L e t-7c-1對戊四氮致癇大鼠學習記憶功能的作用☆

廖亞云劉夕霞黃逸青廖宇晗吳原○☆

·論著·

L e t-7c-1對戊四氮致癇大鼠學習記憶功能的作用☆

廖亞云*劉夕霞△黃逸青※廖宇晗*吳原*○☆

目的研究let-7c-1對戊四氮（pentylenetetrazol，PTZ）致癇大鼠學習記憶功能的影響，探討其可能機制。方法通過PTZ腹腔注射SD雄性大鼠建立慢性癲癇模型，隨機分為癲癇組、干預對照組、let-7c-1激動劑組，各組12只，另設(shè)12只大鼠為正常組。28 d后，觀察各組大鼠的行為學變化，let-7c-1基因表達及大鼠海馬組織中Bcl-2、Caspase3蛋白的表達。結(jié)果與正常組相比，癲癇組大鼠逃避潛伏期延長、穿越平臺次數(shù)減少、在目標象限的總路程縮短，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；癲癇組與干預對照組相比，逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)、在目標象限的總路程無統(tǒng)計學差異（P>0.05）；與干預對照組相比，let-7c-1激動劑組逃避潛伏期明顯延長，穿越平臺次數(shù)減少、在目標象限的總路程縮短，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。干預對照組與let-7c-1激動劑組let-7c-1基因相對表達量分別為（1.35±0.32）、（62.53±21.01）（F=50.97，P<0.05）。癲癇組let-7c-1基因表達量高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。let-7c-1激動劑組let-7c-1基因表達量明顯高于干預對照組、癲癇組及正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與正常組相比，癲癇組的Bcl-2蛋白表達減少，Caspase3蛋白表達增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；癲癇組與干預對照組相比，Bcl-2蛋白及Caspase3蛋白的表達無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。與干預對照組相比，let-7c-1激動劑組Bcl-2蛋白表達明顯減少，Caspase3蛋白表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論Let-7c-1可能通過減少海馬組織Bcl-2蛋白及增加Caspase-3蛋白表達使PTZ致癇大鼠的學習記憶功能受損。

癲癇學習記憶功能凋亡

研究表明一些在腦及血液中特異表達的microRNA參與癲癇、腦卒中引起的大鼠海馬損傷[1]。MicroRNA與記憶障礙密切相關(guān)[2]，可通過影響神經(jīng)元的發(fā)生和發(fā)育調(diào)控大鼠的學習和記憶功能[3]。let-7是mircroRNAs的重要成員，研究發(fā)現(xiàn)在難治性癲癇患者腦組織中l(wèi)et-7c基因表達上調(diào)[4]。我們在對PTZ致癇大鼠記憶障礙的前期研究也發(fā)現(xiàn)let-7c-1表達明顯上調(diào)[5]。一項對阿爾茨海默病的研究發(fā)現(xiàn)let-7c通過上調(diào)BACE2分泌酶減少Аβ的生成[6]，癲癇伴阿爾茨海默病的患者其認知功能障礙的發(fā)生有著共同的microRNA異常表達基礎(chǔ)[7]。let-7與癲癇相關(guān)，是否同時對認知功能有影響，我們尚不清楚。本實驗擬采用PTZ致癇大鼠模型，探討let-7c-1對PTZ致癇大鼠學習記憶功能的作用。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型建立SD成年雄性大鼠，體重約220～240 g，由廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供（實驗動物通過倫理委員會審核）。將大鼠隨機分為4組：正常組（腹腔注射生理鹽水）、癲癇組（腹腔注射PTZ）、干預對照組（腹腔注射PTZ+側(cè)腦室注射let-7c-1-3 p agomir control）、let-7c-1激動劑組（腹腔注射PTZ+側(cè)腦室注射let-7c-1-3 p agomir），每組12只。造模成功后，立即進行水迷宮實驗。水迷宮實驗后第2天每組各隨機取6只大鼠的新鮮腦組織用于PCR實驗，另外6只經(jīng)多聚甲醛心臟灌注后取海馬組織制作成石蠟切片，用于免疫組化實驗。

1.2 癲癇動物造模的給藥方式取SD大鼠，腹腔注射PTZ（美國Sigma公司，生理鹽水配置成10 mg/mL）60 mg/kg后觀察大鼠行為20 min，根據(jù)Racine分級標準[8]進行觀察及記錄，選擇IV～V級致癇大鼠作為癲癇動物模型組。將大鼠麻醉固定在立體定位儀上，參照大鼠腦立體定位圖譜[9]定位大鼠右側(cè)側(cè)腦室，暴露前囟，以前囟為原點往后0.8 mm，中線向右旁開1.3mm，用5mL注射器針頭鉆開顱骨，硬膜下3.7mm，用10μL微量注射器將let-7c-1-3 p agomir control、let-7c-1-3 p agomir、（廣州市銳博生物科技有限公司，生理鹽水配置成1 nmol/5μL）以1μL/5min速度泵入干預對照組，let-7c-1激動劑組大鼠側(cè)腦室，劑量為每只1 nmol，注射后留針10min緩慢退出，消毒、縫合。隨后用PTZ（35 mg/kg）腹腔注射點燃，觀察20min，隔天1次，共14次，持續(xù)28 d。取期間連續(xù)4次發(fā)作達II級或2次發(fā)作達IV～V級作為慢性癲癇模型[5]。

1.3 M orris水迷宮實驗Morris水迷宮[10]由定位航行實驗及空間探索實驗組成，共6 d，分析大鼠的學習和記憶功能。其中定位航行實驗歷時5 d，記錄90 s內(nèi)找到平臺的時間（即逃避潛伏期）?？臻g探索試驗在第6天撤去平臺時進行，記錄90 s內(nèi)穿越原平臺次數(shù)和在目標象限（原平臺象限）的總路程。

1.4 RT-PCR熒光定量實驗實驗步驟：①總RNA的提取和CDNA的合成：冰上分離海馬組織，用Trizol reagent提取總RNA，分光光度儀測定所提RNA純度及完整性；參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶生物工程大連有限公司）說明書對CDNA的合成進行操作，反應(yīng)體系20μL，將反轉(zhuǎn)錄的CDNA冰上冷卻后，-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。②RT-PCR反應(yīng)：選擇SYBR染料法，在ABI7500型熒光定量PCR儀（型號：Applied Biosystems AB）進行RTPCR反應(yīng)，以U6基因（大連寶生物工程有限公司）作為對照基因。具體反應(yīng)體系按說明書操作。分析觀察RT-PCR的擴增和融解曲線，用相對定量2-ΔΔCt分析大鼠海馬組織中l(wèi)et-7c-1的相對表達量。

1.5 免疫組織化學①將大鼠腦組織制作成4μm厚石蠟切片；②采用SP法（SP試劑盒北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司）：經(jīng)脫蠟、脫水、高壓抗原修復、血清封閉后，滴加一抗Bcl-2（稀釋度1:100）（英國abcam公司）或者一抗Caspase3（稀釋度1: 300）（santa公司），置于37℃濕盒內(nèi)過夜（12～16 h），復溫、清洗，滴加通用型兔抗羊二抗，PBS清洗，滴加辣根酶標志鏈霉素卵白素孵育15 min，DAB顯色，蘇木精復染，浸泡返藍，中性樹膠封片；③在高倍鏡（40×10）（日本奧林巴斯有限公司）下隨機選取6個不同視野觀察并拍照，采用IPP軟件進行半定量分析，檢測陽性細胞的平均熒光密度值。

1.6 統(tǒng)計學方法采SPSS16.0進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)結(jié)果以±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著性差異法進行，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 模型建立癲癇動物模型腹腔注入PTZ后約4min出現(xiàn)面部抽搐，隨后出現(xiàn)單肢、多肢抽搐、全身強直、跌倒等癥狀，持續(xù)時間約1～3min。造模的SD大鼠共有42只，36只造模成功，86％大鼠出現(xiàn)癲癇樣癥狀并達Ⅳ～Ⅴ級發(fā)作，點燃期間100％大鼠連續(xù)4次發(fā)作達II級或2次發(fā)作達IV～V級。正常組腹腔注入生理鹽水后無癇性發(fā)作。

2.2 大鼠M orris水迷宮檢測結(jié)果在定位航行實驗中，隨著訓練時間延長，各組的逃避潛伏期逐漸縮短，大鼠的記憶能力越強。水迷宮試驗結(jié)果見表1、表2。癲癇組大鼠的學習記憶功能較正常組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；經(jīng)側(cè)腦室注射let-7-1激動劑，大鼠的學習記憶功能較干預對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。實驗表明過表達let-7-1可使PTZ致癇大鼠學習記憶功能受損。

2.3 let-7c-1基因表達采用熒光定量PCR對let-7c-1基因表達進行檢測，結(jié)果顯示正常組、癲癇組、干預對照組、let-7-1激動劑組的let-7c-1基因相對表達量分別是：1.00±0.00、1.48±0.32、1.35±0.32、62.53±21.01（F=240.43，P<0.05）。let-7 c-1激動劑組let-7c-1基因的表達均比正常組、癲癇組及干預對照組高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；實驗溶解曲線及擴增曲線見圖1。

2.4 Bcl-2、Caspase3蛋白表達各組大鼠Bcl-2和Caspase3蛋白的表達見圖2。Bcl-2蛋白主要在神經(jīng)元胞漿內(nèi)表達，Caspase3蛋白在神經(jīng)元胞漿及胞核都有表達。各組Bcl-2蛋白的相對表達量分別為：0.1609±0.00608、0.1025±0.00529、0.1017± 0.00278、0.0607±0.00407（F=76.20，P<0.05）；Caspase3蛋白的表達量分別為0.0931±0.00234、0.1196±0.00221、0.1215±0.00276、0.1576±0.00165（F=35.70，P<0.05）。經(jīng)統(tǒng)計，Bcl-2蛋白光密度依次為：正常組>癲癇組>let-7c-1激動劑組，組間差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；Caspase3蛋白光密度依次為：正常組<癲癇組0.05）。

表1 不同時間點各組大鼠逃避潛伏期比較（s）（n=12）

表2 各組大鼠第6天時穿越平臺次數(shù)及在目前象限的總路程比較（n=12）

3 討論

圖1 左圖為各組R T-P CR實驗溶解曲線圖，U6及l(fā)e t-7c-1基因只有單峰，為特異性擴增；右圖為U6及l(fā)e t-7c-1基因擴增曲線圖：參考基因及目的基因擴增效率具有一致性

圖2 左圖大鼠海馬組織中B c l-2蛋白及C aspas e3蛋白表達情況（40×），A為正常組，B為癲癇組，C為干預對照組，D為le t-7c-1激動劑組；右圖表示與正常組相比，P＜0.05

癲癇患者存在不同程度的認知功能障礙。研究表明，microRNA表達和功能的異常與癲癇的學習、記憶障礙等疾病都有密切的關(guān)系。既往發(fā)現(xiàn)癲癇大鼠存在記憶障礙[11]。本實驗研究證實，與正常對照組比較，癲癇組學習記憶功能受損。我們前期研究[5]發(fā)現(xiàn)，在PTZ致癇大鼠認知功能障礙大鼠中l(wèi)et-7c-1過表達。本實驗通過建立PTZ致癇大鼠模型研究let-7c-1過表達對PTZ致癇大鼠認知功能的影響。結(jié)果表明，通過側(cè)腦室注射let-7c-1激動劑，可以使癲癇動物模型let-7c-1基因過表達；另外癲癇組let-7c-1基因表達量高于正常組。認知功能方面，與干預對照組相比，let-7c-1激動劑組學習記憶能力明顯下降。大鼠學習記憶能力下降趨勢與let-7c-1表達趨勢一致。結(jié)果提示過表達let-7c-1可使PTZ致癇大鼠的學習記憶功能損害。

研究證實在癲癇動物模型中存在海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象[12]。近來研究表明癲癇發(fā)作后部分神經(jīng)元凋亡由Bcl-2、Bax等凋亡基因調(diào)控。Bcl-2蛋白通過調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，最終抑制細胞凋亡。Caspase3是一種蛋白酶，其表達上調(diào)表明凋亡通路被激活，細胞死亡增加。本實驗通過制作慢性癲癇動物模型發(fā)現(xiàn)，癲癇組海馬組織細胞凋亡比正常組增多，Bcl-2蛋白表達明顯減少，Caspase3蛋白表達顯著增加，這與前期研究相一致。

經(jīng)相關(guān)實驗提示細胞凋亡受基因調(diào)控。let-7c在腦血管疾病、神經(jīng)免疫系統(tǒng)疾病等疾病中的表達明顯上調(diào)。LIU等[13]發(fā)現(xiàn)let-7在腦損傷后的高表達與細胞凋亡有關(guān)。在本實驗研究中，側(cè)腦室注射let-7c-1激動劑使let-7c-1在腦組織中過表達，發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡顯著增加，Bcl-2蛋白表達明顯減少，Caspase3蛋白表達顯著增加，研究證明在癲癇動物模型中，let-7c-1激動劑可通過減少Bcl-2蛋白表達，增加Caspase3蛋白表達導致海馬區(qū)凋亡增加。

研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2、Bcl-xl、Fas和Caspase-3蛋白等let-7家族的靶基因與凋亡相關(guān)[14-15]。細胞凋亡的線粒體通路是癲癇致神經(jīng)元損傷的重要途徑，既往發(fā)現(xiàn)Caspase3參與了癇性放電致神經(jīng)元凋亡的過程[16]，通過實驗結(jié)果分析我們推測let-7 c-1使癲癇大鼠的學習記憶功能受損與線粒體細胞凋亡途徑相關(guān)。但本實驗未進行細胞凋亡通路相關(guān)因子的檢測，有待進一步證實。

綜上所述，let-7c-1負向調(diào)節(jié)PTZ致癇大鼠的學習記憶功能，過表達let-7c-1可通過減少Bcl-2蛋白的表達和增加Caspase3蛋白表達使癲癇大鼠海馬組織的細胞凋亡增加。let-7c-1可能為癲癇致學習記憶功能障礙的一個干預靶點。

[1]LIU DZ,TIAN Y,ANDER BP,et al.Brain and blood microRNA expression profiling of ischemic stroke,intracerebral hemorrhage,and kainate seizures[J].JCereb Blood Flow Metab,2010, 30（1）:92-101.

[2]KONOPKA W,KIRYK A,NOVAK M,et al.MicroRNA loss enhances learning and memory in mice[J].JNeurosci,2010,30（44）:14835-14842.

[3]SCHRATTGM,TUEBING F,NIGH EA,et al.A brain-specific microRNA regulates dendritic spine development[J].Nature. 2006,439（7074）:283-289.

[4]劉曉婭.難治性癲癇腦組織miRNA表達差異[D].重慶醫(yī)科大學，2012.

[5]LIU X,WU Y,HUANG Q,et al.Grouping Pentylenetetrazol-Induced Epileptic Rats According to Memory Impairment and MicroRNA Expression Profiles in the Hippocampus[J].PLoSOne, 2015,10（5）:e0126123.

[6]孫秀蓮.Let-7 c對β-淀粉樣蛋白生成的影響.中華醫(yī)學會第十七次全國神經(jīng)病學學術(shù)會議論文匯編（上）[C].中華醫(yī)學會、中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會:2014:1.

[7]NELSON PT,WANGWX.MiR-107 is reduced in Alzheimer's disease brain neocortex:validation study[J].JAlzheimers Dis, 2010,21（1）:75-79.

[8]RACINERJ.Modification of seizure activity by electrical stimulation.II.Motor seizure[J]．Electroencephalogr Clin Neurophysiol, 1972,32（3）:281-294．

[9]WANG P,WANGWP,SUN Z,et al.Impaired spatial learning related with decreased expression of calcium/calmodulin-dependent protein kinase IIalpha and cAMP-response element binding protein in the pentylenetetrazol-kindled rats[J].Brain Res，2008,1238（6）:108-117.

[10]MORRISR GM.Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat[J].NeurosciMethods,1984, 11（1）:47-60.

[11]尹昱，趙文清，李文玲，等.低劑量伽瑪?shù)墩丈鋵Πd癇模型大鼠癲癇發(fā)作及認知功能的影響[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志,2010,36（8）:480-484.

[12]WANG L,LIU YH,HUANG YG,et al.Time-course of neu-ronal death in themouse pilocarpinemodel of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining[J].Brain Res,2008,1241（3）: 157-167.

[13]LIU G,KEELER BE,ZHUKAREVA V,et al.Cycling exercise affects the expression of apoptosis-associated microRNAs after spinal cord injury in rats[J].Exp Neurol,2010,226（1）:200-206.

[14]TOLONEN AM,MAGGA J,SZABO Z,et al.Inhibition of Let-7 microRNA attenuatesmyocardial remodeling and improves cardiac function postinfarction in mice[J].Pharmacol Res Perspect, 2014,2（4）:e00056.

[15]BARH D,MALHOTRA R,RAVIB,et al.MicroRNA let-7:an emerging next-generation cancer therapeutic[J].Curr Oncol, 2010,17（1）:70-80.

[16]HENSHALL DC,CHEN J,SIMON RP.Involvement of caspase-3-like protease in themechanism of cell death following focally evoked limbic seizures[J].JNeurochem,2000,74（3）:1215-1223.

The effects of let-7c-1 on the learning and memory of epileptic rats induced by PTZ.

LIAO Yayun,LIUXixia,HUANG Yiqing,LIAO Yuhan,WU Yuan.Department of Neurology,the First Affiliated Hospital,Guangxi Medical University,Nanning 530021,China.Tel:0771-5356504.

Objective To explore the effect of let-7c-1 on the learning and memory of PTZ-induced epileptic rats and its relevantmechanism.Methods A model of temporal lobe epilepsy(TLE)was induced via PTZ kindling in SD male rats.The epileptic rats were divided into epilepsy group,agomir-control group,let-7c-1 agomir group(12 rats for each).Twelve rats were served as a negative control group.The behavior and the expression levesl of let-7c-1,Bcl-2 protein and Caspase3 were evaluated at 28 days following PTZ.Results Compared to the negative group, the escape latency of epilepsy group was prolonged and the crossing times as well as the quadrant total distance in the target were reduced(P<0.05).However,those parameters were not significantly different between the epilepsy groupand the agmoir-control group(P＞0.05).Compared to the agmoir-control group,the escape latency of let-7c-1 agomir group was prolonged and the crossing times as well as the quadrant total distance in the target were reduced(P＜0.05).The expression levels of let-7c-1 and let-7c-1 were 1.35±0.32 in agmoir-control group and 62.53±21.01 in agomir group（F=50.97，P＜0.05）.The expression levels of let-7c-1 were higher in let-7c-1 agomir group than in other groups（P＜0.05）.Compared to the negative group,the expressions of Bcl-2 protein in other groups were decreased(P＜0.05)and the Caspase3 protein were increased(P＜0.05).Compared to the agomir-control group,the expression of Bcl-2 protein was significantly decreased and the expression of Caspase3 protein was significantly increased in let-7c-1 agomir group(P＜0.05).Conclusions The present study shows that let-7c-1 may impair the learning and memory of PTZ-induced epileptic rats through decreasing the Bcl-2 protein and increasing Caspase3 protein in the hippocampus.

Epilepsy Learning andmemory Apoptosis

R742.1

A

2016-08-27）

（責任編輯：李立）

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.04.010

☆國家自然科學基金（編號：81360201）

*廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（南寧530021）

△廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院康復醫(yī)學科

※廣西貴港市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

○☆通信作者（E-mail:wuyuan90@126.com）