丹參酮ⅡA對缺血再灌注損傷大鼠心肌組織和心律失常的保護作用

李 濤 袁春桃

(邵陽學院教務處，湖南 邵陽 422000)

丹參酮ⅡA對缺血再灌注損傷大鼠心肌組織和心律失常的保護作用

李 濤 袁春桃1

(邵陽學院教務處，湖南 邵陽 422000)

目的 探討丹參酮ⅡA對缺血再灌注損傷大鼠心肌組織和心律失常的保護作用。方法 健康Wistar大鼠30只，采用隨機數(shù)字表法分為5組，假手術組、模型組、丹參酮ⅡA高劑量(20 mg·kg-1·d-1)、中劑量(10 mg·kg-1·d-1)、低劑量組(5 mg·kg-1·d-1)，假手術組和模型組給予生理鹽水，高、中、低劑量3組分別給予相應藥物灌胃7 d，末次給藥2 h后，除假手術組外均進行心肌缺血的造模，記錄各組大鼠的心律失常評分、T波變化及心肌組織缺血修飾白蛋白(IMA)、心型脂肪酸結合蛋白(H-FBAP)及心肌細胞凋亡相關基因蛋白的表達情況。結果 5組實驗大鼠的IMA、H-FABP、Bcl-2 OD值、Bax OD值、Bcl-2/Bax值差異均顯著(P<0.05)；假手術組、丹參酮ⅡA高劑量組、丹參酮ⅡA中劑量組的IMA顯著低于模型組(P<0.05),假手術組、丹參酮ⅡA高劑量組H-FABP顯著高于模型組(P<0.05)，假手術組、丹參酮ⅡA高劑量組、丹參酮ⅡA中劑量組、丹參酮ⅡA低劑量組Bcl-2 OD值、Bax OD值、Bcl-2/Bax值均顯著高于或低于模型組。5組實驗大鼠的心律失常評分、缺血再灌注T波變化幅度差異顯著(P<0.05)；模型組大鼠的心律失常評分〔(4.28±1.06)分〕，顯著低于假手術組、丹參酮ⅡA高劑量組和丹參酮ⅡA中劑量組(P<0.05)；模型組缺血再灌注T波變化幅度(0.447±0.027)mv顯著高于假手術組、丹參酮ⅡA高劑量組、丹參酮ⅡA中劑量組和丹參酮ⅡA低劑量組(P<0.05)。結論 丹參酮ⅡA對缺血再灌注損傷大鼠心肌組織和心律失常具有保護作用，其作用機制可能與抑制IMA、Bax蛋白升高、H-FBAP及Bcl-2蛋白降低有關。

丹參酮ⅡA；缺血再灌注損傷；心肌組織；心律失常

發(fā)生缺血性心臟病后，盡早恢復心肌供血是減輕損傷的基本措施，但缺血后再灌注可對心肌造成損傷，甚至引發(fā)心律失常，是心肌梗死患者早期死亡的主要原因〔1〕。自心肌缺血再灌注損傷的概念首次被提出后〔2〕，對損傷的發(fā)生機制及預防、治療措施的探索一直受醫(yī)學界重視。近年來，中藥在抗心律失常方面的研究取得了很大的進展，其中以中藥丹參為主要成分的丹參片、復方丹參滴丸等藥物一直位列一線藥物。本文觀察丹參酮ⅡA對缺血再灌注大鼠心律失常評分、T波變化及心肌組織缺血修飾白蛋白(IMA)、心型脂肪酸結合蛋白(H-FBAP)表達情況的影響，探討丹參酮ⅡA 減輕缺血再灌注心律失常的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物級分組 健康雄性Wistar大鼠30只，體重250～300 g，平均(273±13.6) g；采用隨機數(shù)字表法分為5組，假手術組、模型組、丹參酮ⅡA高劑量(20 mg·kg-1·d-1)、中劑量(10 mg·kg-1·d-1)、低劑量組(5 mg·kg-1·d-1)。

1.2 造模及給藥方法 5組大鼠于實驗前7 d開始進行適應性喂養(yǎng)，假手術組和模型組給予生理鹽水，丹參酮ⅡA高、中、低劑量分別按20、10、5 mg·kg-1·d-1標準灌胃7 d，末次給藥4 h后，除假手術組不采取冠脈結扎外，其余4組大鼠結扎冠狀動脈左前降支15 min后松開使再灌注30 min制備模型。

1.3 儀器與試劑 LD4-2型離心機(北京醫(yī)用離心機廠),江灣Ⅰ型微型人工呼吸機,ZS83-1型內切式組織勻漿器(浙西機械廠)，XD-30C三道心電圖機(上海醫(yī)用電子儀器廠)，ERM-4000石蠟切片機，徠卡EG1150組織包埋機，Olympus光學顯微鏡，RM6240B 型多通道生物信號采集處理系統(tǒng)，DHC-1020電熱恒溫水槽，梅特勒AB104-S型萬分之一電子天平，心肌組織IMA、H-FABP試劑盒，Bcl-2蛋白抗體，Bax蛋白抗體(美國ADL公司)，DAB顯色試劑盒。

1.4 指標檢測方法 實驗結束后取大鼠左心室心肌，經(jīng)預冷的生理鹽水洗滌后-80℃保存?zhèn)溆?，檢測時取0.2 g心肌組織剪碎后加入4倍體積的裂解液，勻漿提取心肌組織總蛋白，然后轉入EP管，4℃靜置0.5 h，12 000 r/min、4℃離心 30 min，取上清按Bradford法進行蛋白質定量，IMA、H-FABP水平定量檢測采用雙抗體兩步夾心ELISA法,IMA檢測靈敏度為1.0 mg/ml，H-FABP檢測靈敏度為0.01 ng/ml。

1.5 左心室心肌組織Bcl-2和Bax蛋白檢測 再灌注2 h結束后，迅速取下左冠狀動脈降支支配的左心室心肌，放置于10%甲醛溶液中進行固定24 h之后行常規(guī)石蠟包埋，進行切片，測定Bax和Bcl-2基因蛋白表達水平，封片結束后，在光學顯微鏡下觀察(400倍)，采用高清晰HAIPS-2000凸顯分析系統(tǒng)測定每周光密度值。

1.6 心律失常評分方法 無心律失?；蛘哂校?5次的室性前期收縮，計0分；僅有≥5次的室性前期收縮，計1分； 有一陣<60 s的室性心動過速，計2分；有一陣≥60 s的或多陣累計<60 s的室性心動過速，計3分；多陣室性心動過速累計>60 s，計4分；出現(xiàn)室顫，計5分；出現(xiàn)持續(xù)5 min以上的室顫或在觀察期間死亡，計6分。模型組只計算再灌注期30 min內發(fā)生的心律失常。手術結束后處死動物取左心室，-80℃保存?zhèn)溆?。記錄大鼠缺?5 min后再灌注30 min的心電圖變化情況，測量T波抬高或降低的情況。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1 各組心肌缺血再灌注損傷指標水平 各組IMA、H-FABP、Bcl-2 OD值、Bax OD值、Bcl-2/Bax值差異顯著(P<0.05)；假手術組、丹參酮ⅡA高、中劑量組的IMA顯著低于模型組(P<0.05),假手術組、丹參酮ⅡA高劑量組的H-FABP顯著高于模型組(P<0.05)，假手術組、丹參酮ⅡA高、中、低劑量組的Bcl-2 OD值、Bax OD值、Bcl-2/Bax值均顯著高于或低于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠心肌缺血再灌注損傷指標水平比較±s)

與模型組比較：1)P<0.05；與假手術組比較:2)P<0.05；與丹參酮ⅡA高劑量組比較：3)P<0.05；與丹參酮ⅡA中劑量組比較:4)P<0.05,下表同

2.2 各組心律失常指標比較 各組心律失常評分、缺血再灌注T波變化幅度差異顯著(P<0.05)；模型組心律失常評分顯著高于假手術組、丹參酮ⅡA高、中、低劑量組(P<0.05)；模型組缺血再灌注T波變化幅度顯著高于假手術組、丹參酮ⅡA高、中和低劑量組(P<0.05)。見表2。

表2 各組心律失常指標變化情況±s，n=6)

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷的概念被提出〔2〕，對損傷的發(fā)生機制及預防、治療措施的探索一直受醫(yī)學界重視〔3〕。臨床研究逐漸認識到心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生過程十分復雜，簡要過程大致如下：心肌細胞缺血→胞內Ca2+濃度升高→細胞膜Na+/H+交換系統(tǒng)被激活→胞內Na+濃度升高→Na+/Ca2+交換系統(tǒng)被激活，導致Ca2+大量進入細胞→磷脂酶被激活→產(chǎn)生氧自由基；大量Ca2+移向線粒體導致線粒體功能障礙→引起心律失常。

正常人體中并不存在IMA，但當心肌缺血時，一系列生化指標的改變導致血液白蛋白(HSA)氨基末端N受損或被Cu2+結合，或受游離羥基的損害使氮基末端2～4個氨基酸改變成為IMA，在心肌缺血5～10 min后血中IMA即可升高，缺血停止后可持續(xù)2～4 h，12 h后恢復正常。冠心病患者經(jīng)皮冠狀動脈介入治療也可導致血液循環(huán)IMA中水平一過性升高；脂肪酸結合蛋白(FABP)是一種特異性存在于心肌細胞胞質內的游離脂肪酸的運載體，H-FABP是這種小分子蛋白的一種亞型，這種小分子蛋白的作用是將游離脂肪酸轉運至線粒體，因而是心肌收縮的主要能量來源，在發(fā)生心肌缺血后，H-FABP分子由于心肌細胞膜通透性增加而從心肌細胞大量流失，從而導致心肌細胞能量代謝物質缺乏，加重心肌受損。Bcl-2蛋白是一種存在于膜細胞器的膜整合蛋白家族，成員中如Bax、Bid 等發(fā)揮促進細胞凋亡作用，Bcl-2、Bcl-x等發(fā)揮抑制細胞凋亡作用。有研究證實Bcl-2過度表達有較強的抗大鼠心肌凋亡作用，但Bcl-2表達在缺血再灌注時顯著下降，因而凋亡指數(shù)升高，研究還發(fā)現(xiàn)在人體心肌缺血再灌注中試驗中，細胞凋亡蛋白Bax表達隨時間延長而增加〔4〕。本研究丹參酮ⅡA對缺血再灌注損傷及再灌注心肌細胞損傷具有良好的保護作用，與文獻相符〔5,6〕,其作用機制可能與其減輕炎癥反應、抑制鈣超載、活化內皮一氧化氮合酶/一氧化氮途徑減少心肌梗死面積等有關〔7～11〕，至于其更多的藥理機制尚需進一步研究。

1 韓 迪.丹參酮ⅡA對大鼠缺血再灌注心肌細胞凋亡的影響研究〔J〕.現(xiàn)代預防醫(yī)學,2011；38(13):2572-4.

2 周 倩.丹參酮ⅡIA 對急性心肌缺血室性心律失常的影響〔D〕.武漢：華中科技大學，2013.

3 張亞杰,王 旭.丹參多酚酸鹽對大鼠心臟缺血再灌注損傷的影響〔J〕.中國老年學雜志,2013;33(11):5659-61.

4 黃宜生,賈鈺華,孫學剛,等.酸棗仁皂苷A對缺血再灌注損傷大鼠心律失常及Bcl-2、Bax表達的影響〔J〕.中藥新藥與臨床藥理,2011；22(1):51-4.

5 Jang TS,Zhang H,Kim G,etal.Bioassay-guided isolation of fatty acid synthase inhibitory diterpenoids from the roots of Salvia miltiorrhiza Bunge〔J〕.Arch Pharm Res,2012；35(3):481-6.

6 Chuang MT,Ho FM,Wu CC,etal.15,16-dihydrotanshinone I,a compound of Salvia miltiorrhiza bunge,induces apoptosis through inducing endoplasmic reticular stress in human prostate carcinoma cells〔J〕.Evid Based Complement Alternat Med,2011；2011(5)：865435.

7 Xu M,Cao FL,Lin NY,etal.Tanshinone ⅡA reverses the malignant phenotype of SGC7901 gastric cancer cells〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev,2013；14(1):173-7.

8 Ren ZH,Tong YH,Xu W,etal.Tanshinone Ⅱ A attenuates inflammatory responses of rats with myocardial infarction by reducing MCP-1 expression〔J〕.Phytomedicine,2010；17(3-4):212-8.

9 Ren G,Dewald O,Frangogiannis NG.Inflammatory mechanisms in myocardial infarction〔J〕.Curr Drug Targets Inflamm Aller,2003；2(3):242-56.

10 Wang X,Wang Y,Jiang M,etal.Differential cardioprotective effects of salvianolic acid and tanshinone on acute myocardial infarction are mediated by unique signaling pathways〔J〕.J Ethnopharmacol,2011；135(3):662-71.

11 Pan C,Lou L,Huo Y,etal.Salvianolic acid B and tanshinone ⅡA attenuate myocardial ischemia injury in mice by NO production through multiple pathways〔J〕.Ther Adv Cardiovasc Dis,2011；5(2):99-111.

〔2015-07-14修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

湖南省教育廳科學研究項目(No.17C1431)；邵陽市科技計劃項目(2015NC53)

袁春桃(1982-)，女，主治醫(yī)師，主要從事心血管系統(tǒng)疾病基礎與臨床研究。

李 濤(1980-)，男，講師，主要從事心血管藥理研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)13-3154-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.014

1 邵陽市中心醫(yī)院