高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測法測定消渴丸中黃芪甲苷的含量

李 培

(聊城市藥品檢驗所，山東 聊城 252000)

消渴丸是由葛根、黃芪、地黃、天花粉等八味藥組成，滋腎養(yǎng)陰，益氣生津。用于氣陰兩虛型消渴?。?］?，F(xiàn)行標準收載于《中國藥典》2010年版(一部)中，因其是自主知識產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)品，處方中未注明各味藥的使用量，而黃芪同地黃同為處方中的君藥，起到滋腎養(yǎng)陰、益氣生津止渴的功效，故對黃芪中的主要成分黃芪甲苷進行含量測定的研究。經(jīng)過反復(fù)試驗，研究制定了合理的供試品溶液制備方法及測定的色譜條件，建立了高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測法測定消渴丸中黃芪甲苷含量的方法，該方法操作簡便，重現(xiàn)性好，可作為消渴丸的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);PL－ELSD 2100蒸發(fā)光散射檢測器(北京綠綿巨貿(mào)科貿(mào)有限公司);BT 125D電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);Millipore Elix10純水機(密理博中國有限公司)。

1.2 試藥 黃芪甲苷對照品(由中國食品藥品檢定研究院提供，批號:110718－200613);消渴丸(廣州白云山中一藥業(yè)有限公司，批號:S01237、R03111、R02280)，陰性樣品為自制;乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 準確稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成濃度為0.2mg·mL－1的溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備 取藥品適量，研細，精密稱取5.0g，精密量取甲醇50mL，稱定重量，靜置過夜。再加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻濾過，精密量取續(xù)濾液25mL，蒸干，殘渣加水30mL使溶解，用水飽和的正丁醇萃取3次，每次30mL，合并正丁醇液，加氨試液洗滌3次，每次30mL，棄去氨試液。蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 陰性供試品溶液的制備 精密稱取缺黃芪的陰性樣品5.0g，照供試品溶液制備項下方法操作，制備陰性供試品溶液。

2.4 色譜條件及系統(tǒng)適用性 色譜柱:Thermo－C18(4.6mm ×250mm，5μm);流動相:乙腈－水(32∶68);流速:1.0mL·min－1;ELSD 參數(shù):氣體流速為1.60mL·min－1，漂移管溫度為80℃;進樣量:20μL。理論塔板數(shù)按黃芪甲苷計算應(yīng)不低于4000。分別吸取黃芪甲苷對照品溶液、供試品溶液、陰性供試品溶液，按上述色譜條件進樣。結(jié)果表明，供試品在與對照品對應(yīng)位置上出現(xiàn)色譜峰，且供試品色譜中基線平穩(wěn)，分離度良好;陰性供試品在該位置上無色譜峰出現(xiàn)。提示本方法測定黃芪甲苷不受雜質(zhì)干擾，色譜詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1”項下對照品溶液 5、8、15、10、20μL，注入色譜儀，測定峰面積。以峰面積常用對數(shù)(Y)為縱坐標，進樣量(X)常用對數(shù)為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程Y=1.6449X+2.2032，r=0.9998(n=5)。結(jié)果表明，黃芪甲苷進樣量在1.016～4.064 μg之間進樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗 精密吸取“2.1”項下對照品溶液，重復(fù)進樣6次，每次10μL，以6次測定的峰面積計算，RSD為1.0%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.7 重現(xiàn)性試驗 取同一批號消渴丸樣品，按“2.2”項下供試品溶液制備方法，分別制備6份供試品溶液，并測定其中黃芪甲苷的含量，以6個含量測定結(jié)果計算，RSD為1.1%。結(jié)果表明，本試驗方法重現(xiàn)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 精密吸取重復(fù)性試驗項下供試品溶液，分別在0、2、4、8、16、24 h 注入色譜儀測定，以各次測定的峰面積計算，RSD為0.9%。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 回收率試驗 取同一批號已知含量的樣品9份，分別按樣品中黃芪甲苷含量的80%、100%、120%加入一定量的對照品溶液，各制備3份供試品溶液。按“2.10”項下方法分別測定黃芪甲苷的含量，結(jié)果詳見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果

2.10 樣品含量測定 取不同批號的3份樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別吸取黃芪甲苷對照品溶液10、20μL與供試品溶液20μL注入色譜儀，以外標兩點法計算含量，結(jié)果詳見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 該處方中藥味相對復(fù)雜，黃芪在其處方中為臣藥，可益氣生津改善糖尿病的主要癥狀，而且是原粉入藥，干擾的因素比較少，而黃芪甲苷為黃芪的主要成分，故選擇建立黃芪甲苷的含量測定方法利于控制本品質(zhì)量。

3.2 由于黃芪甲苷在紫外末端有吸收，采用紫外檢測器有較大的干擾，基線漂移或噪音過大影響黃芪甲苷含量測定的準確性。而蒸發(fā)光散射檢測器是一種質(zhì)量型檢測器，與物質(zhì)本身的光譜吸收無關(guān)，所以本方法采用蒸發(fā)光散射檢測器測定黃芪甲苷［2，3］。

3.3 供試品提取過程中采用了索氏提取和超聲提取的方法做了對比，在同樣靜置一夜的前提下，超聲提取的方法有效成分提取的不夠完全，索氏提取與普通回流提取無明顯差別，但索氏提取浪費試劑，而且操作繁瑣，故采用了靜置一夜回流提取1 h的方法。

3.4 采用高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測法測定消渴丸中黃芪甲苷的含量，該方法操作簡便、快速、準確、重現(xiàn)性好，可作為本制劑的質(zhì)量控制。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(一部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:1041－1042.

［2］施佳平，劉洪江.高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測法測定芪黃膠囊中黃芪甲苷的含量［J］.中國藥房，2006，17(13):1013 －1014.

［3］李濤，郝武常，徐長根，等.HPLC－ELSD法測定不同產(chǎn)地女貞子中齊墩果酸與熊果酸的含量［J］.中藥材，2005，28(5):391 －393.