與小麥抗赤霉病基因連鎖的分子標(biāo)記（BARC133）檢測

陳玉金

摘 要：小麥赤霉病是一種世界性的小麥病害，它不僅造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失，而且會降低籽粒的食用品質(zhì)與種用價值。蘇麥3號是目前國際公認(rèn)的抗赤霉病的最佳抗源，該試驗以蘇麥3號為對照，利用SSR分子標(biāo)記Barc133對180份試驗材料進行DNA的提取、PCR擴增、聚丙烯酰胺電泳檢測，推測可能含有抗赤霉病基因的小麥材料。

關(guān)鍵詞：小麥；赤霉??；分子標(biāo)記

中圖分類號 S435 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）12-0035-03

Abstract：Wheat scab is a worldwide disease，which not only causes serious production loss，but also reduces grain consumption quality and seed value. Sumai 3 is recognized as the best anti-scab resistance source in the world. In this study，taking Sumai 3 as control，we tested 180 experimental materials based on the SSR molecular marker Barc133 by DNA extraction，PCR amplification and polyacrylamide electrophoresis technology，to detect the possible materials carried the resistance gene.

Key words：Wheat；Wheat scab；Molecular marker

小麥赤霉病又名麥穗枯、爛麥頭、紅麥頭，是由多種鐮刀菌引起的一種世界范圍的麥類的嚴(yán)重病害[1]，其發(fā)生流行受土壤內(nèi)菌源量、品種抗性及栽培管理措施等多種因素的影響，并且與氣象條件關(guān)系密切，小麥抽穗揚花期如遭遇連續(xù)3d以上有一定降水量的陰雨天氣，即可造成小麥赤霉病的發(fā)生。小麥感染赤霉病不僅容易造成嚴(yán)重減產(chǎn)，而且會使小麥的食用和種用價值顯著降低，嚴(yán)重的甚至造成絕收?；瘜W(xué)藥劑防治小麥赤霉病，不僅易對環(huán)境造成污染而且農(nóng)民實際操作起來十分麻煩。相比之下，培育抗赤霉病品種[2]是一種防治赤霉病經(jīng)濟且有效的方法，目前我國在小麥赤霉病抗病品種的選育方面處于世界領(lǐng)先水平[3]，赤霉病的抗性鑒定則是選育小麥抗病品種的重點環(huán)節(jié)。目前，雖然赤霉病的抗性鑒定有很多種方法，但由于小麥赤霉病抗性是由多對基因控制的數(shù)量性狀[4，5]，其表現(xiàn)受生長條件和環(huán)境因素的影響很大，所以，僅僅靠抗赤性的表型進行目標(biāo)性狀的選擇較為困難，不僅費時費力，而且育種效率不高，因而急需一種快速簡便的鑒定方法。

近年來，隨著現(xiàn)代基因技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外小麥育種專家學(xué)者針對各種小麥赤霉病抗源構(gòu)建的遺傳群體，尤其是微衛(wèi)星（SSR）標(biāo)記，因其數(shù)量豐富、多態(tài)性水平高、重復(fù)性和穩(wěn)定性好而得到廣泛的應(yīng)用。通過SSR分子標(biāo)記技術(shù)進行小麥赤霉病抗性QTL的分子定位[6]，并建立分子標(biāo)記輔助選擇系統(tǒng)，顯著地提高了小麥抗赤霉病育種的效率。利用分子標(biāo)記可在苗期就對植株進行抗病性檢測，免受環(huán)境影響，節(jié)省了大量的人力物力。但是除了蘇麥3號抗性主效QTL已被定位于3B染色體上，其緊密連鎖的SSR標(biāo)記Xgwm533和Xgwm493已得到公認(rèn)外[7，9]，不同研究者對其他赤霉病抗性基因的定位（如Barc87、Barc133、Xgwm389）研究卻有不同的結(jié)果?？钩嗝共∑贩N寧894037的3BS上的SSR標(biāo)記 Xbarc 133和Xgwm 493之間、抗赤霉病品種望水白的 3BS上的 Xbarc 147和 Xgwm 493之間、蘇麥3號的 3BS上 Xgwm 533a與 Xgwm 493之間均存在 1個抗赤霉病主效 QT L[10，12]。

本研究擬用與小麥赤霉病抗性主效QT L緊密連鎖的 SSR 標(biāo)記 Xbarc 133來檢測所收集的180份小麥材料，并通過6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，以蘇麥3號作為對照，推測可能含有抗赤霉病基因的小麥材料，在選育小麥品種時，可以以此為合理有效地利用抗赤霉病性強的親本材料提供準(zhǔn)確的信息，從而避免了育種和種植時產(chǎn)生不必要的浪費，為廣大育種工作者和小麥種植戶帶來更多的效益。

1 材料和方法

1.1 材料 實驗材料為安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥育種實驗室收集和保存的小麥種質(zhì)材料，共計180份。

1.2 方法 抗赤霉病基因的分子標(biāo)記檢測

1.2.1 DNA的提取

1.2.1.1 試劑的配制 以下試劑皆采取以公認(rèn)的國際標(biāo)準(zhǔn)配置（表1）。

1.2.1.2 SDS-Tris飽和酚法提取小麥DNA （1）取2～3粒粉粒粉碎后，放入離心管中，加700ulSDS提取液，50～60℃水浴45min，期間震蕩6～8 次；（2）在離心機12000r下離心10min，然后吸600ul上清液，加600μL酚—氧仿—異戊醇于冰上顛倒混均15min；（3）在離心機12000r下離心10min，然后吸取500ul上清液，加入0.6倍的異丙醇（300μL）和1/10 倍（50ul）的NaAc（PH5.2）混均后于水上靜置15min；（4）待絮狀DNA沉淀出現(xiàn)，10000r，10min，棄上清液；（5）沉淀用70%的乙醇漂洗2遍，然后用無水乙醇漂洗1遍，室溫下晾干，加入100μL 1×TE（或ddh2o）溶解，備用；（6）取7～8μL檢測。

1.2.2 PCR擴增

（2）聚丙烯酰胺電泳檢測：

①準(zhǔn)備工作。首先把電泳玻璃板用去污劑清洗干凈，晾干后，再用95%乙醇涂擦清洗玻璃板，然后再用親水硅烷（Binding silane）均勻涂擦底板，在通風(fēng)櫥中用疏水硅烷（Repel silane）均勻涂擦耳朵板，待玻璃表面晾干，然后組裝兩塊玻璃板，開始灌膠，注意灌膠速度保持電泳玻璃板水平，以防膠內(nèi)產(chǎn)生氣泡。膠灌完后再次調(diào)節(jié)電泳玻璃板水平，待膠凝聚45min或過夜，準(zhǔn)備電泳。

②操作步驟。安裝提前準(zhǔn)備好的電泳玻璃板到電泳槽中，上下電泳槽均加1×TBE電極緩沖液約0.8L；首先進行預(yù)電泳：恒定功率80W，電泳10～30min；用吸耳球清除掉電泳玻璃板膠面沉積的異物和氣泡，然后插入樣品梳；在樣品梳加樣口加樣約4～6μL，電泳約1h，恒定功率45～60W；固定電泳痕跡：用10% HAC溶液（可以繼續(xù)留用作停顯液），作用5～10min；沖洗電泳玻璃板膠面：用去離子水沖洗2次，2min/次；銀染：1.5g AgNO3+1.5mL甲醛+1L蒸餾水配置溶液，作用20～30min；沖洗多余溶液：用去離子水快速漂洗1次（約2S）；顯影：30g Na2CO3+ 1L water +1.5mL甲醛（現(xiàn)加）+200μL預(yù)冷硫代硫酸鈉（10mg/mL，現(xiàn)加）；停顯：10%HAC；沖洗：用去離子水沖洗1遍，然后室溫晾干，照相保存。

2 結(jié)果與分析

利用已發(fā)表的與抗赤霉病基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記（Barc133），通過基因組DNA提取-PCR擴增和6%變性聚丙烯酰胺凝膠對180份小麥材料進行檢測，并與對照材料蘇麥3號的電泳譜帶對比，推測可能含有抗赤霉病基因的品種有寧麥9號、寧0076、Y14、50785、LD-10、LD-3、綿麥48。部分材料的檢測圖譜如圖1所示。

3 討論與結(jié)論

小麥赤霉病屬氣候型病害，田間抗性鑒定結(jié)果隨外界環(huán)境的變化而有很大差異。在實驗室利用與小麥抗赤霉病基因連鎖的分子標(biāo)記檢測抗性基因在小麥品種或品系中的分布情況，避免了田間環(huán)境對實驗結(jié)果造成的誤差，使實驗結(jié)果的可靠性大大提高，為抗性育種提供豐富的親本的同時也加快了育種的進程。

本文利用分子標(biāo)記Barc133所檢測的具有抗赤霉病基因的材料有寧麥9號、寧0076、Y14、50785、LD-10、LD-3、綿麥48。因與小麥抗赤霉病基因QTL緊密連鎖的SSR標(biāo)記Xgwm493已得到公認(rèn)[7，9]，因而本文將研究結(jié)果與Xgwm493所得結(jié)果進行對比。結(jié)果表明，兩種標(biāo)記共同檢測到的材料僅有3份。從上述比較可知兩者共有的抗赤霉病材料很少，而導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因主要是不同分子標(biāo)記與抗赤霉病基因的連鎖程度不同，造成不同分子標(biāo)記檢測的結(jié)果出現(xiàn)部分差異。但最終評判標(biāo)準(zhǔn)是與抗赤霉病基因的連鎖程度越緊密，其鑒定出的結(jié)果越可靠，所以在實際小麥抗病育種中，檢測結(jié)果可以為分子標(biāo)記輔助育種提供參考，但不是絕對依據(jù)。

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