NAPP/PS1雙轉基因小鼠行為學表現(xiàn)及遠志皂苷對其調控作用

興桂華 柏青楊 弓 箭 叢 歡 董海影

(齊齊哈爾醫(yī)學院臨床病理診斷中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

·基礎研究·

NAPP/PS1雙轉基因小鼠行為學表現(xiàn)及遠志皂苷對其調控作用

興桂華 柏青楊 弓 箭 叢 歡 董海影

(齊齊哈爾醫(yī)學院臨床病理診斷中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 觀察APP/PS1雙轉基因小鼠記憶功能障礙的行為學表現(xiàn)和遠志皂苷對其學習記憶能力的保護作用。方法 將3月齡APP/PS1雙轉基因小鼠隨機分為模型組、鹽酸多奈哌齊組、TEN低、中、高劑量組(18.5、37、74 mg·kg-1·d-1)，選同月齡C57BL/6小鼠為對照組。采用Morris水迷宮法和新物體識別試驗檢測小鼠的學習記憶能力，采用實時定量PCR及Western印跡方法檢測海馬神經元Bcl-2、Bax和Caspase-3表達水平。結果 與模型組相比，TEN各劑量組小鼠學習記憶能力明顯改善(P<0.05)；與模型組相比，TEN各劑量組Bax和Caspase-3表達水平明顯下降(P<0.05)，而Bcl-2表達水平顯著升高(P<0.05)。結論 TEN可改善小鼠的學習記憶功能，其途徑可能是通過上調Bcl-2表達，下調Bax表達，調節(jié)Bcl-2/Bax的平衡比值，降低Caspase-3表達來實現(xiàn)。

遠志皂苷；APP/PS1雙轉基因；學習記憶

阿爾茨海默病(AD)臨床主要表現(xiàn)為進行性記憶、學習和認知能力的喪失，主要病理特征為大腦皮層和海馬區(qū)的老年斑沉積，神經原纖維纏結和大量神經元的喪失等。在AD的發(fā)生發(fā)展過程中，凋亡是其神經元死亡的主要形式〔1〕，神經細胞過度凋亡是造成神經元丟失的主要原因。遠志皂苷(TEN)是益智健腦中藥遠志中的主要活性成分，現(xiàn)代藥理研究表明其具有改善記憶、抗氧化、抗衰老和抗癡呆等作用〔2～4〕。本實驗旨在探討TEN改善AD小鼠學習記憶能力的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品 TEN由南京景竹生物科技有限公司提供(CAS：JZ20160327A)，經HPLC測定純度≥98%；鹽酸多奈哌齊由衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司制造，產品批號110917A。

1.2 動物 APP/PS1雙轉基因小鼠(南京生物醫(yī)藥研究院，編號D000268)，3月齡雄性，50只；C57BL/6J小鼠，3月齡，雄性，10只。飼養(yǎng)于齊齊哈爾醫(yī)學院實驗動物中心SPF級飼養(yǎng)室。

1.3 主要試劑及儀器 YBR?ExScriptTMRT-PCR kit(Perfect Real Time)為TAKARA公司產品，RNAiso Reagent為TAKARA公司產品，DEPC為瑞興化學產品。Bcl-2、Bax及Caspase-3多克隆抗體購于美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體購于北京博奧森生物技術公司。2700型PCR System擴增儀為Applied Biosystems公司產品。ABI7300熒光定量PCR儀為美國ABI公司產品。

1.4 方法

1.4.1 動物分組 APP/PS1雙轉基因小鼠經適應性飼養(yǎng)1 w后完全隨機分組為模型組、鹽酸多奈哌齊組(0.33 mg/kg)，TEN低、中、高劑量組(18.5、37、74 mg/kg)，選同月齡C57BL/6小鼠為對照組，對照組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃90 d。

1.4.2 Morris水迷宮實驗 給藥結束后進行Morris水迷宮行為測試。水迷宮為一直徑150 cm，高60 cm的不銹鋼圓形水池，內置有機玻璃平臺，平臺高40 cm，底面為6 cm×10 cm。在東、西、南、北水池壁部位分別標明入水點。將平臺放在西南象限正中距池壁22 cm處，迷宮中含牛奶液面高于安全平臺1 cm，池內水溫(22±1)℃，水中加入奶粉使水呈乳白色以防動物看到水下平臺，訓練期間環(huán)境安靜，迷宮外參照物不變。

Morris水迷宮實驗前5 d為定位航行試驗：每天將小鼠從東入水點頭朝池壁放入水池，4次/d。訓練時隨機選擇1個入水點，將小鼠面向池壁放入水中，每次訓練間隔為60 s。由頂部的紅外攝像頭記錄小鼠找到水下平臺的時間(逃避潛伏期)、游泳距離和軌跡，設定2 min為最長逃避潛伏期，2 min后自動停止記錄。實驗第6天為空間探索試驗：定位航行試驗結束后將水下平臺撤除，在同一入水點將大鼠面向池壁放入水中，讓大鼠在無平臺情況下尋找記憶中的平臺，記錄在2 min內跨過原平臺位置的次數。

1.4.3 新物體識別實驗 檢測箱由黑色聚酯塑料材質構成的60 cm×40 cm×80 cm的封閉箱，箱左右內側壁鑲嵌LED燈條，頂部懸掛攝像頭觀察動物的活動情況及探索過程。

實驗檢測過程分為適應期、熟悉期和測試期3個階段，(1)適應期：每天將小鼠依次放入檢測箱內，熟悉環(huán)境10 min為期3 d；(2)熟悉期：第4天，將兩個完全相同的正方體紅色積木塊放入檢測箱內對稱的位置處，兩個積木距離箱側壁與箱后壁的距離均為10 cm，將小鼠放入熟悉5 min；(3)測試期：間隔30 min后將其中一個紅色積木替換為大小相近的綠色圓柱形積木，將小鼠放入檢測箱內，記錄5 min內小鼠對新穎物體即綠色圓柱形積木(TN)和紅色正方體即熟悉物體(TF)的探索時間，以小鼠鼻尖距被識別物體的距離不超過2 cm或用鼻子接觸到被識別物體為探究行為。應用認知指數(RI)來評價動物的學習記憶能力，計算公式為RI=TN/(TN+TF)×100%。

1.4.4 實時定量PCR檢測小鼠海馬組織Bcl-2、Bax及Caspase-3的mRNA表達 按RNAiso Reagent操作說明書提取小鼠海馬組織總RNA，紫外分光光度計分析后用瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的純度、濃度及完整性。逆轉錄反應：逆轉錄反應在2700型PCR System擴增儀上進行，按SYBR?ExScriptTMRT-PCR Kit轉錄反應試劑盒方法操作，反應參數如下：反轉錄反應42℃ 15 min，反轉錄酶失活反應95℃ 2 min。PCR反應：PCR反應采用SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time) kit試劑。引物由TaKaRa公司設計合成，引物序列如下：Bcl-2：上游引物序列為5′-TGA ACC GGC ATC TGC ACA C-3′；下游引物序列為5′-CGT CTT CAG AGA CAG CCA GGA G-3′。Bax：上游引物序列為5′-AGA CAC CTG AGC TGA CCT TGG AG-3′；下游引物序列為5′-GTT GAA GTT GCCATCAGCAAACA-3′；Caspase-3：上游引物序列為5-GAGACAGACAGTGGAACTGACGATG-3，下游引物序列為5-GGCGCAAAGTGACTGGATGA-3。GAPDH：上游引物序列為5′-GAC AAC TTT GGC ATC GTG GA-3′；下游引物序列為5′-ATG CAG GGA TGA TGT TCT GG-3′。反應條件如下：預變性，95℃，10 s (1個循環(huán))。PCR反應，95℃，5 s；60℃，31 s(40個循環(huán))。反應結束后，使用Sequence Detection software version1.2.3軟件(Applied Biosystems公司)分析PCR過程個檢測樣本的Ct(Threshold cycle)值。

1.4.5 Western印跡檢測小鼠海馬組織Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表達 取每組小鼠各5只，待行為學測試結束后，迅速將小鼠斷頭取出腦組織進行總蛋白的提取，采用BCA法對樣品蛋白質濃度進行檢測，取出蛋白質50 μg加入2×SDS凝膠加樣緩沖液中，放置在水浴鍋中煮沸5 min以致使蛋白質變性，經10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h分離樣品。在70 mA恒流狀態(tài)下使膠中蛋白質4℃冰箱過夜，之后經電泳轉移至硝酸纖維素膜上，在5%脫脂奶粉中37℃封閉2 h。加入Bax、Bcl-2和Caspase-3一抗，4℃冰箱過夜。加入二抗37℃孵育，搖振2 h。利用Western印跡熒光發(fā)光檢測試劑盒發(fā)光、顯影、定影。晾干、拍照并進行圖像分析。在Western印跡分析中，分別以對照組Bcl-2、Bax和Caspase-3雜交帶的積分光密度值為相對值，其他各組雜交帶的積分光密度值均與對照組雜交帶的積分光密度值相比，最后得出相對值。為了避免不同批次雜交的條件差異所致顯色長短不一的誤差，故采用相對值進行半定量分析各組的表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件對數據進行統(tǒng)計學分析，數據的組間比較行t檢驗。

2 結 果

2.1 TEN對APP/PS1 雙轉基因小鼠學習記憶能力的影響

2.1.1 Morris水迷宮實驗結果 第5天定位航行實驗檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比模型組小鼠在第三象限停留時間(RTQ)與跨越隱匿平臺的次數明顯減少，而逃逸潛伏期延長，入水朝向角度明顯增加(均P<0.05)；與模型組相比，鹽酸多奈哌齊組和TEN 各劑量組的RTQ與跨越隱匿平臺的次數明顯增加，逃逸潛伏期均明顯縮短，入水朝向角度明顯減小(均P<0.05)。見表1，圖1。

表1 各組小鼠空間學習記憶能力

與對照組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05；下表同

圖1 各組小鼠定位航線實驗軌跡圖

2.1.2 新物體識別實驗檢測結果 與對照組〔(75.94±19.59)%〕相比，模型組小鼠RI〔(47.04±10.77)%〕顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，鹽酸多奈哌齊組〔(69.49±17.25)%〕和TEN 高劑量組〔(68.87±13.11)%〕明顯增加(P<0.05)。另外低劑量組為(60.72±19.84)%，中劑量組為(65.45±15.06)%。

2.2 TEN對APP/PS1 雙轉基因小鼠Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA表達的影響 與對照組比較，模型組Bax和Caspase-3 mRNA的表達明顯升高，而Bcl-2 mRNA 表達明顯降低(均P<0.05)；與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組和TEN各劑量組Bax和Caspase-3 mRNA表達均明顯降低且Bcl-2 mRNA表達呈現(xiàn)升高趨勢(P<0.05)。見表2。

2.3 TEN對APP/PS1 雙轉基因小鼠Bcl-2、Bax和Caspase-3 蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組Bax和Caspase-3蛋白表達明顯升高(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，TEN各劑量組Bax和Caspase-3的蛋白表達均明顯降低且Bcl-2蛋白表達呈現(xiàn)升高趨勢(均P<0.05)。見表2、圖2。

表2 TEN對APP/PS1 雙轉基因小鼠Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA和蛋白表達的影響

A：對照組；B：模型組；C：鹽酸多奈哌齊組；D：TEN 低劑量組；E：TEN中劑量組；F：TEN高劑量組圖2 Bax、Bcl-2和Caspase-3的Western印跡檢測結果

3 討 論

AD是一種神經退行性疾病，病理特征為老年斑、神經原纖維纏結及神經元變性或凋亡，其行為學改變表現(xiàn)為學習記憶功能障礙和進行性癡呆等。學習記憶障礙是AD主要臨床癥狀和特征，因此對學習記憶進行評價是觀察AD模型及藥物治療效果的重要指標之一〔5〕。Morris水迷宮實驗是一種讓實驗動物學習尋找不透明水中隱藏平臺的過程，主要應用于檢測大鼠空間學習記憶功能，是國內外公認的檢測大鼠空間學習記憶理想而有效的測試方法〔6〕。應用于AD 研究的動物模型很多，APP/PS1雙轉基因小鼠模型能夠較好的模擬AD 患者的早期病理和行為特征，是目前國內外比較公認的AD轉基因動物模型之一〔7，8〕。本實驗結果表明經90 d 的TEN治療能夠改善AD模型小鼠的空間學習記憶能力，同時經過TEN治療后轉基因小鼠能夠記住站臺的位置，空間記憶能力明顯提高。物體識別實驗是一種評價動物非空間工作識記憶能力的簡單靈敏的方法〔9〕。

現(xiàn)已證實，AD神經細胞凋亡與Bcl-2基因家族關系密切，其中Bax是一種重要的促進細胞凋亡的基因，Bax蛋白作為線粒體膜上離子通道的組成成分使Cyt-c得以穿過線粒體膜，Cyt-c的釋放可看作是凋亡途徑中的始動因素，其促使Caspase-9被激活，在凋亡途徑中具有重要作用〔10〕。Bcl-2 具有抑制細胞凋亡的作用，通過干擾Cyt-c 的釋放而阻斷上游Caspase 蛋白酶的激活，抑制細胞的凋亡〔11〕。正常情況下Bcl-2和Bax在細胞內保持平衡狀態(tài)，二者表達蛋白水平的相對比例是凋亡發(fā)生的決定性因素。因此，Bcl-2和Bax基因或蛋白?？勺鳛檠芯康蛲龅奶卣餍灾笜?。當Bcl-2的過度表達可與Bax構成異源二聚體而抑制細胞凋亡，Bax過量時形成Bax-Bax同源二聚體也可促進細胞凋亡。Caspase 家族是哺乳動物細胞凋亡的啟動者和執(zhí)行者，與Bcl-2 家族基因共同參與了線粒體介導的內源性細胞凋亡途徑，其中 Caspase-3是介導細胞凋亡的核心、最關鍵的凋亡蛋白酶〔12〕。細胞凋亡早期時凋亡信號可激活 Caspase-3，而激活Caspase-3后可使細胞核、細胞質及細胞骨架的參與凋亡所必需的重要蛋白質降解失活〔13，14〕。

TEN是益智健腦中藥遠志中的主要活性成分，現(xiàn)代藥理研究表明其具有改善記憶、抗氧化、抗衰老和抗癡呆等作用。本實驗結果表明，TEN對APP/PS1 雙轉基因小鼠學習記憶障礙有較好的改善作用，其機制可能是TEN上調Bcl-2蛋白表達，下調Bax蛋白表達，調節(jié)Bcl-2 /Bax 的平衡比值，使線粒體結構得以保護，進而阻止Cyt-c 經線粒體間隙外漏到細胞質內，阻抑Caspase-3啟動凋亡級聯(lián)瀑布反應發(fā)生，從而阻斷內源性細胞凋亡通路，最終發(fā)揮其抗細胞凋亡作用。

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〔2017-01-16修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)

國家自然科學基金青年基金項目(No.81403131)

董海影(1982-)，女，博士，講師，主要從事神經精神疾病的病理學研究。

興桂華(1969-)，女，碩士，教授，主要從事病理學研究。

R745.1

A

1005-9202(2017)13-3121-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.001