阿米替林對腸易激綜合征大鼠結(jié)腸和下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子表達(dá)的影響

趙廷坤 劉兆霞 曲梅花

(濰坊醫(yī)學(xué)院應(yīng)用藥理學(xué)山東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 濰坊醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，山東 濰坊 261053)

阿米替林對腸易激綜合征大鼠結(jié)腸和下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子表達(dá)的影響

趙廷坤 劉兆霞 曲梅花

(濰坊醫(yī)學(xué)院應(yīng)用藥理學(xué)山東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 濰坊醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，山東 濰坊 261053)

目的 探討阿米替林對腸易激綜合征(IBS)大鼠結(jié)腸和下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)表達(dá)的影響。方法 將30只成年Wistar大鼠隨機(jī)分為3 組：正常對照組、 IBS模型組、阿米替林組。采用體重、排便粒數(shù)、敞箱實(shí)驗(yàn)評分和糖水偏嗜度，評價(jià)阿米替林對IBS的作用，采用RT-PCR和Western印跡檢測大鼠結(jié)腸和下丘腦中CRF表達(dá)水平的變化。結(jié)果 IBS模型大鼠體重下降、排便增加、運(yùn)動(dòng)減少和興趣缺失，同時(shí)下丘腦和結(jié)腸CRF的表達(dá)均顯著高于正常對照組(P<0.05)，阿米替林預(yù)防應(yīng)用可改善IBS模型大鼠的癥狀，同時(shí)可減少IBS模型大鼠下丘腦和結(jié)腸CRF的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論 預(yù)防應(yīng)用阿米替林可改善IBS大鼠的癥狀，其機(jī)制可能與結(jié)腸和下丘腦CRF的表達(dá)下降有關(guān)。

阿米替林；促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子；腸易激綜合征

腸易激綜合征(IBS)發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。研究認(rèn)為精神心理因素在IBS的發(fā)病中起重要作用，應(yīng)激、焦慮和抑郁與IBS密切相關(guān)，抗抑郁藥可改善患者的腸道及精神心理癥狀〔1〕。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)是一種重要的神經(jīng)內(nèi)分泌肽，精神心理因素能夠改變CRF家族參與的信號通路，促使功能性腸道疾病的發(fā)生〔2〕，大腦和腸道中的CRF家族因子是急性或慢性刺激中的重要調(diào)節(jié)因子。阿米替林是臨床最常用的三環(huán)類抗抑郁藥，可改善IBS患者精神神經(jīng)功能〔3〕，本研究以急慢性聯(lián)合應(yīng)激制作IBS模型大鼠，并用阿米替林進(jìn)行干預(yù)，通過RT-PCR和Western印跡檢測CRF在下丘腦和結(jié)腸的表達(dá)，探討其表達(dá)變化與IBS發(fā)病的關(guān)系，為抗抑郁藥阿米替林治療IBS的作用機(jī)制提供新證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 熒光定量RT-PCR試劑盒，總RNA提取試劑盒，cDNA逆轉(zhuǎn)錄合成試劑盒，DEPC，EDTA均由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。兔抗大鼠CRF多克隆抗體、兔抗大鼠β-actin多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG、化學(xué)發(fā)光試劑盒均由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。美國PE公司5700型定量基因分析儀，美國ProteinSimple公司AlphaImager EP數(shù)字成像分析系統(tǒng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 雄性Wistar大鼠，4～6周齡，SPF級，體重180～200 g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供，許可證號：SCXK魯2008 0002。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物30只隨機(jī)分為 3 組：對照組、模型組、阿米替林組，模型組采用急慢性聯(lián)合應(yīng)激制備模型，參照文獻(xiàn)〔4〕施加以慢性不可預(yù)見性的刺激21 d，第28天給予急性束縛應(yīng)激〔5〕；正常對照組大鼠單籠常規(guī)飼養(yǎng)，不給予任何刺激，模型組和阿米替林組大鼠單只孤養(yǎng)，阿米替林組從施加刺激起每天給予腹腔注射10 mg/kg阿米替林(劑量參考文獻(xiàn)〔6〕)。

1.3 腸道敏感性評估 ①體重測定：在造模前和造模后分別測定大鼠體重。②排便測定：測定造模前和造模后各組大鼠在2 h內(nèi)的排便顆粒數(shù)。③敞箱實(shí)驗(yàn)〔7〕：所用敞箱高40 cm，長寬均為80 cm，各壁均為黑色，用白線劃分底面為面積相等的25 塊。實(shí)驗(yàn)在明暗合適、安靜的房間中進(jìn)行。將單只大鼠置于敞箱中央，測定其5 min內(nèi)穿越地面方塊數(shù)作為水平運(yùn)動(dòng)得分，以站立次數(shù)為垂直運(yùn)動(dòng)得分。水平穿越1 格為1分，垂直站立1次為1分，兩者相加為敞箱實(shí)驗(yàn)評分。④糖水消耗實(shí)驗(yàn)〔4〕：將試驗(yàn)分為訓(xùn)練期和測試期。實(shí)驗(yàn)前72 h，訓(xùn)練各組大鼠適應(yīng)含糖飲水，先給予大鼠兩瓶重量一致 1%蔗糖水24 h，然后給予1瓶1%蔗糖水和1瓶純水飲用24 h，兩瓶重量一致。適應(yīng)完成后，禁水禁食 24 h，在安靜通風(fēng)、明暗合適的環(huán)境中進(jìn)行測試：同時(shí)給予每只大鼠1瓶200 ml 1%蔗糖水和1瓶200 ml純水，24 h后測量各自的消耗量，按下式計(jì)算：蔗糖水偏嗜度=糖水消耗量/(糖水消耗量+純水消耗量)×100%。比較造模前后蔗糖水偏嗜度的變化。

1.4 定量RT-PCR檢測CRF基因表達(dá) 對大鼠予水合氯醛腹腔注射麻醉、斷頭處死，取大腦組織，在冰上剝離出下丘腦，組織稱重后，置于液氮保存；剖腹手術(shù)分離遠(yuǎn)端結(jié)腸，取距肛門約4 cm處結(jié)腸1 cm，置于液氮內(nèi)，再轉(zhuǎn)至-80℃冰箱保存。按照試劑盒說明提取下丘腦和結(jié)腸總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄出cDNA。從Gene Bank中查出大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、CRF mRNA 序列，設(shè)計(jì)引物如下：GAPDH 上游引物：5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′；下游引物：5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA3′；擴(kuò)增產(chǎn)物143 bp；CRF上游引物：5′-TGGATCTCACCTTCCACCTTCTG-3′，下游引物：5′-CCGATAATCTCCATCAGTTTCCTG-3′；擴(kuò)增產(chǎn)物101 bp。取2 μl cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，加入擴(kuò)增反應(yīng)體系中，設(shè)三個(gè)復(fù)孔，PCR反應(yīng)體系(25 μl)如下：12.5 μl MIX，6.5 μl ddH2O，上下游 引物各2 μl，2 μl cDNA模板。GAPDH和CRF反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性94 ℃ 5 s，退火：GAPDH，59 ℃，CRF，57℃，30 s，延伸72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，終末延伸72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物用2 %瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析，通過Quantity One軟件分析光密度值。CRF的條帶密度與內(nèi)參GAPDH條帶密度的比值，作為CRF基因mRNA表達(dá)的相對水平。

1.5 Western印跡檢測CRF蛋白表達(dá) 將下丘腦和結(jié)腸，分別加入細(xì)胞蛋白裂解液提取蛋白，Bradford方法測定蛋白濃度，配置8%的SDS-PAGE凝膠，將總蛋白加樣，恒壓電泳，恒流轉(zhuǎn)膜，加入5%的脫脂奶粉封閉過夜，加一抗兔抗大鼠CRF多克隆抗體，孵育2 h，PBS洗滌2次，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，孵育2 h，ECL顯色，暗室曝光，凝膠圖像用Quantity One軟件分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行F及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 腸道敏感性評估 造模前各組大鼠體重、糞粒數(shù)、敞箱實(shí)驗(yàn)評分和蔗糖偏嗜度無差異，給予急慢聯(lián)合應(yīng)激刺激后，模型組大鼠體重和敞箱實(shí)驗(yàn)評分均顯著低于對照組(P<0.05)，模型組大鼠排便數(shù)量明顯多于對照組(P<0.05)，同時(shí)模型組大鼠興趣缺失，糖水偏嗜度降低(P<0.05)；給予阿米替林干預(yù)，可增加大鼠體重和敞箱實(shí)驗(yàn)評分，均高于模型組(P<0.05)，使大鼠排便數(shù)減少，改善模型組大鼠興趣缺失，提高糖水偏嗜度(P<0.05)，見表1。

表1 各組腸道敏感性比較

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

圖1 下丘腦和結(jié)腸組織中CRF和GAPDH的RT-PCR結(jié)果

2.2 結(jié)腸和下丘腦CRF mRNA的檢測 CRF和GAPDH的擴(kuò)增曲線成單峰，表明擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物單一，無特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。如圖1顯示CRF和GAPDH片段擴(kuò)增情況，CRF片段為101 bp，GAPDH片段為143 bp，CRF和GAPDH擴(kuò)增片段退火曲線結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物為預(yù)期設(shè)計(jì)的特異片段。CRF mRNA表達(dá)以GAPDH為內(nèi)參對照，RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組(結(jié)腸：0.39±0.04，下丘腦：0.34±0.02)比較，模型組大鼠結(jié)腸(1.07±0.12)和下丘腦(1.32±0.11)中CRF的表達(dá)量均有升高(P<0.01)；阿米替林組大鼠結(jié)腸(0.74±0.07)和下丘腦(0.70±0.05)中CRF的表達(dá)量均低于IBS模型組大鼠(P<0.05)，但其高于對照組大鼠(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組結(jié)腸和下丘腦組織中CRF mRNA的表達(dá)

2.3 結(jié)腸和下丘腦CRF蛋白的表達(dá) CRF蛋白表達(dá)變化以β-actin為內(nèi)參對照，Western印跡結(jié)果顯示，與對照組(結(jié)腸：0.40±0.02；下丘腦：0.49±0.03)比較，模型組大鼠結(jié)腸(1.21±0.13)和下丘腦(1.12±0.11)中CRF蛋白的表達(dá)量均有升高(P<0.01)；阿米替林組大鼠結(jié)腸(0.59±0.04)和下丘腦(0.81±0.08)中CRF蛋白的表達(dá)量均低于模型組大鼠(P<0.05)，但其高于對照組大鼠(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組結(jié)腸和下丘腦組織中CRF 蛋白表達(dá)

3 討 論

IBS病因復(fù)雜，是生理-心理-社會(huì)綜合病征的代表之一，其發(fā)病機(jī)制可能與胃腸功能異常、內(nèi)臟感覺高敏感性以及腦-腸軸異常等因素相關(guān)〔5〕。應(yīng)激能夠引起IBS內(nèi)臟高敏性的形成，引起或者加重IBS癥狀。本課題組前期給予Wistar大鼠急慢性聯(lián)合應(yīng)激，可成功建立IBS大鼠模型〔8〕，本研究采用此方法建立IBS模型。

CRF主要由下丘腦分泌，其功能是使機(jī)體適應(yīng)應(yīng)激刺激，調(diào)節(jié)內(nèi)臟活動(dòng)和情緒反應(yīng)。中樞和腸道中CRF是急慢性刺激中的重要調(diào)節(jié)因子，其在應(yīng)激與腸道疾病的相關(guān)性中起到重要作用。大鼠下丘腦的室旁核和藍(lán)斑注射CRF，可顯著促進(jìn)結(jié)腸運(yùn)動(dòng)，使結(jié)腸的通過時(shí)間要縮短，糞便排出量可增加20倍〔9〕。在大鼠中樞注射CRF可以加劇結(jié)腸擴(kuò)張誘導(dǎo)的內(nèi)臟痛。外周靜脈注射或腹腔注射 CRF 可刺激大鼠結(jié)腸傳輸和排便，引起水樣腹瀉。臨床研究表明，人體外周注射CRF可以降低結(jié)腸擴(kuò)張的痛閾及增加結(jié)腸運(yùn)動(dòng)，IBS患者腦-腸軸對 CRF 反應(yīng)更加敏感〔10〕。本實(shí)驗(yàn)表明，給予急慢性聯(lián)合應(yīng)激建立的IBS模型大鼠體重下降、排便增加、運(yùn)動(dòng)減少和興趣缺失，同時(shí)下丘腦和結(jié)腸CRF的表達(dá)均顯著高于正常對照組，說明急慢性聯(lián)合應(yīng)激建立的IBS模型與下丘腦和結(jié)腸CRF的高表達(dá)有關(guān)。

IBS患者多數(shù)伴有心理精神障礙，抗抑郁藥能明顯減輕某些腹瀉型IBS患者腹部不適的癥狀。阿米替林屬于最經(jīng)典且應(yīng)用最廣泛三環(huán)類抗抑郁藥，在中樞，通過抑制邊緣系統(tǒng)的異常激活，改善IBS患者腹痛癥狀〔3〕；在外周，阿米替林可通過抑制胃腸運(yùn)動(dòng)，縮短胃腸通過時(shí)間，改善患者的排便狀況〔11〕，此外，阿米替林可改善IBS患者的焦慮抑郁癥狀，有助于減輕患者消化道癥狀。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿米替林預(yù)防應(yīng)用可改善IBS模型大鼠的癥狀，增加體重，減少排便，恢復(fù)其運(yùn)動(dòng)和興趣，同時(shí)可減少IBS模型大鼠下丘腦和結(jié)腸CRF的表達(dá)，說明阿米替林改善IBS模型大鼠的癥狀與下丘腦和結(jié)腸CRF的表達(dá)減少相關(guān)。以上提示阿米替林對IBS模型大鼠內(nèi)臟高敏感的治療作用，可能是通過降低腸道和中樞CRF的表達(dá)而產(chǎn)生，其作用機(jī)制可能與阿米替林對腦-腸軸的調(diào)節(jié)有關(guān)。

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〔2016-01-19修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目(No.J11LF33)

趙廷坤(1981-)，男，講師，碩士，主要從事神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)研究。

R574.4

A

1005-9202(2017)13-3142-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.009