成熟油菜種子RNA提取方法的改良

摘要 [目的]從成熟油菜種子中抽提出高質(zhì)量的RNA。[方法]該研究通過(guò)將天根植物總RNA提取試劑盒與康為世紀(jì)植物總RNA提取試劑盒相結(jié)合，使用β-巰基乙醇抑制酚類物質(zhì)氧化，DNA酶去除DNA，并采用吸附柱有效去除多糖類物質(zhì)等措施，對(duì)油菜種子RNA的提取方法進(jìn)行有效改進(jìn)。[結(jié)果]采用該方法能提取出質(zhì)量高且完整性好的RNA，可一次滿足后續(xù)分子生物學(xué)研究的要求。[結(jié)論]該研究提出了一種高效快捷的成熟油菜種子RNA提取方法。

關(guān)鍵詞 油菜；成熟種子；RNA提取

中圖分類號(hào) S565.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）13-0143-02

Improvement of RNA Extraction Method from Mature Rapeseeds

GU Si-kai1，2，CHEN Gui-min2，ZHAO Wen-jun2，JI Li-lian1，2* et al

（1.College of Food Science and Engineering， Yangzhou University， Yangzhou， Jiangsu 225127；

2.Jiangsu Collaborative Innovation Center of Ragional Modern Agriculture and Enverinment Protection， Jiangsu Key Laboratory for Eco-agricultural Biotechnology around Hongze Lake， School of Life Science， Huaiyin Normal University， Huaian， Jiangsu 223300）

Abstract [Objective]To extract high quality RNA from mature rapeseeds.[Method]To improve the RNA extraction method of mature rapeseeds by using two RNA extraction kits， which include RNA plant plus reagent from TIANGEN and CW2598M from KANGWEI， meanwhile， adding β-mercaptoethanol to inhibit the oxidation of phenolic compounds and removing DNA by DNase， using the adsorption column to remove polysaccharides etc. [Result]This method can get RNA with high quality， which can satisfy the requirements of subsequent molecular biology research.[Conclusion]The study provides an efficient method for extracting RNA from mature rapeseeds.

Key words Rape；Mature seeds；RNA extraction

RNA提取技術(shù)不僅是分子生物學(xué)的重要組成部分，而且是功能基因組學(xué)的基礎(chǔ)[1]，提取高純度、高完整度的植物組織RNA是進(jìn)行基因克隆、RNA序列分析、狹線雜交以及構(gòu)建cDNA文庫(kù)研究的前提[2-3]。因此，如何快速高效地獲得高質(zhì)量的RNA成為科研人員關(guān)注的問(wèn)題。

油菜是世界四大油料作物之一，成熟油菜種子中含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)、色素、單寧、多酚等物質(zhì)，豐富的多酚類物質(zhì)在RNA提取過(guò)程中易形成沉淀并發(fā)生褐化反應(yīng)，同時(shí)抑制酶的活性等[4-5]。目前已經(jīng)報(bào)道的RNA提取方法主要包括Trizol法[6]、皂土法[7]、Licl-尿素法[8]、改進(jìn)SDS法[9]及CTAB法[10]等，這些方法都具有一定的局限性，特別對(duì)于次級(jí)代謝產(chǎn)物豐富、油脂及蛋白含量較高的材料，在總RNA提取過(guò)程中往往存在褐化、降解、低純度等現(xiàn)象[4，11-12]。針對(duì)目前油菜種子RNA提取存在的問(wèn)題，該研究在前期工作的基礎(chǔ)上[2]通過(guò)多次試驗(yàn)探索，提出了一種高效快捷的油菜種子RNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試油菜（甘藍(lán)型）播種于淮陰師范學(xué)院科技園，待油菜成熟晾曬后，剝出籽粒備用。

試驗(yàn)操作中所需的離心管、槍頭、玻璃瓶、量筒、研缽、研杵、藥匙等經(jīng)高溫高壓滅菌后用0.1%DEPC室溫浸泡處理24 h，再高溫高壓滅菌2次備用。電泳槽、制膠板、梳子等用3%過(guò)氧化氫溶液浸泡24 h，使用前分別用10%和0.1%的RNA酶固相清除劑先后處理5 min，最后用高壓滅菌的01%DEPC水清洗3次用于制膠。

RNA plant plus reagent植物總RNA提取試劑盒DP437-02（簡(jiǎn)稱天根試劑盒）購(gòu)自北京天根生化科技公司；β-巰基乙醇、50×TAE Buffer、RNase-Free ddH2O均購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司；康為世紀(jì)全能型植物RNA提取試劑盒CW2598M（簡(jiǎn)稱康為世紀(jì)試劑盒）、DNaseⅠ、固相清除劑、Gold View、DEPC水均購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 油菜種子總RNA提取方法

1.2.1 試劑盒提取RNA法。

采用的試劑盒分別為天根生化科技公司生產(chǎn)的植物總RNA提取試劑盒RNA plant plus reagent和康為世紀(jì)生物科技有限公司生產(chǎn)的全能型植物總RNA提取試劑盒CW2598M，操作方法分別按照各公司的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2 基于2種試劑盒改良法。

將天根試劑盒和康為世紀(jì)試劑盒相結(jié)合，并對(duì)試驗(yàn)步驟進(jìn)行優(yōu)化，具體步驟如下：

①取0.1 g成熟油菜種子放入已經(jīng)使用液氮預(yù)冷的研缽中，并迅速研磨成粉末狀；

②在低溫狀態(tài)下將粉末轉(zhuǎn)入至2 mL的離心管中，并迅速加入800 μL含有β-巰基乙醇的RNA plant plus reagent提取液，渦旋振蕩至徹底混勻，離心管平放靜置5 min；

③將離心管置于已預(yù)冷的4 ℃離心機(jī)中，12 000 r/min離心2 min；

④上清轉(zhuǎn)移至新的RNase-Free的2 mL離心管中，緩慢加入1/2體積的無(wú)水乙醇，顛倒數(shù)次至徹底混勻，將混合液和沉淀一起轉(zhuǎn)入康為世紀(jì)試劑盒自帶的吸附柱RM（Spin Columns RM with Collection Tubes）中；

⑤向吸附柱內(nèi)加入80 μL康為世紀(jì)試劑盒自帶的DNase Ⅰ 工作液，室溫下反應(yīng)5 min；

⑥向吸附柱內(nèi)加入康為世紀(jì)試劑盒自帶的Buffer RW1 350 μL，4 ℃12 000 r/min離心1 min，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中；

⑦向吸附柱內(nèi)加入康為世紀(jì)試劑盒自帶的Buffer RW2 500 μL，4 ℃12 000 r/min離心1 min，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中；

⑧將含有吸附柱的收集管重新放回到離心機(jī)，4 ℃12 000 r/min離心1 min，充分去除吸附在膜上的液體；

⑨吸附柱RM轉(zhuǎn)入到RNase-Free的2 mL離心管中，于膜的中間部位懸空滴加RNase-Free ddH2O 30～50 μL，室溫放置2 min；

⑩于4 ℃離心機(jī)中最大轉(zhuǎn)速離心1 min，所得液體即為RNA溶液。

1.3 總RNA純度及完整性檢測(cè)

1.3.1 分光光度法測(cè)定。用無(wú)RNase的水作為空白對(duì)照，取5 μL溶解后的總RNA，用無(wú)RNase的水稀釋50倍，加入到夾縫比色皿中，使用艾本德公司生產(chǎn)的核酸蛋白測(cè)定儀Biophotometer plus檢測(cè)樣品RNA的濃度及純度。

1.3.2 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。移取已經(jīng)溶解的RNA溶液5 μL于1%的瓊脂糖凝膠中，在150 V恒壓下電泳分離15 min，凝膠成像系統(tǒng)下觀察總RNA譜帶，以檢驗(yàn)RNA的完整性。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA濃度及純度測(cè)定結(jié)果

一般來(lái)說(shuō)，較純凈的RNA OD260/OD280為1.8～2.0，若比值低于1.7表明有蛋白或酚類物質(zhì)污染[13]。該研究將2個(gè)試劑盒結(jié)合并優(yōu)化后，從0.1 g油菜種子中提取到的總RNA約為50 μg，RNA產(chǎn)量為0.5 mg/g，核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定結(jié)果表明OD260/OD280介于18～2.0，由此可見(jiàn)，該方法提取的RNA純度和濃度較高，能夠滿足后續(xù)試驗(yàn)需要。

2.2 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

為了檢測(cè)提取的植物種子總RNA的完整性，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析，通過(guò)電泳圖譜可以看出使用不同方法提取的RNA完整性有較大差別，使用天根試劑盒提取所得的RNA電泳條帶彌散嚴(yán)重，而使用康為世紀(jì)試劑盒提取后所得到的條帶無(wú)明顯彌散，但18S rRNA降解嚴(yán)重（圖1），得不到完整的18S rRNA條帶。將2種試劑盒相結(jié)合，并對(duì)提取方法進(jìn)行優(yōu)化后，分離得到的RNA電泳檢測(cè)結(jié)果顯示28S RNA與18S RNA 條帶帶型完整、無(wú)彌散現(xiàn)象，且前者的亮度約為后者的2倍（圖2）。

上述結(jié)果說(shuō)明，采用2種試劑盒相結(jié)合的方法從成熟油菜種子中提取的總RNA具有較高完整性，無(wú)明顯降解現(xiàn)象，可以滿足從分子水平上對(duì)油菜種子相關(guān)基因進(jìn)行深入研究的需要，如構(gòu)建cDNA文庫(kù)、RNA印跡等。

3 討論與結(jié)論

作為重要的油料作物，油菜種子中含有大量的酚類、蛋白質(zhì)、多糖及一些目前仍無(wú)法確定的次級(jí)代謝產(chǎn)物等。這些物質(zhì)可與RNA結(jié)合并形成不溶于水的復(fù)雜混合物，該物質(zhì)能夠與RNA發(fā)生共聚合反應(yīng)，從而嚴(yán)重影響RNA的提取質(zhì)量。因此，獲得高純度高完整性RNA的關(guān)鍵是去除蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，同時(shí)有效防止酚類物質(zhì)氧化[14]，抑制外源和內(nèi)源RNA酶活性。作為構(gòu)建cDNA文庫(kù)、研究遺傳等分子生物學(xué)的基礎(chǔ)，RNA的完整性直接影響后續(xù)研究結(jié)果。目前常用的試劑盒雖具有操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但在油菜種子總RNA的提取過(guò)程中，存在酚類物質(zhì)抑制不完全、提取時(shí)間長(zhǎng)、蛋白類物質(zhì)去除不干凈等弊端，最終導(dǎo)致提取的RNA質(zhì)量和完整性偏低等現(xiàn)象，進(jìn)而影響后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行。

針對(duì)目前試劑盒提取RNA的弊端，該研究通過(guò)抑制內(nèi)源RNA酶及多酚類物質(zhì)、吸附蛋白質(zhì)、縮短提取時(shí)間等方法提高RNA的質(zhì)量和完整度。該方法選用天根總RNA提取試劑盒RNA plant plus reagent和康為世紀(jì)全能型植物RNA提取試劑盒CW2598M相結(jié)合，加入β-巰基乙醇來(lái)抑制酚類物質(zhì)氧化和內(nèi)源RNA酶的活性，康為世紀(jì)吸附柱和洗滌液有效吸附RNA并去除多糖類物質(zhì)，整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中盡量縮短抽提時(shí)間，控制在35 min以內(nèi)，有效降低了提取過(guò)程中的降解和損失，解決了高酚高油類種子樣品中RNA提取的技術(shù)難點(diǎn)。使用該方法抽提的RNA具有質(zhì)量高、完整性好等優(yōu)點(diǎn)，完全能滿足后續(xù)的全長(zhǎng)基因克隆、Northern雜交等分子生物學(xué)研究需求。

參考文獻(xiàn)

[1] 嚴(yán)明理，劉忠松，官春云，等.一種提取高質(zhì)量油菜種子和種皮RNA的方法[J].生物技術(shù)通報(bào)，2007（6）：97-100.

[2] 趙祥祥，劉福霞，唐瑭，等.成熟油菜次生休眠種子RNA的快速高效提取方法[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2013，34（1）：64-67.

[3] 丁勇，劉英，楊鴦鴦，等.油菜種子高質(zhì)量總RNA提取的一種有效方法[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，25（5）：465-468.

[4] 許本波，謝伶俐，嚴(yán)寒，等.甘藍(lán)型油菜籽粒RNA提取方法的探討[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（5）：18-20.

[5] FANG G，HAMMAR S，GRUMET R.A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA[J].Biotechniques，1992，13（1）：52-54，56.

[6] 任增凱，禹山林，楊慶利，等.花生種子總RNA提取的一種有效方法[J].花生學(xué)報(bào)，2008，37（3）：20-23.

[7] 張容，鄭彥峰，吳瑤，等.一種簡(jiǎn)單有效的植物RNA提取方法[J].遺傳，2006，28（5）：583-586.

[8] 趙雙宜，吳耀榮，夏光敏.介紹一種簡(jiǎn)單高效的植物總RNA提取方法[J].遺傳，2002，24（3）：337-338.

[9] 吳林，薛建平，徐有明，等.半夏葉片總RNA四種提取方法及效果的比較[J].中草藥，2008，39（6）：901-905.

[10] 程水源，陳昆松，杜何為，等.銀杏RNA的提取[J].果樹(shù)學(xué)報(bào)，2005，22（4）：428-429.

[11] 林玲，楊燕凌，何海福，等.總RNA提取方法的比較與分析[J].武夷科學(xué)，2009，25（1）：97-100.

[12] 孫海波，王智慧，劉學(xué)群，等.一種適用于油菜、大豆、花生、芝麻四種油料作物種子的RNA提取方法[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2012，34（4）：353-358.

[13] 劉進(jìn)元.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：清華大學(xué)出版社，2002：59-61.

[14] 史寶勝，卓麗環(huán).紫葉李葉片總RNA提取方法的改進(jìn)與比較[J].分子植物育種，2006，4（5）：721-725.