植物基因功能驗證技術概述

楊詩怡 周小利 陳志蕓

摘要 隨著生物學研究在分子水平上的不斷深入和推進，越來越多的基因得以發(fā)現(xiàn)并成功克隆，對基因功能的研究顯得日益重要，這也是后基因組時代功能基因組學的重要研究內(nèi)容。植物中存在的眾多基因發(fā)揮著不同的作用，控制著不同的合成途徑，基因各自發(fā)揮的功能對植物起著至關重要的作用?？偨Y了有關基因功能驗證技術方面的研究，并將常用于驗證基因功能的方法做一歸納，以便為后續(xù)的試驗研究提供生物學基礎。

關鍵詞 驗證；植物；基因；功能；技術

中圖分類號 S188+.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）34-0136-05

Abstract With the development and propulsion of biology at the molecular level， more and more genes were found and cloned successfully， the study of gene functions was increasingly important， it also was an important content of functional genomics in the postgenome era. There were a lot of genes playing different roles in plants， controlling the different routes of synthesis， the function of each gene played a crucial role to planting.This paper summarized the research on the technologies which verify the function of genes，and generalized about the usually used methods，in order to provide a biological basis for subsequent experimental study.

Key words Validation；Plant；Gene；Function；Technology

基因組學是一門重要的科學，主要作用是對所有基因進行基因組作圖、核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析，目的在于全面探究某個生物種的所有基因，以及所有基因產(chǎn)物構成的生理結構和生命活動[1]?；蚪M研究發(fā)展主要包括結構基因組學和功能基因組學。結構基因組學主要是通過建立生物體高分辨率遺傳、物理和轉(zhuǎn)錄圖譜以達到全基因組測序的目標[2]。功能基因組學利用結構基因組學提供的信息系統(tǒng)地研究基因功能，以功能鑒定為目標，代表基因分析的新階段[3-4]。功能基因組學常常被稱作后基因組學，主要對相關基因功能進行分析，使生物學對單一基因或單一蛋白質(zhì)的研究轉(zhuǎn)向?qū)Χ鄠€基因或多個蛋白質(zhì)的研究，達到同時進行全面研究的有效手段，其研究內(nèi)容涵蓋基因功能發(fā)現(xiàn)、基因表達分析和突變檢測[5-6]。近年來，越來越多物種的基因組測序工作完成，標志著生命科學研究已邁入功能基因組時代。基因功能研究的重要性日益凸顯，眾多新基因的功能有待分子生物學家鑒定[7]。正向遺傳學（forward genetics）和反向遺傳學（reverse genetics）是基因組研究的主要方法。正向遺傳學是通過突變表型及其遺傳規(guī)律克隆得到相關基因，確認其在染色體上的位置并進一步確定基因功能[8]，主要的技術手段是通過篩選天然或人工誘導的突變體，以此克隆目標基因，從而得到有相關功能的基因，研究自發(fā)或誘發(fā)突變體中某一突變性狀的遺傳行為是正向遺傳學的主要功能[9]。反向遺傳學是指依照突變基因的已知序列研究基因功能，運用反向遺傳學方法鑒定基因功能是基因組計劃由結構基因組學過渡到功能基因組學的必然要求[10-11]。

前人在基因功能驗證技術方面做了大量的研究及探索，包括過表達、RNA干擾和反義技術、插入突變、基因的定點誘變、基因轉(zhuǎn)導技術、基因敲除技術、基因陷阱、人工染色體轉(zhuǎn)導、基因誘捕技術等，該研究旨在歸納和總結植物基因功能研究的方法和研究進展，為后續(xù)深入開展植物基因功能驗證提供依據(jù)和參考。

1 過表達（Over expression）

過表達是指融合目的基因的全長序列與啟動子，通過遺傳轉(zhuǎn)化技術，獲得該基因產(chǎn)物大量積累的生物體，從而增加此基因在生理生化進程中的效應，并通過這效應引發(fā)的與正常植株在表型上的一系列差異來理解基因功能[12]。

基因過表達主要包括兩個步驟：過表達載體的構建以及過表達的實現(xiàn)，即通過轉(zhuǎn)基因手段使目的基因在轉(zhuǎn)化植株中實現(xiàn)過表達[13]。目前常用的過表達載體可分為組成型和誘導型[14]。通過這種方法，已成功探究出植物中眾多基因的功能，比如將逆境應答信號途徑中的基因轉(zhuǎn)化到植物，可通過轉(zhuǎn)化植物之間的表型差異來鑒定其基因功能，同時，逆境應答信號途徑的基因轉(zhuǎn)入植物后，能夠提高植物的抗逆性，更有助于遺傳相關基因的改良[15]。

2 RNA干擾和反義技術

研究植物基因功能的重要前提之一即是獲得突變體，而抑制相關基因的表達則是獲得突變體的一個有效途徑[16]。其中，RNA干擾和反義RNA是兩種代表性方法。

2.1 RNA干擾（RNA interference，RNAi）

雙鏈RNA誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象就是RNA干擾[17]。由于發(fā)夾狀RNA或21～23 nt的ds RNA與特異性 mRNA結合后，將導致靶基因降解，從而造成目的產(chǎn)物表達的下調(diào)，是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制[18-21]。其作用分為起始階段、效應階段和級聯(lián)放大階段。近年來，RNAi以其高特異性、高效性等優(yōu)勢已發(fā)展為研究基因功能的重要手段，作為生物體進化過程中抵御外來基因侵害的一種機制，其在穩(wěn)定基因組方面發(fā)揮了巨大作用[22]。

2.2 反義技術

反義技術是指根據(jù)堿基互補原理，通過利用人工或生物合成的特異互補的DNA或RNA片段，抑制目的基因表達[23]。包括反義寡核苷酸技術、反義RNA技術和核酶技術。

2.2.1 反義寡核苷酸技術（Antisense oligonucleotides，ASON）。

ASON是用一段人工合成的能與DNA或RNA互補結合的寡核苷酸鏈抑制基因表達，寡核苷酸片段長度多為15～30 nt，在堿基互補原理的過程中，通過調(diào)節(jié)基因的解旋、復制、轉(zhuǎn)錄以及mRNA的剪接與加工各個環(huán)節(jié)，達到影響基因輸出和翻譯的效果，從而調(diào)節(jié)細胞的生長、分化等[24]。根據(jù)結合部位的不同分為反義DNA、反義RNA、自催化性核酶。ASON一般有兩方面的作用，一方面是與細胞核內(nèi)的DNA互補雜交，形成三股螺旋結構，從而抑制DNA的轉(zhuǎn)錄；另一方面是與細胞質(zhì)中的mRNA結合，不僅抑制mRNA的翻譯，而且形成能被核糖核酸酶H（RNase H）降解的RNA-DNA雙鏈結構，中斷了核糖體對mRNA的翻譯，達到抑制基因表達的效果[25]。

2.2.2 反義RNA技術（Antisense RNA）。

能與靶RNA互補配對的小分子RNA被稱為反義RNA，可被用于某一段DNA片段功能的定點分析[26]。原理是通過構建人工表達載體，利用基因重組技術，使在離體或體內(nèi)表達的反義RNA與靶mRNA結合形成較穩(wěn)定的二聚體，導致靶基因的表達受到抑制，可在DNA的復制、轉(zhuǎn)錄及翻譯水平上使靶基因表達受到抑制[27]。能直接觀察到該基因在植物中的功能是反義RNA技術最突出的優(yōu)點。

2.2.3 核酶技術（Ribozyme）。

核酶又被稱為基因剪刀，能通過堿基配對原則特異性滅活靶RNA分子，且具有催化活性[28]。核酶自身具有較穩(wěn)定的空間結構，從而使其不易受RNase攻擊，而且單個核酶分子可以結合多個mRNA分子，使mRNA分子在需要剪切的特定部位斷裂，所以其催化效率高于反義RNA[29]。核酶常見的有錘頭狀、發(fā)夾狀和斧頭狀，錘頭狀核酶是目前應用最多的一種核酶。核酶主要由兩部分組成：中間極為保守的核苷酸序列和兩端的引導序列，當引導序列與靶RNA互補結合時，中間極端保守序列將在該特定位點切斷[28]，但也有人認為核酶的原理是反義抑制和切割活性的綜合作用結果[30]。

3 插入突變

插入突變是將外源已知的插入元件隨機插入到植物基因組中，產(chǎn)生插入突變體，造成插入位點的變化而影響其正常表達，從而導致植株在表型上的變化，并以此插入元件為標記，就能分離和克隆因插入而失活的基因，對該基因進行反向和正向遺傳學研究[31]。常用的獲得植物中相關基因突變庫的方法包括自發(fā)突變、物理化學誘變法、T-DNA插入誘導法以及轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子法。插入突變的方法不用首先確定基因的表達和基因的產(chǎn)物，通過已知的插入序列作為標記，就能夠?qū)ξ粗蜻M行研究[32]。由于前述優(yōu)點，插入突變已經(jīng)成為對未知基因進行功能鑒定及研究的首選方法之一。

目前，擬南芥、玉米、矮牽牛中已有大量可用的突變體群體，水稻的插入突變?nèi)后w也正在逐漸擴充完善[33]。以T-DNA、轉(zhuǎn)座子及質(zhì)粒介導的插入突變等構建突變庫，是利用插入突變進行功能基因組學研究的主要方法。對于大規(guī)模的植物基因功能分析來說，目前使用最多的是T-DNA或轉(zhuǎn)座子的方法[32，34]。

3.1 T-DNA插入突變

T-DNA插入突變對于正向遺傳學和反向遺傳學的研究極其方便[35]。植物病原細菌根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上有一段T-DNA，在病原菌致病過程中，它極易并穩(wěn)定整合到植物基因組中穩(wěn)定表達[36]。以農(nóng)桿菌介導的T-DNA插入突變適用于多種植物，不僅插入位點的隨機性比較強，且能直接在植物基因組DNA中產(chǎn)生穩(wěn)定的插入突變[37]。此方法的缺點是只適合易被T-DNA轉(zhuǎn)化的植物，T-DNA邊界的質(zhì)粒序列可隨著T-DNA整合到基因組DNA中，并出現(xiàn)由于整合引起的各種染色體重排現(xiàn)象，從而造成突變表型與T-DNA插入無關[38]。

3.2 轉(zhuǎn)座子插入突變

轉(zhuǎn)座子是能夠被一些未知的信號激活，從染色體DNA上的一個基因座轉(zhuǎn)移到另一個基因座的一段可以移動的DNA片段。當轉(zhuǎn)座子插入到一個功能基因時，能起到開關的作用，從而影響其基因的表達，將會導致暫時性的突變，部分轉(zhuǎn)座子由于喪失從染色體上隔離出來的能力，將會變?yōu)橛谰眯缘耐蛔僛39]。轉(zhuǎn)座子插入突變的優(yōu)點是其能造成突變體反轉(zhuǎn)，基于此可進一步確認表型是否由轉(zhuǎn)座子插入突變引起[40]。

4 基因的定點誘變

定點誘變（Sitedirected mutagenesis）是指取代、插入或缺失克隆基因或DNA序列中的任何一個特定的堿基，它是基因工程和蛋白質(zhì)工程的重要手段，有簡單易操作、重復性高等優(yōu)點，已經(jīng)被廣泛應用于基因表達調(diào)控及其結構與功能以及蛋白質(zhì)性質(zhì)等諸多研究領域[41-42]。其中化學誘變法、寡核苷酸介導的誘變法、盒式誘變法和基于PCR誘變法是最常用的方法。

4.1 PCR介導的定點誘變

聚合酶鏈式反應（PCR）是一種對特定DNA序列進行體外快速擴增的技術手段。到目前為止，重組PCR法、重疊延伸法、含U模板法和大引物突變等方法都是利用PCR進行定點突變的方法[43-45]。其中，重疊延伸突變法和大引物突變法應用更為廣泛，但這些方法都具有操作較復雜、步驟較繁瑣的缺點，需要多輪PCR和多個引物來完成突變，而且得到的非目標突變率較高[46-47]。

4.2 盒式誘變（Cassette mutagenesis）

盒式誘變就是通過一段人工合成的具有突變序列的寡核苷酸片斷，去代替野生型基因中的對應序列。其方法步驟是先將目的基因克隆到適合的載體上，然后用定向誘變的方法，在準備誘變的目的密碼子兩側各引入1個單酶切位點，連接到同一載體上，再將此載體用新引進的2個酶切位點切開使其成線型，最后連接人工合成的、只有目的密碼子發(fā)生了變化的雙鏈DNA誘變和線型載體，轉(zhuǎn)化篩選目的突變子[48]。

4.3 寡核苷酸介導的誘變（Oligonucleotidedirected mutagenesis）

利用人工合成的少量密碼子發(fā)生變化的寡核苷酸，介導得到誘變目的基因的方法稱為寡核苷酸介導的誘變[49]。其步驟是首先將待突變基因克隆到M13噬菌體上，然后轉(zhuǎn)化和初步篩選異源雙鏈DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞后，就會產(chǎn)生野生型、突變型的同源雙鏈DNA分子，初步篩選突變基因的方法主要是限制性酶切法、斑點雜交法和生物學法[49-50]。

4.4 CRISPR系統(tǒng)

目前，基因組靶向修飾技術主要涉及鋅指核酸酶（Zincfinger nucleases，ZFNs ）、TALE核酸酶（Transcription activator like effective nucleases，TALENs ）以及近兩年迅速崛起的CRISPR/Cas9技術。ZFNs融合含有ZFA和FOKⅠ，其中ZFA是一種串聯(lián)鋅指DNA結構域的轉(zhuǎn)錄因子蛋白，F(xiàn)OKⅠ是一種非特異性的核酸內(nèi)切酶[51]；TALENs 是TAL效應子與 FOK Ⅰ融合而成[52]。上述兩者均能特異性地識別并結合指定的DNA序列，形成有切割活性的FOK Ⅰ二聚體，在靶位點斷裂DNA雙鏈。其中，TALENs能不受前后兩端基因的影響去識別任意目標基因序列，且脫靶效應少；TALENs與ZFNs只能成為常規(guī)基因組編輯工具的原因在于它們都只針對不同靶點改變堿基識別序列，除此以外，TALENs與ZFNs的合成或組裝不僅耗時費力而且費用昂貴[52]。

CRISPR系統(tǒng)是一種為細菌提供獲得性免疫的Ⅱ型系統(tǒng)，近年，通過對CRISPR系統(tǒng)加以研究改造，創(chuàng)造出了CRISPR/Cas9技術，一種第三代基因組靶向修飾技術，該系統(tǒng)與傳統(tǒng)基因修飾技術不同在于CRISPR/Cas9系統(tǒng)僅需改變很短的RNA序列便可引導 Cas9 蛋白特異性地對靶基因進行編輯。除此之外，CRISPR系統(tǒng)在細菌體內(nèi)廣泛存在。由于真核生物中不具備CRISPR系統(tǒng)這樣的特征，從而避免了該技術在應用過程中與真核細胞內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶途徑形成競爭[53]。這種新的基因組定點編輯技術具有比TALENs和鋅指核酸酶ZFNs技術設計更簡單、更易操作的優(yōu)勢[54]。

規(guī)律成簇間隔短回文重復序列及其相關系統(tǒng)（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated，CRISPR/Cas system）是細菌和古細菌具備的獲得性免疫系統(tǒng)，主要用來防御外來噬菌體、質(zhì)?；蚱渌庠碊NA的侵染[55]。此系統(tǒng)主要由Cas9核酸酶和cr RNA所組成，前者是一種非特異性的核酸酶，后者則主要起識別作用[56]。

CRISPR/Cas系統(tǒng)被分為3類，分類依據(jù)主要是通過Cas蛋白的種類和同源性，其中需要多種Cas蛋白參與的是Ⅰ類和Ⅲ類，Ⅱ型系統(tǒng)主要依賴的是Cas9核心蛋白，組分較簡單，在RNA的介導下，Cas9蛋白能夠切割靶序列，引起DNA的雙鏈斷裂（Doublestrand breaks，DSB）。在這個基礎上，可以實現(xiàn)對基因組特定位點進行基因打靶、基因定點插入、基因修復等各項遺傳操作[54]。但是，CRISPR/Cas系統(tǒng)也有一些缺陷，如進入細胞后可能脫靶，即在非目標位點進行酶切[57]。為了降低脫靶現(xiàn)象的發(fā)生，第一種方法是可以通過降低Cas9/sgRNA的濃度，但同時也會導致基因編輯的效率降低；第二種方法是將轉(zhuǎn)錄的sgRNA與Cas9重組后直接注入細胞以達到減少脫靶現(xiàn)象發(fā)生的目的[53]。

5 基因轉(zhuǎn)導技術

基因轉(zhuǎn)導技術是目前應用最多、技術最成熟的研究基因功能的方法，它是指將目的基因轉(zhuǎn)導進入某一細胞中，然后通過觀察細胞生物學行為的變化來認識基因的功能[58]。因為基因表達受到轉(zhuǎn)導效率和是否持續(xù)穩(wěn)定表達兩方面因素的影響，所以選擇轉(zhuǎn)導系統(tǒng)需十分小心謹慎[59]。非病毒性表達系統(tǒng)和病毒性表達系統(tǒng)是常用的兩種基因轉(zhuǎn)導系統(tǒng)[60]。

5.1 非病毒性表達載體

非病毒性表達載體主要是通過與多聚賴氨酸、陽離子脂類混合或者是DNA直接注射的途徑，達到使目的基因穿過細胞膜的作用[60]。選擇表達載體時應選擇強啟動子和增強子、高效的多聚腺苷酸加尾信號（PolyA）、內(nèi)含子序列以及內(nèi)部核糖體進入位點（IRES）[59]。

5.2 病毒表達載體

由于以病毒為載體介導的基因轉(zhuǎn)移有許多優(yōu)點，諸如轉(zhuǎn)染效率高、目的基因能夠穩(wěn)定表達，所以得到了廣泛的應用，主要包括物理、化學和生物方法。物理方法主要包括DNA直接注射法和轟擊顆粒技術；化學方法包括脂質(zhì)體載體和受體介導法；構建病毒載體屬于生物學的方法[59]。目前構建的病毒載體多種多樣，但是它們都具備自身的特點，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠?qū)⑼庠椿驍y帶著并將其整合進靶細胞的基因組中，因而實現(xiàn)了目的基因穩(wěn)定地持久性表達的優(yōu)點，但其也有缺點，如只能感染正在分裂的細胞，且繁殖的病毒懸液濃度較低，而且有插入突變和激活癌基因的危險[28，61]。人腺病毒載體具有宿主范圍廣、滴度高、裝載量大等優(yōu)點，是一種對分裂細胞和靜息細胞都有效的基因傳遞系統(tǒng)[61]。

6 基因敲除技術

利用基因打靶技術，用無功能的外源基因轉(zhuǎn)入細胞與基因組中同源序列進行同源重組[62]，置換出具有功能的同源序列，造成功能基因的缺失或失活，這一技術叫基因敲除[63]。這項技術具有較多的優(yōu)點，如整合位點精確、轉(zhuǎn)移基因頻率較高，既能用正?；蚯贸蛔兓?，以進行性狀的改良和遺傳病的治療，也可以用突變的基因敲除正常的基因，以達到研究此基因功能的目的[64]。

置換型載體也是進行基因敲除的常用方法，即造成內(nèi)源基因一個功能片段被正向選擇基因所置換，形成基因的缺失突變，即將正向選擇基因插入內(nèi)源基因的功能區(qū)域后造成插入突變[65]。

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