10倍絲氨酸時(shí)，S.cereviviae32y12的H2S釋放顯著增加（P＜0.05），分別達(dá)到573.1 μL/L和798.6 μL/L。由此說(shuō)明，低氮條件下外源添加絲氨酸能夠增加H2S的釋放。該結(jié)果為工業(yè)生產(chǎn)中針對(duì)低氮原料選擇發(fā)酵助劑提供了試驗(yàn)依據(jù)，即發(fā)酵醪中氮源水平較低時(shí)，盡量避免外源添加絲氨酸，從而防止葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生較高的H2S。

圖1 不同濃度氮源下釀酒酵母32y12的CO2(A)及H2S(B)釋放量Fig.1 Release amount of CO2(A)and H2S(B)ofS.cerevisiae 32y12 under different concentration of nitrogen source

2.2 基因SER33缺陷菌株的構(gòu)建及發(fā)酵特性

為降低絲氨酸在葡萄酒釀造過(guò)程中（尤其是低氮條件下）對(duì)酵母H2S產(chǎn)生的影響，以S.cereviviae32y12為基礎(chǔ)，采用Cre-Loxp基因編輯系統(tǒng)來(lái)構(gòu)建基因SER33缺陷菌株，降低細(xì)胞合成絲氨酸的能力，從而探究釀酒酵母自身合成的絲氨酸與H2S合成的關(guān)系。

2.2.1 第一個(gè)及第二個(gè)SER33同源基因的敲除

以SER33-D1-F/SER33-D1-R為引物，pUG6為模板，擴(kuò)增得到長(zhǎng)度約為1 800 bp的SER33第一次敲除組件。將經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證的敲除組件轉(zhuǎn)入32y12中，篩選并挑取轉(zhuǎn)化子，分別用SER33-A-F/SER33-D-R、SER33-A-F/SER33-KanB-R、SER33-KanC-F/SER33-D-R對(duì)轉(zhuǎn)化子S1-1驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 基因SER33敲除菌株P(guān)CR驗(yàn)證結(jié)果Fig.2 PCR verification results of geneSER33knockout strains

由圖2可知，采用SER33讀碼框上游引物SER33-A-F/ SER33-D-R，分別對(duì)32y12和轉(zhuǎn)化子S1-1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)照32y12的條帶約為1 800 bp（泳道1），而轉(zhuǎn)化子S1-1得到的片段應(yīng)為兩條1 948 bp和1 760 bp（泳道4），其中1 948 bp大小片段經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證為loxP-KanMX-loxP片段，表明S1-1基因組中一個(gè)SER33同源基因被成功替換；采用SER33-A-F/ SER33-KanB-R、SER33-KanC-F/SER33-D-R進(jìn)一步對(duì)對(duì)照菌株和轉(zhuǎn)化菌株P(guān)CR，驗(yàn)證loxP-KanMX-loxP片段成功插入SER33位點(diǎn)，對(duì)照菌株無(wú)KanMX插入（泳道2，3），而S1-1得到兩條帶351 bp和730 bp（泳道5，6），符合預(yù)期結(jié)果；上述結(jié)果證實(shí)loxP-KanMX-loxP成功替換了32y12基因組中的一個(gè)SER33同源基因。

將pSH65轉(zhuǎn)化入S1-1，同時(shí)利用半乳糖誘導(dǎo)Cre酶表達(dá)，從而切除loxP-KanMX-loxP中的KanMX基因，獲得重組菌株S1-2。采用SER33-A-F/SER33-D-R（泳道7）、SER33-A-F/ SER33-KanB-R（泳道8）、SER33-KanC-F/SER33-D-R（泳道9）三對(duì)引物分別進(jìn)行PCR驗(yàn)證。泳道7為兩條帶，分別為切除KanMX片段和SER33未敲除片段。而泳道8，9中沒(méi)有條帶也進(jìn)一步證明KanMX在基因組中已丟失，從而獲得敲除一個(gè)SER33等位基因的菌株S1-2。

為避免第二次重組發(fā)生在第一次重組位點(diǎn)，SER33的二次敲除組件的同源臂設(shè)計(jì)在SER33的開放讀碼框內(nèi)部。采用SER33-D2-F/SER33-D2-R擴(kuò)增得到二次敲除組件，轉(zhuǎn)化于S1-2，在YPD-G418平板上篩選轉(zhuǎn)化子，并采用SER33-A-F/ SER33-D-R、SER33-A-F/SER33-KanB-R、SER33-KanC-F/ SER33-D-R分別驗(yàn)證。泳道10得到兩條片段約為2 000 bp和400 bp，說(shuō)明第二次敲除組件發(fā)生重組。以SER33-A-F/ SER33-KanB-R（泳道11）、SER33-KanC-F/SER33-D-R（泳道12）為引物的PCR得到對(duì)應(yīng)KanMX大小，表明敲除組件重組位置正確，獲得重組菌株S2-1。最后，轉(zhuǎn)入pSH65，切除G418抗性標(biāo)記，最終得到基因組上SER33被完全敲除的菌株S2-2。經(jīng)SER33-A-F/SER33-D-R驗(yàn)證，得到約為400 bp，500bp兩條帶（泳道13），無(wú)KanMX驗(yàn)證條帶（泳道14，15），從而獲得S.cereviviae32y12的SER33雙缺失菌株32y12Δser33。2.2.2SER33敲除菌株的模擬發(fā)酵和產(chǎn)H2S特征

為了探究SER33敲除菌株的發(fā)酵特性和產(chǎn)H2S表型，利用1.3節(jié)中的方法進(jìn)行Triple M模擬汁發(fā)酵，SER33缺陷菌株在不同生長(zhǎng)時(shí)期的H2S釋放量及發(fā)酵特性結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，SER33敲除菌株的生長(zhǎng)速率受到抑制，敲除菌株在480 h后發(fā)酵仍在繼續(xù)，且CO2的質(zhì)量損失僅達(dá)到20 g，顯著低于原始菌株S.cereviviae32y12（25 g）。對(duì)于產(chǎn)H2S特性，SER33敲除菌株在48 h產(chǎn)生H2S，96 h內(nèi)變化最大，約為27 μL/L，120 h后停止產(chǎn)生，最終產(chǎn)量約為65 μL/L，顯著低于S.cereviviae32y12的H2S釋放量（P＜0.05）。

圖3 基因SER33敲除菌株模擬發(fā)酵H2S釋放量及發(fā)酵特征Fig.3 H2S release amount and fermentation characteristic of geneSER33knockout strains stimulated fermentation

2.3 外源添加絲氨酸對(duì)SER33敲除菌株H2S產(chǎn)量的影響

盡管破壞釀酒酵母絲氨酸合成途徑能夠顯著降低其H2S釋放，但是外源添加絲氨酸是否會(huì)補(bǔ)償SER33敲除對(duì)H2S釋放的影響仍不清楚。采用2.1的方法，在正常氮源（300 mg N/L）和低濃度氮源（150 mg N/L）的Triple M培養(yǎng)條件下進(jìn)行模擬汁發(fā)酵，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，在正常的Triple M發(fā)酵條件下，絲氨酸的添加濃度不會(huì)顯著增加SER33敲除菌株的H2S釋放量，該結(jié)果與2.1中S.cereviviae 32y12菌株一致。而與正常氮源相比，在低質(zhì)量濃度氮源下（150 mg N/L）雖然SER33敲除菌株的H2S釋放量顯著增高，但是與不添加絲氨酸相比較，添加5倍和10倍濃度絲氨酸不會(huì)顯著增加SER33敲除菌株的H2S釋放（P＞0.05），這與出發(fā)菌株S.cereviviae32y12顯著不同（P＜0.05）。

圖4 不同濃度氮源下基因SER33敲除菌株的H2S釋放量Fig.4 H2S release amount of geneSER33knockout strains under different concentration of nitrogen source

3 結(jié)論

本研究以S.cereviviae32y12為研究對(duì)象，分別在正常氮源（300 mg N/L）和低濃度氮源（150 mg N/L）條件下，比較了絲氨酸對(duì)S.cereviviae32y12發(fā)酵過(guò)程中H2S產(chǎn)生的影響。其中，相比于正常氮源水平，低氮條件下添加外源絲氨酸（5、10倍）顯著增加了H2S的釋放（573.1μL/L和798.6μL/L）。此外，為了研究酵母自身絲氨酸合成對(duì)H2S產(chǎn)生的影響，本研究敲除了S.cereviviae32y12的SER33基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)盡管敲除SER33能夠破壞絲氨酸合成途徑，并顯著降低H2S產(chǎn)量至65 μL/L，但是與出發(fā)菌株S.cereviviae32y12不同的是，低濃度氮源下，添加不同濃度絲氨酸并不會(huì)顯著增加SER33敲除菌株的H2S釋放量（P＞0.05）。該結(jié)果為葡萄酒釀造過(guò)程中不同氮源條件下發(fā)酵助劑的選擇提供了依據(jù)。

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Effect of serine on the H2S formation during wine fermentation ofSaccharomyces cerevisiae

ZHANG Yujie1,LI Ying1,QIN Yi1,2,SONG Yuyang1,2,LIU Yanlin1,2*
(1.College of Enology,Northwest A&F University,Yangling 712100,China; 2.Shaanxi Engineering Research Center for Wine and Viticulture,Yangling 712100,China)

In order to investigate the effect of serine on H2S production inSaccharomyces cerevisiaeduring wine brewing process,using the native S.cerevisiae32y12 screened independently as research object,under the normal nitrogen source(300 mg N/L)and low concentration nitrogen source (150 mg N/L),the effect of adding exogenous serine onS.cerevisiae32y12 producing H2S during fermentation was compared.The results showed that compared with the normal nitrogen source,under low nitrogen concentration,adding exogenous serine could significantly increase H2S production, which could achieve 573.1 μl/L and 798.6 μl/L in adding serine 140.8 mg/L(5 times)and 281.5 mg/L(10 times),respectively.For further research the effect of yeast synthesis serine on H2S production,the key geneSER33of serine synthesis was knocked by Cre-Loxp system.Results showed that under different levels of nitrogen,the knockout of geneSER33decreased H2S production significantly(P＜0.05),and the adding different concentrations of serine could not increase H2S production of strains knocked geneSER33significantly(P＞0.05),which provided the theoretical support for fermentation agent selection of grape raw materials with low concentration nitrogen in industrial production.

Saccharomyces cerevisiae;serine;hydrogen sulfide;gene deletion;nitrogen source

TS261

0254-5071（2017）06-0121-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.025

2017-04-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31571812）；國(guó)家葡萄產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-30-jg-3）

張玉潔（1991-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)獒劸莆⑸铩?/p>

*通訊作者：劉延琳（1966-），女，教授，博士，研究方向?yàn)槠咸丫萍搬劸莆⑸铩?/p>