碘對自身免疫性甲狀腺疾病大鼠血清與甲狀腺組織IP-10 mRNA表達的影響

高 瑛 劉勝鳳 張成華

(川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院，四川 南充 637000)

碘對自身免疫性甲狀腺疾病大鼠血清與甲狀腺組織IP-10 mRNA表達的影響

高 瑛 劉勝鳳 張成華1

(川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院，四川 南充 637000)

目的 探討碘對自身免疫性甲狀腺疾病大鼠血清與甲狀腺組織IP-10 mRNA表達水平的影響。方法 選取4周齡的特殊清潔級(SPF)級雌性Wistar大鼠90只，按照隨機數(shù)字法分為對照組(NC)、模型組(TG)、適碘組(NI)、模型組+適碘組(TG+NI)、高碘組(HI)、模型組+高碘組(TG+HI)，每組15只。剔除造模失敗、死亡、瘦弱的大鼠，選擇每組10只。NC組和TG組飲用不含碘的去離子水，NI組合TG+NI組飲用含150 μg/L碘的去離子水，HI組和TG+HI組飲用含3 000 μg/L碘的去離子水。在第10周結束時處死所有大鼠。放射免疫法(RIA)測定甲狀腺自身抗體水平；分光光度計法測定大鼠組織碘和尿碘；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清IP-10含量；RT-PCR法檢測甲狀腺組織IP-10 mRNA表達水平。結果 6組大鼠血清的TGAb和TMAb水平及甲狀腺組織IP-10 mRNA水平組間比較均差異顯著(P<0.05)，同等碘處理條件下，模型組的血清水平均顯著高于非模型組(P<0.05)。6組大鼠的甲狀腺組織碘和尿碘水平組間比較均有顯著差異(P<0.05)，且隨著碘攝入量的增高甲狀腺組織碘及尿碘水平均顯著升高(P<0.05)；同等碘處理條件下，所有模型組的甲狀腺組織碘和尿碘水平均低于非模型組。而6組大鼠血清IP-10含量比較無顯著差異(P>0.05)。結論 大鼠對碘過量具有很強的耐受能力，可以適應高碘現(xiàn)象，當?shù)膺^量時，會降低機體甲狀腺組織重IP-10 mRNA的表達，以此提高高碘的耐受能力。

自身免疫性甲狀腺炎；碘；IP-10

自身免疫性甲狀腺疾病(AITD)屬于一種非常常見的器官特異性的自身免疫性疾病，主要包括Graves眼病、慢性淋巴細胞性甲狀腺炎、產后甲狀腺炎等〔1〕。AITD發(fā)病機制復雜并且與多種因素有關，不僅與自身機體的免疫因素、遺傳因素、環(huán)境因素有關，還與因自由基導致的氧化應激等相關〔2〕。甲狀腺激素由甲狀腺合成分泌，其中碘作為該過程中的必需微量元素參與其中〔3〕。趨化因子是一類細胞因子，具有化學引誘物特性，能夠引發(fā)大量免疫效應細胞進入炎癥組織，起到啟動和維持自身免疫過程的作用。近年來，越來越多研究人員關注趨化因子IP-10在發(fā)病過程中的作用，如腎炎、慢性乙肝、類風濕關節(jié)炎等〔4〕。本研究采用豬甲狀腺球蛋白誘導大鼠形成實驗性自身免疫性甲狀腺炎(EAT)模型，觀察碘量差異對大鼠血清IP-10水平及甲狀腺IP-10 mRNA含量的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取4周齡的特殊清潔級(SPF)級雌性Wistar大鼠90只，體重120～140 g，按照隨機數(shù)字法分為對照組(NC)、模型組(TG)、適碘組(NI)、模型組+適碘組(TG+NI)、高碘組(HI)、模型組+高碘組(TG+HI)，每組15只。剔除造模失敗、死亡、瘦弱的大鼠，選擇每組10只。

1.2 動物飼養(yǎng) 根據(jù)美國營養(yǎng)學會(AIN)的嚙齒類動物純化配方的要求〔5〕，配制合成飼料對各組大鼠進行喂食(所有成分均按照配方要求進行配置，但是混合礦物質配置時不加碘)。NC組和TG組飲用不含碘的去離子水，NI組及TG+NI組飲用含150 μg/L碘的去離子水，HI組及TG+HI組飲用含3 000 μg/L碘的去離子水。

1.3 EAT動物模型 將100 mg豬甲狀腺球蛋白完全溶于50 ml無菌雙蒸水中，取10 ml溶解液分別與10 ml完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑混合形成濃度為200 μg/ml的油包水狀乳劑抗原。實驗第2周對大鼠進行初次免疫，在其右后足皮下注射0.5 ml乳劑抗原；實驗第5周進行加強免疫，在其背部皮下注射0.5 ml乳劑抗原，每周注射1次，共注射6次，在第10周結束時處死所有大鼠。迅速取出甲狀腺，測定組織含碘；死前1 w收集尿液進行尿碘測定。

1.4 EAT大鼠自身抗原檢測 實驗第10周所有大鼠眼靜脈取血置于離心管，室溫靜止30 min后3 600 r/min離心10 min，分離血清，放射免疫法檢測TGAb及TMAb，試劑盒均購于坊三維生物工程集團有限公司，設置陰性血清管、陽性血清管和樣本管，所有管中均加入標記物，再加入免疫分離劑，離心去上清，測沉淀放射性計數(shù)，具體步驟參考說明書所述。

1.5 血清IP-10含量檢測 實驗第10周所有大鼠眼靜脈取血置于離心管，室溫靜止30 min后3 600 r/min離心10 min，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測IP-10含量，試劑盒購于美國Peprotech公司，在酶標板孔內加入標準品和樣品，450 nm處測定OD值，根據(jù)標準品做出標準曲線，計算樣品濃度，具體步驟參考說明書所述。

1.6 甲狀腺組織IP-10 mRNA檢測 采用RT-PCR方法，實驗第10周，解剖各組大鼠，從甲狀腺組織中利用Trizol法提取總RNA，利用大連TAKARA公司的逆轉錄試劑盒合成cDNA。PCR引物序列：IP-10：正義：5′-CAAGGCTTCCCAATTCTC-3′，反義：5′-ACCTGGACTGCATTTGA-3′，退火溫度57℃，長度202 bp；GAPDH：正義：5′-GGCACAGTCAAGGCTGAATG-3′，反義：5′-ATGGTGGTGAACGCCAGTA-3′。退火溫度57℃，長度143 bp。各組的mRNA相對表達量以2-△△CT值表示。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件，計量資料兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用重復測量方差分析。

2 結 果

2.1 大鼠血清TGAb及TMAb水平 6組大鼠血清TGAb及TMAb水平組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，同等碘處理條件下，模型組的血清水平均顯著高于非模型組(P<0.05)，見表1。

2.2 甲狀腺組織碘及尿碘水平 6組大鼠的甲狀腺組織碘和尿碘水平組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；隨著碘攝入量的增高，甲狀腺組織碘及尿碘水平均顯著升高(P<0.05)。同等碘處理條件下，模型組的水平均低于非模型組，見表1。

2.3 血清IP-10含量及甲狀腺組織IP-10 mRNA水平 6組大鼠血清IP-10含量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而甲狀腺組織IP-10 mRNA水平差異有統(tǒng)計學意義，隨著不斷增加碘的攝入量，IP-10 mRNA表達水平均高于NC組；同等碘處理條件下，模型組的IP-10 mRNA的表達水平均高于非模型組(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清TGAb、TMAb水平甲狀腺組織碘、尿碘、血清IP-10含量及甲狀腺組織IP-10 mRNA比較

與NC組比較：1)P<0.05；與TG組比較:2)P<0.05；與NI組比較:3)P<0.05；與HI組比較:4)P<0.05

3 討 論

本試驗采用的EAT模型，被認為是研究AITD的標準動物模型〔6〕。EAT大鼠模型成功建立的標準之一為血清中TMAb及TGAb含量較高。碘量攝入過多也能夠增強TMAb及TGAb的免疫原性〔7〕。本實驗中，模型組大鼠血清中TMAb及TGAb含量均高于正常對照組；此外，TMAb及TGAb升高促使甲狀腺淋巴細胞浸潤程度，加快穿孔素釋放激活凋亡系統(tǒng)，最終加速凋亡、破壞濾泡上皮細胞。根據(jù)上述結果，我們可以認定實驗模型造模成功。

NC和TG組喂養(yǎng)10 w后檢測尿碘含量及甲狀腺組織中碘的含量，表現(xiàn)出顯著的碘缺乏。HI組雖然每天的攝入碘量是NI組的20倍，但是檢測出的甲狀腺組織碘的含量并未表現(xiàn)出成倍地增加，只是出現(xiàn)輕微的升高；卻發(fā)現(xiàn)尿碘的含量成倍增加，增加幅度與攝入量較一致。表明甲狀腺具有嚴格調控碘攝入的能力。

趨化因子是一類細胞因子，能夠激發(fā)白細胞的趨化性，誘導單核、中性粒巨噬細胞等炎性細胞進入到炎癥灶，增強炎性細胞在炎癥過程中的吞噬殺傷能力，還能影響細胞因子在免疫系統(tǒng)中的作用〔8〕。根據(jù)功能和生成趨化因子的細胞類型，可將趨化因子分為4個亞族：C、CC、CXC、CX3C，其中C表示一個半胱氨酸，X表示氨基酸殘基〔9〕。IP-10是CXC亞族中比較具有代表性的趨性因子，可由干擾素(IFN)-γ誘導產生，在炎癥反應中IP-10能夠結合CXCR3受體趨化活化諸多淋巴細胞遷移至炎癥部位〔10〕。本實驗中，不斷增加碘的攝入量，大鼠血清中的IP-10水平與甲狀腺中IP-10 mRNA表達水平均高于正常對照組，并且升高趨勢一致。TG+NI組比正常碘給予組的甲狀腺分泌了更多的IP-10。還有學者研究發(fā)現(xiàn)，血清中IP-10水平僅僅在剛被確診為ETA的患者體內升高，如果患者屬于長期患病，則其體內血清IP-10水平降低，反而出現(xiàn)另一種趨化因子CCL22水平升高〔11〕。從結果來看，當攝碘量高至一定濃度時，大鼠機體會發(fā)生代償性紊亂，也可能因為ETA病情的加重，另一種趨化因子開始影響，這需要通過后續(xù)試驗進行深入研究。

綜上所述，大鼠對過量碘具有很強的耐受能力，可以適應高碘現(xiàn)象。其機制之可能為當?shù)膺^量時，會降低機體甲狀腺組織IP-10 mRNA的表達，以此提高高碘的耐受能力。

1 房 方,衛(wèi)紅艷,王坤玲,等.硒治療自身免疫性甲狀腺疾病的薈萃分析〔J〕.國際內分泌代謝雜志,2016;36(4):570-2.

2 Effraimidis G,Wiersinga WM.Mechanisms in endocrinology:autoimmune thyroid disease:old and new players〔J〕.Eur J Endocrinol,2014;170(6):R241-52.

3 李 康,于健春,康維明.碘攝入與甲狀腺疾病〔J〕.中華地方病學雜志,2016;35(3):166-9.

4 楊 璐,李恒平,劉振華,等.趨化因子與炎癥、前列腺癌的關系的研究〔J〕.現(xiàn)代預防醫(yī)學,2015;42(5):952-6.

5 Aguilar EG,Albarracín GD,Uates MA,etal.Evaluation of the nutritional quality of the grain protein of new amaranths varieties〔J〕.Plant Food Human Nutr,2015;70(1):21-6.

6 劉 丹,藺新英,于福貴,等.海帶有機碘與無機碘對甲狀腺功能亢進Wistar大鼠心肌ATP酶的影響〔J〕.中華地方病學雜志,2015；34(9):646-9.

7 徐偉良,聶芙蓉,曹綺雯,等.血清甲狀腺球蛋白抗體、甲狀腺微粒體抗體、甲狀腺過氧化物酶抗體對自身免疫性甲狀腺疾病的診斷價值〔J〕.實用臨床醫(yī)藥雜志,2014;18(5):10-2.

8 牟 娜,牟 佳,李 寧,等.慢性乙型肝炎患者外周血趨化因子和炎癥因子的水平〔J〕.細胞與分子免疫學雜志,2015;31(7):968-71.

9 羅雪雁,陽學風.趨化因子在肝纖維化中作用的研究進展〔J〕.中國肝臟病雜志電子版,2014;6(2):94-6.

10 Bolomsky A.CXCR3 binding chemokines MIG,IP-10 and ITAC are predictors of overall survival in newly diagnosed multiple myeloma〔J〕.Blood,2014;124:2052.

11 Grigore GE,Ivanov IC,Zlei M,etal.Specific associations between clinical signs,immune cells,disease genetic background and burden in a group of patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia〔J〕.Revista Romana de Medicina de Laborator,2014;22(1):79-92.

〔2016-11-19修回〕

(編輯 李相軍)

Effect of iodine on the expression of IP-10 mRNA in serum and thyroid tissue of autoimmune rats

GAO Ying, LIU Sheng-Feng, ZHAGN Cheng-Hua.

Affiliated Hospital of Chuanbei Medical College, Nanchong 637000, Sichuan, China

Objective To investigate the effect of iodine on the expression of IP-10 mRNA in serum and thyroid tissue of autoimmune rats.Methods 90 SPF female Wistar rats were randomly divided into control (NC), model (TG), normal iodine (NI), model and normal iodine (TG+NI) and high iodine (HI), model and high iodine (TG+HI) groups, 15 cases each. NC and TG groups were given no iodine water, NI and TG+NI groups deionized water containing 150 g/L deionized water, HI and TG+HI groups water containing 3 000 g/L, NC and TG groups deionized water with out iodine, NI and TG+NI groups deionized water containing 150 μg/L of water, HI and TG+HI groups deionized water containing 3 000 μg/L. Radioimmunoassay (RIA) was used to determine the levels of thyroid autoantibodies; spectrophotometry was used to determine iodine and iodine in rat tissues; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to determine serum IP-10 content; RT-PCR method was used to detect the expression of IP-10 mRNA in thyroid tissue.Results The serum TGAb and TMAb levels and thyroid tissue IP-10 mRNA levels were significantly different between two groups (P<0.05); in the same iodine treatment conditions, serum TGAb and TMAb levels of all of the model groups were significantly higher than those of non model groups (P<0.05). The thyroid iodine and urinary iodine levels had significant differences(P<0.05); and with the increase of iodine intake, iodine of thyroid tissue and urinary iodine levels were significantly increased (P<0.05).Conclusions Rats have a strong tolerance to iodine excess, to adapt to the phenomenon of high iodine, when under excessive iodine, it will reduce the IP-10 mRNA expression of thyroid tissue, in order to improve the tolerance of high iodine.

Autoimmune thyroiditis; Iodine; IP-10

國家自然科學基金青年科學基金項目(No.21503026)

張成華(1985-)，女，博士，講師，主要從事基礎醫(yī)學研究及教學工作。

高 瑛(1988-)，女，在讀碩士，主要從事基礎醫(yī)學研究。

R581.4

A

1005-9202(2017)13-3135-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.006

1 川北醫(yī)學院基礎醫(yī)學院