基于UPLC—Q—TOF/MS的RAW264.7細(xì)胞炎癥模型的代謝指紋分析

高山山+郭慧清+張澤坤+白光燦+高曉燕+馬長(zhǎng)華

[摘要] 為揭示炎癥細(xì)胞模型的極性代謝組特征，該文選擇RAW264.7細(xì)胞為研究載體，以LPS刺激誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞模型，進(jìn)行細(xì)胞代謝組學(xué)的指紋分析。具體方法為：篩選、優(yōu)化了細(xì)胞內(nèi)極性代謝物的提取方法，建立了利用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)代謝組的數(shù)據(jù)采集方法，采用正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，篩選并初步鑒定了17種差異代謝物。結(jié)果顯示，采用MeOH-CHCl₃-H₂O（8∶1∶1）作為提取溶劑，色譜峰數(shù)目較多，細(xì)胞內(nèi)極性代謝物提取效率較高，分析方法的穩(wěn)定性較好；與正常細(xì)胞相比，炎癥細(xì)胞的蛋白質(zhì)代謝、糖代謝、核苷酸代謝等代謝通路受到擾動(dòng)。該研究建立了基于UPLC-Q-TOF/MS的RAW264.7細(xì)胞代謝組學(xué)指紋分析方法，為揭示細(xì)胞炎癥機(jī)制及抗炎藥物機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜； 代謝指紋分析； 代謝組學(xué)； 炎癥細(xì)胞； 正交偏最小二乘判別分析

[Abstract] In order to reveal the properties of polar metabolome in inflammatory cells， we selected LPS-induced RAW264.7 inflammatory cell models as the carrier for the research of metabolic fingerprint analysis. In this study， an ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of-flight mass spectrometry （UPLC-Q-TOF/MS）-based metabolomics protocol was optimized for the extraction of polar metabolites from RAW264.7 cell line. Then orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA） was used to process the metabolic data， and finally， a total of 17 metabolites were selected and identified. The results showed that MeOH-CHCl₃-H₂O （8∶1∶1） was chosen as the optimal extraction solvent to achieve higher number of chromatographic peaks， with the best relative extraction efficiency and stability. Comparing with the normal cells， the inflammatory cells presented an abnormal metabolism in protein， carbohydrate， nucleotide and phospholipids. In this study， a UPLC-Q-TOF/MS-based metabolomics protocol for the polar metabolites from RAW264.7 cell line was developed， which may provide important information for the study of mechanism of inflammation and the anti-inflammatory drugs.

[Key words] ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of-flight mass spectrometry（UPLC-Q-TOF/MS）； metabolic fingerprint analysis； metabolomics； inflammatory cells； orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA）

細(xì)胞代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分[1]，分為代謝指紋分析和代謝足跡分析，其研究對(duì)象分別為胞內(nèi)代謝組與胞外代謝組，兩者具有高度的信息互補(bǔ)性[2]。胞內(nèi)代謝組是細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜生化活動(dòng)狀態(tài)的綜合表現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)代謝物濃度的改變能夠反映細(xì)胞基因組的改變和細(xì)胞對(duì)于外部刺激的響應(yīng)，因而，獲取細(xì)胞代謝物信息對(duì)于系統(tǒng)地了解細(xì)胞的性質(zhì)和功能、篩選藥物以及尋找用于分型的生物標(biāo)志物至關(guān)重要。

RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞，具有很強(qiáng)的黏附和吞噬抗原的能力，免疫學(xué)研究中常采用細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激RAW264.7細(xì)胞造炎癥反應(yīng)模型。巨噬細(xì)胞的狀態(tài)及其功能發(fā)揮與細(xì)胞代謝密切相關(guān)，其自身代謝水平的差異甚至能夠影響其極化狀態(tài)，從而決定了不同的功能[3]。因此，利用RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行炎癥機(jī)制的研究具有重要意義。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的RAW264.7細(xì)胞炎癥模型的研究多是以細(xì)胞內(nèi)弱極性小分子代謝物組為主的脂質(zhì)組學(xué)，揭示了以花生四烯酸為代表的脂質(zhì)代謝物在炎癥細(xì)胞中被擾動(dòng)的情況[4-5]。

然而，炎癥細(xì)胞中的極性代謝組亦發(fā)生改變。Newsholme P等[6]采用Gilford自動(dòng)記錄式分光光度計(jì)測(cè)定活化的巨噬細(xì)胞內(nèi)的己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性，發(fā)現(xiàn)2種酶活性均增強(qiáng)，表明糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑代謝加強(qiáng)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明活化的巨噬細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）表達(dá)增強(qiáng)，表明精氨酸的iNOS代謝通路增強(qiáng)。RAW264.7細(xì)胞炎癥模型的胞內(nèi)極性代謝物組發(fā)生了改變，但是針對(duì)其細(xì)胞內(nèi)極性代謝物組的研究尚未見報(bào)道。

因此，本文針對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)極性小分子代謝物組，對(duì)細(xì)胞代謝物提取溶劑及檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立基于UPLC-Q-TOF/MS的RAW264.7細(xì)胞極性代謝物檢測(cè)方法，進(jìn)行細(xì)胞代謝指紋分析，明確RAW264.7細(xì)胞炎癥模型的差異代謝物，發(fā)現(xiàn)炎癥擾動(dòng)的細(xì)胞代謝通路，推測(cè)RAW264.7細(xì)胞極化過程，為揭示炎癥細(xì)胞的生物化學(xué)變化基礎(chǔ)提供數(shù)據(jù)支撐，同時(shí)為細(xì)胞極性代謝物組的代謝指紋分析提供了方法學(xué)參考。

1 材料

1.1 儀器與試劑

CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific 公司）；ACQUITY I-Class超高效液相色譜儀；Waters Xevo-G2-SQ-TOF-MS質(zhì)譜系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）；D-3750 Osterode 高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Thermo Fisher公司）；Millipore Synergy UV型超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）；水浴氮吹儀（北京成盟偉業(yè)科技有限公司）；xw-80A旋渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；多功能酶標(biāo)儀（Thermo Scientific 公司）；100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿（美國(guó)Corning公司）。

胎牛血清（美國(guó)Corning公司）、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（Hyclone 公司）；胰蛋白酶、PBS（中國(guó)Solarbio公司）；一氧化氮測(cè)試試劑盒（普利萊公司）；乙腈、乙酸銨（LC-MS級(jí)，美國(guó)Fisher Scientific公司）；甲醇（HPLC級(jí)，美國(guó)Fisher Scientific公司）；LPS（Sigma 公司）；其余試劑至少為分析純。

1.2 細(xì)胞來源

小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院協(xié)和細(xì)胞資源中心。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞用含10%胎牛血清、青霉素（1×105 U·L^-1）及鏈霉素（100 mg·L^-1）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃，5% CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。六孔板中每孔接種1×10⁶個(gè)細(xì)胞，孵育24 h后炎癥模型組加入LPS，使其終質(zhì)量濃度為100 μg·L^-1，正常組加入相同體積培養(yǎng)基，每組平行培養(yǎng)6份。培養(yǎng)24 h后進(jìn)行樣品制備。

2.2 Griess試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)基中NO含量

按照試劑盒說明書制備NO標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取50 μL培養(yǎng)基上清液于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入50 μL Griess R1試劑，室溫避光靜置5 min，各孔再加入50 μL Griess R2試劑，室溫避光靜置5 min，酶標(biāo)儀540 nm下檢測(cè)吸光度，并用校準(zhǔn)曲線確定實(shí)驗(yàn)各組NO的濃度。

2.3 細(xì)胞樣品制備

去除培養(yǎng)基，用4 mL 37 ℃超純水清洗2遍，液氮淬滅。加入1 mL含有5 μmol·L^-1α-氨基庚二酸內(nèi)標(biāo)的MeOH-CHCl₃-H₂O（8∶1∶1）提取溶劑，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，該操作置于冰上，提取溶劑轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，渦旋30 s，在液氮-室溫下反復(fù)凍融循環(huán)2次使細(xì)胞破碎，4 ℃以13 500 r·min^-1離心15 min后取上清液，在檢測(cè)前儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱中。檢測(cè)前將上清液在室溫下用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?0%乙腈復(fù)溶，進(jìn)行LC-MS分析。

2.4 色譜條件

采用ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美國(guó)Waters公司）；流動(dòng)相A：含有5 μmol·L^-1的乙酸銨水溶液（pH 9.9）；流動(dòng)相B：乙腈；流速：0.4 mL·min^-1；梯度洗脫程序：0～1.0 min，0～99%B；1.0～5.0 min，99%～75%B；5.0～6.0 min，75%B；6.0～8.0 min，75%～70%B；8.0～9.5 min，70%～65%B；9.5～10 min，65%～99%B。

2.5 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜系統(tǒng)采用電噴霧離子源，負(fù)離子模式掃描；掃描范圍m/z 50～1 000；離子源參數(shù)毛細(xì)管電壓為2 000 V，錐孔電壓為40 V，離子源溫度為100 ℃，鞘流氣為氮?dú)猓?00 L·h^-1，鞘流氣溫度為450 ℃，掃描時(shí)間為0.2 s，碰撞氣體為氬氣。低能量掃描時(shí)碰撞能量為6 eV，高能量掃描時(shí)碰撞能量為10～40 eV。

2.6 方法學(xué)考察

在確定MeOH-CHCl₃-H₂O（8∶1∶1）為最佳細(xì)胞代謝物提取溶劑后進(jìn)行了方法學(xué)考察。方法學(xué)考察部分包括精密度、重復(fù)性、樣品穩(wěn)定性及系統(tǒng)穩(wěn)定性4個(gè)考察內(nèi)容。吸取等量的細(xì)胞代謝物提取液，混合均勻，作為質(zhì)控樣本（QC）。精密度考察方法是1個(gè)QC樣本平行進(jìn)樣6次，分別計(jì)算峰面積及保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。重復(fù)性考察方法是平行制備6份QC樣本，每份進(jìn)樣1針，分別計(jì)算峰面積及保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，樣品穩(wěn)定性考察是平行制備6份QC樣本，4 ℃放置12 h，進(jìn)樣分析，分別計(jì)算峰面積及保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。系統(tǒng)穩(wěn)定性考察是每8個(gè)樣品隨行一針QC樣本，分別計(jì)算峰面積及保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2.7 數(shù)據(jù)處理與分析

NO含量檢測(cè)結(jié)果采用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

將LC-MS采集到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入ProgenesisQI軟件（Waters 公司），對(duì)色譜峰進(jìn)行峰提取、峰匹配、峰對(duì)齊、峰識(shí)別以及歸一化處理，得到的數(shù)據(jù)再導(dǎo)入EZinfo2.0軟件進(jìn)行多變量分析，選取變量權(quán)重值VIP>1，并結(jié)合S-plot圖篩選正常組和炎癥模型組細(xì)胞的代謝物譜差異，采用t檢驗(yàn)對(duì)上述差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。差異性代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)依據(jù)碎片離子（MSE）信息及HMDB，METLIN，LIPID，KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)行鑒定。

3 結(jié)果與討論

3.1 Griess試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)基中NO含量結(jié)果

用一系列對(duì)照品濃度與其對(duì)應(yīng)的吸光度A作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行直線相關(guān)回歸分析，得出其直線回歸方程為y=115.41x-6.962 2，R²=0.999 9。將每組樣品測(cè)得的A代入該直線回歸方程中，即得到相應(yīng)的NO含量。加入LPS后培養(yǎng)24 h，正常組RAW264.7 細(xì)胞NO分泌量為0.80 μmol·L^-1，模型組RAW264.7 細(xì)胞NO分泌量為7.01 μmol·L^-1，LPS明顯提高了RAW264.7細(xì)胞NO的分泌（P<0.01），說明造模成功。

3.2 細(xì)胞提取方法的優(yōu)化

本研究采用超純水沖洗細(xì)胞，液氮淬滅，同時(shí)考察了4種提取溶劑對(duì)細(xì)胞代謝物檢測(cè)的影響，這4種提取試劑包括MeOH，ACN，MeOH-ACN-H₂O（2∶2∶1），MeOH-CHCl₃-H₂O（8∶1∶1）。按照2.3項(xiàng)樣品制備方法，分別采用4種提取試劑制備樣品并進(jìn)行檢測(cè)，見圖1A，發(fā)現(xiàn)MeOH-CHCl₃-H₂O作為提取溶劑時(shí)色譜峰個(gè)數(shù)較多。本文選擇了部分常見極性代謝物來評(píng)價(jià)4種提取溶劑的提取效率，每種代謝物的相對(duì)提取率采用內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并將ACN組代謝物的相對(duì)提取效率設(shè)為100%作為參照，發(fā)現(xiàn)采用MeOH-CHCl₃-H₂O作為提取溶劑時(shí)極性代謝物的相對(duì)提取率高，見表1。主成分分析是以較少個(gè)數(shù)的主成分來反映原始數(shù)據(jù)的主要信息，因此，PCA圖中點(diǎn)的聚集情況可以表明樣品間變異性。由4種提取溶劑制備樣品的PCA圖，見圖1B。發(fā)現(xiàn)，采用MeOH-CHCl₃-H₂O作為提取劑同組樣品間穩(wěn)定性最高。因此選取MeOH-CHCl₃-H₂O作為RAW264.7細(xì)胞極性代謝產(chǎn)物的提取溶劑。

3.3 分析條件的優(yōu)化

3.3.1 色譜條件優(yōu)化 細(xì)胞的代謝途徑復(fù)雜多樣，研究表明，LPS刺激巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞的糖代謝、氨基酸代謝、脂代謝都發(fā)生了改變，為全面表征其代謝產(chǎn)物變化，本研究考察色譜柱類型、流動(dòng)相組成和離子檢測(cè)模式。實(shí)驗(yàn)中分別采用T3色譜柱和BEH Amide色譜柱進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)BEH Amide因其酰胺官能團(tuán)同時(shí)具有氫原子受體和供體位點(diǎn)，極性代謝物保留時(shí)間延長(zhǎng)。調(diào)整流動(dòng)相組成，發(fā)現(xiàn)使用含5 mmol·L^-1乙酸銨的水（pH 9.9）-乙腈流動(dòng)相體系，采用2.4項(xiàng)所述的流動(dòng)相梯度進(jìn)行洗脫，分離效果最佳。

3.3.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化 該文對(duì)毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、離子源溫度、鞘氣流速及其溫度、掃描時(shí)間、低能量通道碰撞能量以及高能量碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，最終以檢出色譜峰的數(shù)量和強(qiáng)度為指標(biāo)確定了質(zhì)譜檢測(cè)條件。針對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)極性小分子代謝物組，包括糖酵解產(chǎn)物、三羧酸循環(huán)產(chǎn)物、氨基酸代謝產(chǎn)物等極性代謝物，通過考察同一代謝產(chǎn)物在正、負(fù)離子2種檢測(cè)模式下的出峰情況及準(zhǔn)分子離子峰的響應(yīng)強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)三羧酸循環(huán)產(chǎn)物和磷酸糖類化合物只在ESI^-下有信號(hào)，氨基酸類化合物和腺苷類化合物在2種檢測(cè)模式下均有信號(hào)，因此本研究選擇負(fù)離子模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

3.4 分析方法考察

在總離子流圖上選取內(nèi)標(biāo)α-氨基庚二酸其保留時(shí)間為6.42 min，m/z為174.079 4，以及tR，m/z分別為4.24 min，218.100 3；5.45 min，124.008 7；6.87 min，565.049 3；7.17 min，306.073 6這5個(gè)色譜峰進(jìn)行代謝組學(xué)方法學(xué)考察，計(jì)算保留時(shí)間與峰面積的RSD。保留時(shí)間的精密度、重復(fù)性、系統(tǒng)穩(wěn)定性的RSD分別為0.050%～0.19%，0.030%～0.40%，0.060%～1.0%，4 ℃放置12 h穩(wěn)定性的RSD為0.060%～1.3%。峰面積的精密度、重復(fù)性、系統(tǒng)穩(wěn)定性的RSD分別為0.23%～1.5%，0.16%～0.87%，0.34%～1.9%，4 ℃放置12 h的穩(wěn)定性的RSD為0.32%～1.2%。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明操作和儀器均能進(jìn)行代謝組學(xué)分析。

在最優(yōu)UPLC-MS條件下，分別對(duì)正常組、模型組細(xì)胞樣品進(jìn)行檢測(cè)，得到細(xì)胞代謝指紋圖譜，見圖2，差異部分主要出現(xiàn)在5～7 min處，這些部位可能存在潛在炎癥生物標(biāo)志物。

3.5 與炎癥相關(guān)差異代謝物的尋找

將UPLC-Q-TOF/MS數(shù)據(jù)導(dǎo)入ProgenesisQI軟件，按照2.7項(xiàng)操作處理數(shù)據(jù)后，采用OPLS-DA模型進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析，篩選VIP>1的峰作為潛在差異代謝物。正常組與模型組的OPLS-DA得分圖和S-Plot圖，見圖3。通過HMDB和METLIN數(shù)據(jù)庫(kù)搜索差異物母離子和子離子的精確質(zhì)荷比，初步鑒定了17個(gè)潛在差異代謝物，見表2。

將鑒定出的差異代謝物輸入MPetA數(shù)據(jù)庫(kù)中，構(gòu)建代謝通路圖，見圖4。代謝通路分析表明，丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代謝、三羧酸循環(huán)、精氨酸和脯氨酸代謝等代謝通路與LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)相關(guān)。

LPS刺激會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生“Warburg效應(yīng)”，即糖酵解和磷酸戊糖途徑作用加強(qiáng)，而線粒體內(nèi)的有氧分解減弱，表現(xiàn)為葡萄糖的大量攝取、高糖酵解速率和核酸合成速率等變化。UDP-葡萄糖醛酸由葡萄糖通過糖醛酸途徑生成，是葡糖醛酸的活性供體，也是UDP-單糖由六碳糖轉(zhuǎn)變?yōu)槲逄继堑年P(guān)鍵底物。與正常組相比，模型組中UDP-葡萄糖醛酸含量顯著升高，是正常組的4倍，表明糖醛酸途徑代謝增強(qiáng)。UDP-葡萄糖醛酸代謝生成的葡萄糖醛酸參與抗壞血酸代謝、磷酸肌醇代謝等代謝活動(dòng)中。

LPS刺激巨噬細(xì)胞使得細(xì)胞線粒體氧化磷酸化水平降低，三羧酸循環(huán)產(chǎn)物累積，尤其是琥珀酸。Abhishek K Jha等[7]采用平行的代謝組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)集成發(fā)現(xiàn)被LPS激活的RAW264.7細(xì)胞在異檸檬酸脫氫酶處和琥珀酸處發(fā)生了代謝中止，即異檸檬酸不生成α-酮戊二酸而生成衣康酸，琥珀酸不再繼續(xù)代謝成延胡索酸[8]。累積的琥珀酸主要來源于谷氨酰胺代謝，γ-氨基丁酸旁路對(duì)此也有貢獻(xiàn)[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組相比，炎癥模型組中的琥珀酸、衣康酸含量升高，延胡索酸含量下降，其中模型組琥珀酸含量是正常組的4.59倍，模型組衣康酸含量是正常組的2.05倍，說明琥珀酸和衣康酸可以作為RAW264.7炎癥細(xì)胞的生物標(biāo)志物。

炎癥反應(yīng)可改變機(jī)體的蛋白質(zhì)代謝和氨基酸需要，這主要是因?yàn)榧?xì)胞因子（如IL-1，IL-6，TNF-α）分泌的增加。在免疫反應(yīng)中，氨基酸將發(fā)生重分配并主要用于合成參與炎癥和免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)以及參與免疫細(xì)胞增殖和其他免疫反應(yīng)的重要化合物[10-11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中谷氨酰胺、纈氨酸、鳥氨酸含量升高，天冬氨酸含量降低，涉及了2個(gè)代謝通路，即丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝通路，和纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成通路。谷氨酰胺與谷氨酸可以相互轉(zhuǎn)化，谷氨酸代謝生成γ-氨基丁酸，γ-氨基丁酸進(jìn)一步代謝生成琥珀酸。谷氨酰胺在谷氨酰胺轉(zhuǎn)酰胺酶作用下是將氨基氮轉(zhuǎn)移至不同底物上，為其他代謝反應(yīng)提供氮源[12]。纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸屬于支鏈氨基酸，本實(shí)驗(yàn)篩選出的差異代謝物為纈氨酸，與正常組比較，炎癥模型組中纈氨酸含量明顯升高，其原因?yàn)榧?xì)胞因子的合成需要纈氨酸等支鏈氨基酸的參與。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果中模型組磷酸乙醇胺含量顯著升高，磷酸乙醇胺是神經(jīng)酰胺的代謝產(chǎn)物之一，表明模型組中神經(jīng)酰胺代謝高于正常組。神經(jīng)酰胺是鞘磷脂信號(hào)途徑的中心分子，參與激活多種蛋白激酶和蛋白磷酸酶，在調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫方面起重要作用。炎癥細(xì)胞中上調(diào)的花生四烯酸含量，分泌的白介素、腫瘤壞死因子-α等都可以激活中性鞘磷脂酶，水解鞘磷脂，導(dǎo)致細(xì)胞中神經(jīng)酰胺含量升高[13]。

4 結(jié)論

本文提出了1種能夠高效、穩(wěn)定提取RAW264.7細(xì)胞中極性代謝產(chǎn)物的方法，并采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)對(duì)正常細(xì)胞與炎癥細(xì)胞進(jìn)行分析，獲得了代謝物圖譜，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析手段研究正常細(xì)胞與炎癥細(xì)胞的圖譜變化情況，結(jié)果表明，炎癥細(xì)胞與正常細(xì)胞的代謝物譜圖有顯著變化。通過對(duì)一些具有顯著性差異的物質(zhì)進(jìn)行初步鑒定，得到了17種代謝差異物。與正常細(xì)胞相比，炎癥細(xì)胞在蛋白質(zhì)代謝、磷脂代謝、糖代謝方面發(fā)生不同程度的紊亂，與文獻(xiàn)報(bào)道的采用CE-TOF/MS、氨基酸分析儀檢測(cè)結(jié)果基本相符[14]，證明該方法可以表征RAW264.7細(xì)胞極化，為抗炎藥物研究提供了新的研究方法和思路。

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[責(zé)任編輯 張燕]