不同方法及發(fā)酵管數(shù)量對大腸菌群檢測結(jié)果的差異性分析

周明輝 胡姣 楊光華

摘要 [目的]比較不同方法檢測同種水樣中大腸菌群含量的結(jié)果是否具有差異性，以及多管發(fā)酵法中發(fā)酵管數(shù)量對檢測結(jié)果的影響。[方法]分別采取污染程度由低至高的A、B、C 3種水樣，通過多管發(fā)酵法、紙片法、濾膜法檢測相同水樣中大腸菌群的含量，并在多管發(fā)酵管法中利用9、10、15管發(fā)酵檢測同種水樣，采用SPSS軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析。[結(jié)果]多管發(fā)酵法與紙片法差異不顯著，結(jié)果具有一致性，而濾膜法與其他2種方法獲得結(jié)果具有顯著性差異。對9、10、15管發(fā)酵檢測3種水樣獲得的結(jié)果進(jìn)行方差分析，得到的P值分別是0.709、0.964、0.840，均大于0.05，故差異不顯著，結(jié)果具有一致性。[結(jié)論]試驗(yàn)結(jié)果為大腸菌群檢測方法的研究提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 檢測方法；大腸菌群；水樣；方差分析

中圖分類號 S-03 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）34-0004-03

Abstract [Objective] The aim was to compare the difference between the results of different methods to detect the content of coliforms in the same water samples and the effect of the number of fermentation tubes in the multitube fermentation method on the detection results.[Method] Three kinds of water samples of A，B and C with low pollution level were adopted，and the contents of coliform bacteria in the same water samples were detected by multitube fermentation，paper and filter method.The same kind of water samples were tested by 9，10，15 tube fermentation.The results were analyzed by SPSS software.[Result] The difference between the multitube fermentation method and the paper method was not significant，the results were consistent，and the filter method was significantly different from the other two methods.P values were 0.709，0.964 and 0.840，respectively，which were more than 0.05，so the difference was not significant and the results were consistent.[Conclusion] The results provide reference for the detection of coliform bacteria.

Key words Detection method；Coliform bacteria；Water sample；Variance analysis

大腸菌群是指一群需氧及兼性厭氧，在37 ℃生長時(shí)能分解乳糖，培養(yǎng)24～48 h產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性、無芽孢的桿菌[1]。這類細(xì)菌大多數(shù)無致病性，但致病性的細(xì)菌侵入人體的一些部位時(shí)，可引起腹瀉、膀胱炎等[2-3]。若食品中檢出大腸菌群，說明該食品可能被腸道致病菌污染，存在著食物中毒和流行病的危險(xiǎn)[4]。食品中含大腸菌群量的多少，不僅可看出被糞便污染的情況，還反映出了在生產(chǎn)加工過程中的衛(wèi)生狀況，故大腸菌群的檢出具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義[5-6]。

大腸菌群在人與動物的腸道中是一種正常存活的菌群，也是最主要、數(shù)量最多的菌群種類，已經(jīng)成為各類食品進(jìn)行糞源性污染細(xì)菌檢測的指標(biāo)，國際上普遍采用大腸菌群作為水質(zhì)衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)[7]。采用適宜的大腸菌群檢測方法，能準(zhǔn)確及時(shí)地監(jiān)測水域的污染狀況，對流行疾病的發(fā)生與傳播具有重要意義[8]。世界各國已對大腸菌群的檢測技術(shù)做了大量的研究工作，檢測方法很多，如多管發(fā)酵法、濾膜法、紙片法、酶底物法、熒光原位雜交技術(shù)、自動化檢測方法等[9-11]。

從操作簡便性、檢測結(jié)果準(zhǔn)確性以及成本控制方面考慮，目前多管發(fā)酵法、濾膜法與紙片法在檢測大腸菌群中應(yīng)用較多，其中多管發(fā)酵法根據(jù)接種量的不同又可分為9、10、15管發(fā)酵[12-14]。目前對上述3種方法檢測同種樣品所獲結(jié)果的差異性研究較少，而對不同發(fā)酵管數(shù)對同種樣品進(jìn)行檢測所獲結(jié)果的比較就更少，為此，筆者利用3種方法以及不同管數(shù)的多管發(fā)酵法檢測了污染程度不同的水樣，對其所獲結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以確定應(yīng)用范圍與差異顯著性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 水樣。在合肥師范學(xué)院內(nèi)分別取污染程度不同的A、B、C 3份水樣。

1.1.2 培養(yǎng)基。乳糖蛋白胨：乳糖5.0 g、蛋白胨10.0 g、牛肉膏3.0 g、氯化鈉5.0 g、溴甲酚紫16 mg、蒸餾水1 000 mL，pH 7.1～7.5。伊紅美藍(lán)：乳糖10.0 g、蛋白胨10.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、瓊脂20.0 g、蒸餾水1 000 mL、2%伊紅溶液20 mL、0.5%美藍(lán)水溶液13 mL，pH 7.2～7.4。

品紅亞硫酸鈉：蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、酵母浸膏5.0 g、乳糖10.0 g、瓊脂15.0～20.0 g、磷酸氫二鉀3.5 g、無水亞硫酸鈉5.0 g、50 g/L堿性品紅乙醇溶液20 mL、蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 試劑。革蘭氏染液、水質(zhì)大腸菌群檢驗(yàn)紙片和0.45 μm濾膜。

1.2 方法

1.2.1 水樣采集。分別在合肥師范學(xué)院竹園廣場池塘、柳渠中部、月湖采樣，將帶塞的已滅菌的取樣瓶浸入距水面深10～15 cm的水層中，拔去瓶塞，進(jìn)行取樣并備注，置冰箱中備用。

1.2.2 不同試驗(yàn)方法檢測3種水樣結(jié)果比較。多管發(fā)酵法與濾膜法依據(jù)國標(biāo)HJ/T 347—2007同紙片法對3種水樣進(jìn)行檢測，每種方法檢測同批水樣時(shí)進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)，記錄試驗(yàn)現(xiàn)象，利用SPSS 13和Graph pad 5.0軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析。

1.2.3 不同管數(shù)發(fā)酵檢測結(jié)果的比較。依據(jù)接種量的不同分別選取9、10、15管發(fā)酵檢測3種不同的水樣，查閱不同的MPN表獲得檢測結(jié)果，每種管數(shù)檢測同種水樣時(shí)進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)，利用SPSS 13和Graph pad 5.0軟件對其結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水樣狀態(tài)及試驗(yàn)現(xiàn)象

由圖1可知，3種水樣的污染程度具有明顯差異，提高了試驗(yàn)的范圍，增加了試驗(yàn)的可信度。通過預(yù)試驗(yàn)，3種檢測方法在對3種水樣的檢測過程中表現(xiàn)出明顯的陽性結(jié)果，便于對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.2 3種方法的結(jié)果比較 采用多管發(fā)酵法、紙片法、濾膜法分別對污染程度由低至高的A、B、C 3種水樣進(jìn)行大腸菌群檢測，每種方法做5次重復(fù)。

由圖2可知，采用3種方法檢測A水樣的大腸菌群數(shù)，多管發(fā)酵法較其他2種方法測得的結(jié)果偏高，濾膜法與多管發(fā)酵法的結(jié)果具有顯著性差異，多管發(fā)酵法與紙片法所得P值為0.071，P>0.05，故差異不顯著，濾膜法與紙片法所得P值為0.071，P>0.05，故差異不顯著，即這2種方法檢測結(jié)果具有一致性。

由圖3可知，B水樣中大腸菌群數(shù)明顯高于A水樣，其中多管發(fā)酵法較其他2種方法測得的結(jié)果偏高，濾膜法測得的結(jié)果最小。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后得濾膜法測得的結(jié)果與多管發(fā)酵法、紙片法測得的結(jié)果有顯著性差異，紙片法與多管發(fā)酵法所得P值為0.481，P>0.05，故差異不顯著，即這2種方法檢測結(jié)果具有一致性。

由圖4可知，C水樣中大腸菌群數(shù)較高，其中多管發(fā)酵法較其他2種方法測得的數(shù)據(jù)偏高，濾膜法測得的結(jié)果最小，紙片法與多管發(fā)酵法所得P值為0.209，P>0.05，故差異不顯著，即這2種方法檢測結(jié)果具有一致性，而濾膜法與其他2種方法檢測結(jié)果差異極顯著。

2.3 不同管數(shù)發(fā)酵檢測同種水樣的結(jié)果分析

依據(jù)接種水樣量的不同，多管發(fā)酵法檢測大腸菌群目前常用發(fā)酵管為9、10、15管。利用不同管數(shù)檢測污染程度由低到高的A、B、C 3種水樣，每種水樣做5次重復(fù)。

由圖5可知，利用SPSS軟件分析3種管數(shù)檢測A水樣的結(jié)果，所得P值為0.709，P> 0.05，故差異不顯著，即檢測結(jié)果具有一致性。

由圖6可知，將3種管數(shù)發(fā)酵檢測B水樣所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS軟件分析后，P值為0.964，P>0.05，差異不顯著，說明檢測結(jié)果具有一致性。

由圖7可知，將3種管數(shù)檢測C水樣所獲數(shù)據(jù)用SPSS軟件分析后，P值為0.840，P>0.05，故差異不顯著，檢測結(jié)果具有一致性。

3 結(jié)論與討論

為了比較不同方法檢測大腸菌群所獲結(jié)果的差異性，分別采取了3種污染程度差異較大的水樣，利用目前應(yīng)用較為廣泛的多管發(fā)酵法、紙片法、濾膜法去檢測相同水樣中大腸菌群的含量[15]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3種檢測方法中多管發(fā)酵法較另2種方法測得的結(jié)果都偏高，濾膜法測得的結(jié)果都是最小的。在3種不同的水樣檢測結(jié)果的顯著性分析中，紙片法與多管發(fā)酵法所得的結(jié)果都沒有顯著性差異，即這2種方法測得的的結(jié)果具有一致性，但也存在一定的缺陷，這2種方法對顏色的判斷主觀性較高，因此具有一定的局限性；而濾膜法的檢測結(jié)果與其他2種方法相比差異性較大，特別是對污染程度較高樣品的檢測，因此濾膜法不適宜檢測污染程度較高且渾濁度較高的樣品，因?yàn)槌闉V可能會堵塞濾膜上的微孔，導(dǎo)致異物截留，致使結(jié)果有誤差，應(yīng)對污染程度高的水樣進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專龠M(jìn)行檢測。

多管發(fā)酵法具有操作簡單、方便耐用、應(yīng)用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)，且也是國標(biāo)推薦的方法[16]。但目前依據(jù)樣品的性質(zhì)和接種量的不同，可分為9、10、15管發(fā)酵法，且結(jié)果查閱的MPN表也不盡相同，但通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，9管發(fā)酵法、10管發(fā)酵法和15管發(fā)酵法檢測3種水樣的結(jié)果經(jīng)方差分析后，P值均大于0.05，即差異不顯著，表明9管發(fā)酵法、10管發(fā)酵法和15管發(fā)酵法對同一水樣的檢測結(jié)果具有一致性。

參考文獻(xiàn)

[1]

孫超.水體中大腸桿菌的檢測分析新方法研究[D].上海：東華大學(xué)，2010.

[2] 趙振宇.食品中大腸桿菌檢測探討[J].食品安全導(dǎo)刊，2015（36）：105.

[3] 崔麗琳.論多管發(fā)酵法檢測生活飲用水中大腸菌群[J].中國衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理，2015，6（1）：4-5.

[4] 張金平，林曦，吳桐，等.多管發(fā)酵法對不同水樣中大腸菌群數(shù)的檢測與分析[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2011，27（1）：4-6.

[5] 嵇志遠(yuǎn)，翁天楚.3種方法測定水中糞便污染指示菌比較研究[J].工業(yè)水處理，2013，33（10）：79-82.

[6] 陳艷宏，馬健，權(quán)玉玲.2種試劑的酶底物法和多管發(fā)酵法檢測水中總大腸菌群的比較研究[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2014（22）：3257-3258.

[7] 蔣玲，李雪.酶底物法和多管發(fā)酵法檢測水中的總大腸菌群的比較研究[J].中國衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)，2016，13（18）：120-121.

[8] 國家環(huán)境保護(hù)總局《水和廢水監(jiān)測分析方法》編委會.水和廢水監(jiān)測分析方法[M].4版.北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2002.

[9] 史建.糞大腸菌群檢測方法研究進(jìn)展[J].河北化工，2012，35（7）：32-35.

[10] 劉楊，楊鵬.飲用水中總大腸菌群檢測方法的研究進(jìn)展[J].臨床軍醫(yī)雜志，2013，41（12）：1302-1304.

[11] 唐思偲，王琴，辛明秀.用水體中大腸菌群的含量檢測水質(zhì)污染程度[J].生物學(xué)通報(bào)，2011，46（8）：15-17.

[12] 史長生.食品中大腸菌群測定的分析研究[J].食品研究與開發(fā)，2012，33（8）：235-237.

[13] ISHII S，GAGNON R F，HARRIS A，et al. Escherichia coli in environment：Implications for water quality and human health[J].Microbes Environ，2008，11（2）：101-108.

[14] LECLERC H，EDBERG S，PIERZO V，et al.Bacteriophage as indicators of enteric viruses and public health risk in groundwaters[J].Journal of applied microbiology，2012，88（9）：5-21.

[15] 唐偉，于波，張國平，等.渾河（撫順段）水質(zhì)糞大腸菌群污染現(xiàn)狀研究[J].環(huán)境科學(xué)與管理，2013，31（7）：76-78.

[16] 馮廣達(dá)，鄧名榮，朱紅惠，等.水體糞便污染的微生物溯源方法研究進(jìn)展[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2010，12（11）：3273-3281.