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    紅景天、紅景天苷對小鼠骨骼肌質(zhì)量的調(diào)控作用及機(jī)制

    2017-07-18 11:50:13陳曉萍
    中國老年學(xué)雜志 2017年13期
    關(guān)鍵詞:紅景天肌纖維骨骼肌

    于 亮 周 越 陳曉萍

    (北京體育大學(xué)運動人體科學(xué)學(xué)院,北京 100084)

    紅景天、紅景天苷對小鼠骨骼肌質(zhì)量的調(diào)控作用及機(jī)制

    于 亮 周 越 陳曉萍1

    (北京體育大學(xué)運動人體科學(xué)學(xué)院,北京 100084)

    目的 探討紅景天、紅景天苷對小鼠下肢骨骼肌質(zhì)量和慢肌、快肌表達(dá)的影響及作用機(jī)制。方法 40只小鼠經(jīng)過預(yù)實驗篩選后,選取其中30只分為對照組、紅景天組和紅景天苷組。檢測比目魚肌、跖肌的骨骼肌濕重及Troponin I-SS(TnI-SS)、Troponin I-FS(TnI-FS)、Akt、p-Akt(Ser473)、TβR-Ⅱ的蛋白表達(dá),Atrogin-1和MuRF-1的mRNA表達(dá),分析調(diào)控機(jī)制。結(jié)果 各組小鼠體重未見明顯差異,肌濕重略有增加,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組相比,紅景天苷組小鼠比目魚肌和跖肌中TnI-SS和TnI-FS表達(dá)增加,使骨骼肌質(zhì)量得以提升。紅景天苷可有效提升Akt及其磷酸化水平,抑制TβR-Ⅱ的表達(dá),抑制Atrogin-1和MuRF-1的mRNA表達(dá)。結(jié)論 紅景天苷可促進(jìn)小鼠骨骼肌TnI-SS和TnI-FS表達(dá),從而使骨骼肌質(zhì)量得以提升;促進(jìn)蛋白質(zhì)合成關(guān)鍵因子Akt及其磷酸化的表達(dá),抑制TβR-Ⅱ表達(dá),可能為調(diào)控小鼠骨骼肌質(zhì)量的機(jī)制。

    骨骼??;紅景天;紅景天苷;骨骼肌質(zhì)量;肌纖維類型

    去負(fù)荷肌萎縮是在運動損傷后的長期制動、臥床,以及航天飛行過程中失重等去負(fù)荷干預(yù)情況下,機(jī)體在維持姿勢或進(jìn)行活動時無需對抗重力作用出現(xiàn)的肌肉體積、橫截面積明顯縮小,力量、收縮性能下降等肌肉失用性狀態(tài),其發(fā)生、發(fā)展影響到人體機(jī)能的保持與恢復(fù)效率,影響到運動員復(fù)訓(xùn)或康復(fù)期間骨骼肌力量的恢復(fù)等競技體育和全民健身關(guān)鍵問題。紅景天具有抗低氧、抗疲勞、抗應(yīng)激等多種功效,其提純所得出的主要成分紅景天苷,在各領(lǐng)域可能具有更為廣闊的應(yīng)用前景。對上述兩種中成藥在骨骼肌質(zhì)量和肌纖維類型等方面進(jìn)行系統(tǒng)研究后發(fā)現(xiàn),紅景天、紅景天苷補(bǔ)充可促使慢肌纖維表達(dá)增加,此外還可適當(dāng)增加快肌纖維表達(dá)〔1〕,提示可能具有促使骨骼肌蛋白質(zhì)合成的機(jī)制存在。PI3K/Akt信號通路是骨骼肌內(nèi)促使蛋白質(zhì)合成的主要途徑,其中關(guān)鍵因子絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(Akt)為PI3K的下游信號分子,能介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng),可抑制TGF-β/Smad這一促使骨骼肌蛋白質(zhì)降解的主要通路的表達(dá)〔2,3〕;而TGF-β通路主要由TGF-β受體(TβR)及受體底物Smad蛋白家族信號分子組成〔4〕。因此,研究Akt和TβR-Ⅱ可進(jìn)一步明確骨骼肌蛋白質(zhì)合成和(或)降解的機(jī)制。本研究采用C57BL/6小鼠28 d紅景天及紅景天苷灌胃研究相應(yīng)的調(diào)控作用,分析關(guān)鍵因子表達(dá)與骨骼肌體積、肌纖維類型表達(dá)程度的關(guān)系,從調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝的角度探究其防治去負(fù)荷肌萎縮的機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物與分組 8周齡C57BL/6雄性小鼠40只,6只/籠飼養(yǎng),自由飲食、飲水,常規(guī)飼料,溫度(21±2)℃,相對濕度45%~55%,晝夜明暗交替為12 h光照/12 h黑暗。將所有小鼠稱重、標(biāo)記號碼后,每天放入跑臺以10 m/min運動15 min,預(yù)適應(yīng)3 d,綜合體重和運動能力情況,篩選其中30只小鼠,并分為生理鹽水灌胃的對照組(Con)、紅景天溶液灌胃的紅景天組(Rho)和紅景天苷溶液灌胃的紅景天苷組(Sal),每組10只。

    1.2 實驗方案 分別向紅景天組和紅景天苷組小鼠每天每只小鼠灌0.1 ml藥物。紅景天采用淺褐色干燥顆?!凹t益膠囊”溶解;紅景天苷用高效液相色譜檢測其純度高達(dá)98%,為白色粉末。灌胃劑量以小鼠體重為標(biāo)準(zhǔn),紅景天按200 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)灌胃,紅景天苷按50 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)灌胃。

    1.3 取材與檢測方法

    1.3.1 取材 按照實驗設(shè)計,在實驗前后稱量小鼠體重(g)。在28 d灌胃結(jié)束后次日晨,將小鼠頸椎脫臼處死,以提取RNA的標(biāo)準(zhǔn)分別取對照組、紅景天組和紅景天苷組的小鼠雙側(cè)比目魚肌和跖肌,稱量濕肌重量(mg)后迅速置于凍存管投入液氮內(nèi)保存。

    1.3.2 主要試劑、儀器 Akt、p-Akt、TβR-Ⅱ抗體,Cell Signaling公司。β-actin抗體(內(nèi)參),Santa Cruz公司。sc-47778、Atrogin-1、MuRF-1、18S引物,北京奧科鼎盛生物科技有限公司。SYBR?Green PCR Master Mix,Applied Biosystems公司,美國。P/N:4367659。電轉(zhuǎn)儀、電泳槽等,美國Bio-Rad。

    1.3.3 Western印跡 分離膠濃度:TβR-Ⅱ為8%;Akt和p-Akt為10%;TnI-SS和TnI-FS為12%。積層膠濃度:均為5%。電泳完成后用麗春紅對NC膜進(jìn)行預(yù)染,洗膜后1%TBST配脫脂奶粉成5%脫脂牛奶封閉。一抗:TnI-SS、TnI-FS用5%脫脂牛奶配制,濃度為1∶1 000;Akt、p-Akt和TβR-Ⅱ用5%BSA配制,濃度為1∶500。Beta-actin用5%脫脂牛奶配制,濃度為1∶3 000。搖床洗膜后加入二抗。二抗:用5%脫脂牛奶配制,Akt、p-Akt和TβR-Ⅱ濃度為1∶500,TnI-SS、TnI-FS濃度為1∶1 000,Beta-actin濃度為1∶2 000。搖床洗膜后暗室內(nèi)曝光顯影。

    1.3.4 Real time PCR 取實時熒光定量PCR用管,將注射用水、上游引物、下游引物、模板和SYBR Green酶用移液器混入管兩端,混勻后每孔加15 μl樣本,短暫離心后放入實時熒光定量PCR儀中。反應(yīng)體系50 μl分別為注射用水21 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、cDNA 2 μl、SYBR Green 25 μl。每個樣本重復(fù)3次,采用相對Ct值定量分析(△△Ct)。引物設(shè)計序列:Atrogin-1:上游:5′-GGTCCAAAGAGTCGGCAAGTC-3′,下游:5′-CCATCCGATACACCCACATG-3′;MuRF-1:上游:5′-CAACCTGTGCCGCAAGTG-3′,下游:5′-CAACCTCGTGCCTACAAGATG-3′;18S:上游:5′-GCACACATACATGCACGAA-3′,下游:5′-AAAATGAAAGCCCATAGCC-3′。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析 用IPP6.0軟件處理條帶,進(jìn)行灰度分析。運用SPSS16.0軟件,方差齊性檢驗采用Levene方法,單因素方差分析(One-way ANOVA)處理數(shù)據(jù)。

    2 結(jié) 果

    2.1 小鼠體重及肌濕重變化 對照組、紅景天組和紅景天苷組運動時間分別為(145.72±9.89)min、(143.79±15.51)min和(145.79±13.94)min,3組間無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);體重分別為(20.92±0.37)g、(20.65±0.25)g和(20.58±0.72)g,3組無顯著差異(P>0.05)。28 d灌胃后,體重均出現(xiàn)上升狀況,3組分別為(25.36±0.59)g、(25.44±0.41)g、(25.65±0.61)g;3組分別上升(4.44±0.53)g、(4.79±0.36)g和(5.07±0.75)g,無顯著差異(P>0.05)。天平稱量肌肉濕重發(fā)現(xiàn),與對照組相比,紅景天組和紅景天苷組的比目魚肌和跖肌重量平均增加1~2 mg,但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    2.2 不同類型肌纖維TnI-SS和TnI-FS的表達(dá) 比目魚肌為典型的慢肌纖維,其中TnI-SS的表達(dá)量較多,而跖肌作為典型的快肌纖維,TnI-SS的表達(dá)較少難以檢測。通過檢測小鼠典型的慢肌纖維(比目魚肌)和典型的快肌纖維(跖肌)中TnIss表達(dá),發(fā)現(xiàn)比目魚肌中紅景天和紅景天苷灌胃的小鼠TnI-SS表達(dá)量明顯升高(分別為6.21±0.23,6.14±0.36),與對照組(設(shè)為1)相比差異顯著(P<0.01);跖肌中未檢測到TnI-SS表達(dá),見圖1。由于骨骼肌快肌纖維百分比較高,因此無論是比目魚肌還是跖肌中均檢測到快肌肌鈣蛋白(TnI-FS)表達(dá)。在跖肌中各組的TnI-FS表達(dá)未見顯著性差異(對照組、紅景天組、紅景天苷組分別為1,1.14±0.27、1.02±0.21)(P>0.05);而比目魚肌中紅景天組和紅景天苷組的TnI-FS表達(dá)(1.23±0.13,1.28±0.16)與對照組(設(shè)為1)相比均具有顯著性差異(P<0.05),見圖2。

    1~3:對照組、紅景天組、紅景天苷組,下圖同圖1 比目魚肌和跖肌TnI-SS蛋白表達(dá)

    圖2 比目魚肌和跖肌TnI-FS蛋白表達(dá)

    2.3 比目魚肌Akt、p-Akt及TβR-Ⅱ的表達(dá) 與對照組(1)相比,紅景天苷組Akt表達(dá)水平(1.21±0.06)明顯升高(P<0.05),紅景天組表達(dá)水平下降(0.72±0.05)p-Akt呈現(xiàn)階梯式上升,即紅景天組表達(dá)水平(1.74±0.12)高于對照組(1)(P<0.05),紅景天苷組表達(dá)水平(0.21±0.21)高于對照組和紅景天組(P<0.05)。與對照組(1)相比,紅景天組(0.38±0.02)和紅景天苷組(0.83±0.02)的TβR-Ⅱ表達(dá)水平明顯下降(P<0.01),見圖3,圖4。

    圖3 比目魚肌Akt和p-Akt蛋白表達(dá)

    圖4 比目魚肌TβR-Ⅱ蛋白表達(dá)

    2.4 比目魚肌Atrogin-1和MuRF-1的mRNA表達(dá) 4 w紅景天苷灌胃后比目魚肌中Atrogin-1(0.78±0.07)和MuRF-1(0.9±0.09)基因表達(dá)水平較對照組(1±0.09,1±0.20)下降,Atrogin-1 mRNA表達(dá)下降具有顯著性差異(P<0.05),MuRF-1的下降未見顯著性差異(P>0.05)。

    3 討 論

    3.1 紅景天苷對骨骼肌質(zhì)量和肌纖維類型的調(diào)控 紅景天是多年生草本或亞灌木植物,廣泛分布在歐亞大陸的山地地區(qū),多年以來作為祖國傳統(tǒng)醫(yī)藥受到了廣泛關(guān)注,主要成分為紅景天苷和甙元酪醇、絡(luò)塞維等,具有改善機(jī)體免疫力,調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝,調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)等藥理作用,與運動相關(guān)的主要作用是抗疲勞、抗缺氧。作為提純獲取的主要成分,紅景天苷在調(diào)節(jié)代謝方面的作用要強(qiáng)于紅景天,可促使糖原合成增加、脂肪代謝改善。前期針對紅景天、紅景天苷對骨骼肌作用的研究結(jié)果表明,在結(jié)合運動的情況下二者促使MHC-Ⅰ的mRNA表達(dá)增加,MHC-Ⅱb的mRNA表達(dá)減少,同時TnI-SS蛋白表達(dá)量增加,即具有促進(jìn)骨骼肌慢肌纖維增加的作用,但與對照組相比紅景天和紅景天苷補(bǔ)充后體重及肌肉濕重未出現(xiàn)明顯變化,分析可能為藥物灌胃后的小鼠運動能力增強(qiáng),運動時間和運動距離增加,消耗了更多脂肪所致〔5〕。本研究表明運動是促使肌肉濕重下降的因素之一。

    肌纖維類型主要按照肌球蛋白重鏈亞型(MHC)分為Ⅰ型、Ⅱa型、Ⅱd/x型和Ⅱb型。從能量代謝的角度看,由于快肌MHC亞型消耗ATP速度比慢肌MHC亞型快,因此可以基于MHC亞型進(jìn)行系統(tǒng)分類〔6〕。橫橋的循環(huán)速度是由MHC亞型決定的,MHC-Ⅰ最慢,MHC-Ⅱa型居中,MHC-Ⅱd/x為混合型,MHC-Ⅱb型最快〔7〕。而肌鈣蛋白亞單位Ⅰ(TnI)是鈣離子調(diào)節(jié)橫紋肌收縮過程中關(guān)鍵的蛋白,分子量約為18.5 kD,其異構(gòu)體的區(qū)別直接導(dǎo)致肌纖維功能和狀態(tài)的差異。慢肌肌鈣蛋白(TnI-SS)和快肌肌鈣蛋白(TnI-FS)分別表示慢肌纖維和快肌纖維,與MHC-I和MHC-Ⅱ相對應(yīng)〔8,9〕。本實驗發(fā)現(xiàn)4 w紅景天及紅景天苷灌胃對慢肌纖維比目魚肌的影響如前期研究,會促使TnI-SS的表達(dá)增加。TnI-FS的表達(dá)量與前期結(jié)合運動的小鼠有所區(qū)別,無論在比目魚肌中還是在跖肌中均會促使TnI-FS的表達(dá)不斷增加,表明可適當(dāng)?shù)卦黾涌旒〔糠?,使骨骼肌質(zhì)量得以提升。

    骨骼肌的糖轉(zhuǎn)運可由PI3K/Akt和AMPK兩條信號通路激活完成。AMPK是細(xì)胞內(nèi)的能量感受器,在調(diào)節(jié)糖代謝和脂代謝過程中具有重要作用〔10〕。有研究采用不同劑量的紅景天苷對大鼠進(jìn)行連續(xù)12 d灌胃,發(fā)現(xiàn)紅景天苷可顯著提高大鼠運動耐力〔11〕,分析紅景天苷可能增加細(xì)胞能量利用率,促使AMP含量降低,保證骨骼肌細(xì)胞能量平衡,骨骼肌的應(yīng)激能力得到改善〔12〕。有文獻(xiàn)報道,Akt可調(diào)控萎縮因子的變化還與運動過程中能量代謝“開關(guān)”AMPK相關(guān)〔13〕,如果動物不進(jìn)行運動,是否會啟動PI3K/Akt通路,從而完成對骨骼肌質(zhì)量的調(diào)控尚未得知,因此我們檢測了關(guān)鍵信號Akt蛋白表達(dá)及其磷酸化的水平。

    3.2 紅景天苷調(diào)控Akt磷酸化影響骨骼肌質(zhì)量 Akt是一種絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶,可通過特定的激酶磷酸化,其活性由磷酸化位點特異性的磷酸酯酶控制,在PIP3去磷酸化后活性降低,降低的程度受Akt調(diào)控。Akt具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化等多種功能〔14〕。在Akt高表達(dá)的情況下,可抑制TGF-β家族的肌肉生長抑素(MSTN)的活性〔15〕,從而促使蛋白質(zhì)合成,在骨骼肌組織表現(xiàn)為肌纖維體積增加。本研究提示在骨骼肌組織中紅景天具有促使骨骼肌質(zhì)量和體積增加的效用,在各種成分中紅景天苷起主要作用。

    現(xiàn)已明確,PI3K/Akt信號通路和TGF-β/Smad信號通路互相抑制,維持組織穩(wěn)態(tài)。TGF-β家族中的MSTN會誘導(dǎo)關(guān)鍵因子Smad2和Smad3的激活和磷酸化,抑制Akt/mTOR/p70S6K通路,從而使肌管細(xì)胞分化后,引起肌纖維直徑減小〔16〕。而TGF-β通路主要由TβR及受體底物Smad蛋白家族信號分子組成。活化的配體與TGF-β的Ⅱ型受體(TβR-Ⅱ)結(jié)合,再與ALK-1或TβR-I/ALK-5(TGF-β的I型受體)結(jié)合,該通路通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、黏附、移行及凋亡而在生物整體及各種器官的發(fā)育過程中起重要的作用。在肌萎縮大鼠模型中TβR-Ⅱ及Smad表達(dá)均出現(xiàn)不同程度的增加〔17,18〕。TβR-Ⅱ表達(dá)高低,是影響TGF-β1-TβR-Ⅱ-Smad3信號通路發(fā)揮作用的關(guān)鍵因素,直接影響下游基因的活化。由于Akt可以促進(jìn)蛋白質(zhì)合成及防止骨骼肌萎縮的關(guān)鍵因子MuRF-1和Atrogin-1的轉(zhuǎn)錄上調(diào),對叉頭框蛋白O(FoxO)轉(zhuǎn)錄因子家族起抑制作用〔19〕,所以,當(dāng)Akt磷酸化后FoxO出核,MuRF-1和Atrogin-1上調(diào)機(jī)制被阻斷。MuRF-1和Atrogin-1通過特定的泛素蛋白質(zhì)底物,引發(fā)蛋白酶體降解。MuRF-1的作用底物包括肌節(jié)內(nèi)的Myosin及MHC,因此可通過抑制MuRF-1激活,在萎縮的條件下防止Myosin降解。Akt通過mTOR/p70S6K促進(jìn)蛋白質(zhì)合成,通過磷酸化和失活A(yù)sk1、Bad、Bax和FoxO3a等凋亡因子提高細(xì)胞的生存率。紅景天苷在抑制TβR-Ⅱ表達(dá)的同時,抑制了MuRF-1和Atrogin-1的mRNA的表達(dá),對于Atrogin-1的mRNA具有明顯抑制效應(yīng)(P<0.05),從另一側(cè)面證實了紅景天苷提升骨骼肌質(zhì)量的作用。

    總之,紅景天苷灌胃可促進(jìn)小鼠骨骼肌TnI-SS和TnI-FS表達(dá),從而使骨骼肌質(zhì)量得以提升,其主要機(jī)制可能為紅景天苷促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)合成關(guān)鍵因子Akt及其磷酸化的表達(dá),阻斷了MuRF-1和Atrogin-1上調(diào)途徑,抑制TβR-Ⅱ表達(dá),使TGF-β家族下游的配體無法有效結(jié)合,致使Smad表達(dá)下降所致。對去負(fù)荷肌萎縮的治療和預(yù)防具有一定的意義,需進(jìn)行相關(guān)信號通路激活、阻斷等深入研究。

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    〔2017-01-30修回〕

    (編輯 李相軍)

    Regulation and mechanism of rhodiola, salidroside on skeletal muscle mass

    YU Liang, ZHOU Yue, CHEN Xiao-Ping.

    Sport Science College, Beijing Sport University, Beijing 100084, China

    Objective To explore the regulation and mechanism rhodiola, salidroside on mouse skeletal muscle mass, slow twitch and fast twitch.Methods 30 C57BL/6 mice were chosen from 40 mice after preliminary experiment and divided into control, rhodiola and salidroside groups. Mice were intragastric administrated for 4 weeks. Skeletal muscle weight, Troponin I-SS (TnI-SS), Troponin I-FS (TnI-FS), Akt, p-Akt(Ser473) and TβR-Ⅱ of soleus and plantaris were measured.Results There were no significant differences in weight and muscle weight of skeletal muscle among three groups, muscle wet weight increased slightly, but there was no statistically significant differences. Compared to the control group, TnI SS, TnI FS of soleus expression were increased, the skeletal muscle mass improved in rhodiola and salidroside groups. Salidroside could effectively enhance the level of Akt and p-Akt (Ser473), inhibit the expression of TβR-Ⅱ, Atrogin-1 and MuRF-1 mRNA.Conclusions Four weeks of salidroside intragastric gavage could increase the slow and fast fiber express, improve skeletal muscle mass. Promotion expression of the protein synthesis key factors Akt and its phosphorylation, inhibition TβR-Ⅱ expression, might be the mechanism for regulating the skeletal muscle mass in mice.

    Skeletal muscle; Rhodiola; Salidroside; Skeletal muscle mass; Muscle fiber type

    國家自然科學(xué)基金項目(31500964);國家體育總局全民健身課題(2015B046);中央高?;究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助;北京體育大學(xué)自主科研項目(2016RB018;2016YB047)

    陳曉萍(1965-),女,博士,研究員,主要從事失重條件下骨骼肌形態(tài)功能的調(diào)控研究。

    于 亮(1981-),男,博士,副教授,主要從事運動對骨骼肌形態(tài)和功能的影響研究。

    G804.23

    A

    1005-9202(2017)13-3129-04;

    10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.004

    1 中國航天員科研訓(xùn)練中心

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