植物組織培養(yǎng)技術(shù)在中藥資源中的應(yīng)用

王娟+李金鑫+李建麗+高文遠

[摘要] 植物組織培養(yǎng)技術(shù)以其獨特的優(yōu)勢被廣泛的應(yīng)用于中藥資源領(lǐng)域，在中藥資源保護方面發(fā)揮了重要的作用。該文綜述了近年來植物組織培養(yǎng)的一些應(yīng)用，包括植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)藥用植物活性化合物、遺傳多樣性分析、道地藥材、誘導(dǎo)子應(yīng)用、生物合成及轉(zhuǎn)基因植物等。通過以上研究將進一步促進植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，使其在中藥資源領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

[關(guān)鍵詞] 植物組織培養(yǎng)； 中藥資源； 誘導(dǎo)子； 生物合成

[Abstract] Plant tissue culture technology has been widely used in the field of traditional Chinese medicine（TCM） resources with its unique advantages， playing an important role in the protection of TCM resources. In this review， some applications of plant tissue culture were summarized， including production of active compounds by using plant tissue culture， genetic diversity analysis， Dao-di herbs， elicitor application， biosynthesis and transgenic plants. Through the above researches will promote the further development of plant tissue culture technology， making it play a greater role in the field of TCM resources.

[Key words] plant tissue culture； Chinese medicine resources； elicitor； biosynthesis

中藥資源是我國中藥產(chǎn)業(yè)的基石，隨著我國中藥工藝的快速發(fā)展，大型和超大型企業(yè)不斷涌現(xiàn)、形成和發(fā)展，對我國的中藥資源形成了很大的壓力，近些年中藥材瀕危資源的不斷增加，中藥材價格的不斷增長，足以表明我國資源保護和可持續(xù)利用工作的緊迫性和重要性。通過發(fā)展植物組織培養(yǎng)技術(shù)來解決中藥材的資源問題，對我國具有特殊而且重要的意義。植物組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用可以體現(xiàn)在以下幾個方面：①通過植物組織和器官培養(yǎng)生產(chǎn)活性成分，保護瀕危和珍稀藥用植物資源；②通過遺傳多樣性分析，對植物組織培養(yǎng)材料進行評價；③通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)研究道地藥材遺傳機制和環(huán)境機制；④通過誘導(dǎo)子的添加提高培養(yǎng)物中活性成分含量；⑤利用植物組織培養(yǎng)物進行基因功能篩選、驗證及遺傳轉(zhuǎn)化研究。本文將從以上幾個方面綜述近年來植物組織培養(yǎng)技術(shù)在中藥資源領(lǐng)域中的應(yīng)用。

1 植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)藥用植物活性化合物

藥用植物細胞，毛狀根和不定根培養(yǎng)技術(shù)是生產(chǎn)藥用植物次級代謝產(chǎn)物的一種非常有價值的工具。因此，通過細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物的植物將近1 000種，超過600種的活性成分直接由植物細胞培養(yǎng)提供。目前，100多種毛狀根已經(jīng)成功的被發(fā)根土壤農(nóng)桿菌誘導(dǎo)[1]，主要通過優(yōu)化培養(yǎng)基和關(guān)鍵生理因素去增加毛狀根培養(yǎng)的次級代謝產(chǎn)物的生成。目前，人參，三七，柴胡，甘草，丹參，雷公藤和許多種藥用植物已經(jīng)制定了不定根培養(yǎng)體系。目前，為了大量的生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物，細胞、不定根、毛狀根已經(jīng)成功地應(yīng)用于大規(guī)模培養(yǎng)。例如，人參不定根培養(yǎng)已經(jīng)達到3萬L。金絲桃不定根已經(jīng)達到500 L，紫錐菊不定根已經(jīng)達到1 000 L[2]。韓國，CBN生物科技公司，每年生產(chǎn)大約40～45 t人參不定根，這是一個利用植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)藥品、食品和化妝品的成功范例。主要研究了培養(yǎng)條件的優(yōu)化和誘導(dǎo)子的使用來提高次級代謝產(chǎn)物的含量。由WHO資助的半合成青蒿素已經(jīng)被賽諾菲公司研制成功，其用發(fā)酵方法由單糖生產(chǎn)的青蒿酸在2013年已形成60 t左右產(chǎn)能。Phyton為成為世界領(lǐng)先的高品質(zhì)紫杉醇生產(chǎn)商已進行了巨額投資。我國具有通過植物細胞發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇的巨大產(chǎn)能，杜絕了對紫杉樹種植的依賴，也避免了他們與環(huán)境、可持續(xù)性、可靠性和質(zhì)量穩(wěn)定性相關(guān)的固有問題。近年來藥用植物細胞，毛狀根和不定根次級代謝產(chǎn)物的積累情況見表1。

近年來，藥用植物細胞，毛狀根和不定根培養(yǎng)受到了廣泛關(guān)注，因為它提供了許多植物次級代謝產(chǎn)物?？偟膩碚f，藥用植物的細胞，毛狀根和不定根是逐年增加的，并且它的培養(yǎng)規(guī)模已經(jīng)逐漸擴大。

2 遺傳多樣性分析

植物組織培養(yǎng)是植物快速大量增值的一種潛在工具，并且有利于控制重要次級代謝產(chǎn)物的生成。然而再生植株的遺傳基因會發(fā)生一定程度的變異，從而造成植株化學(xué)成分的改變及其臨床療效的差異，影響組織培養(yǎng)的優(yōu)點[40]。因此，必須保證組培植株基因的一致性，以確保植株的質(zhì)量。用于監(jiān)測遺傳基因變化的方法有簡單重復(fù)序列，隨機擴增多態(tài)性DNA和相關(guān)序列擴增多態(tài)性。

簡單重復(fù)序列通常形成具有具體基因，少許具體標記物的種族。隨機擴增多態(tài)性DNA方法是一種PCR技術(shù)，隨機擴增DNA片段，使用低于最低退火溫度的核苷酸序列的單一引物。這個技術(shù)已經(jīng)廣泛用于種族分類，遺傳作圖和種系發(fā)生[41-42]。在吊燈花屬快繁的研究中，在植株的直接芽器官發(fā)生，間接芽器官發(fā)生和母本植物之間比較基因穩(wěn)定性，結(jié)果顯示通過簡單重復(fù)序列和隨機擴增多態(tài)性DNA方法，直接芽器官發(fā)生的基因和母本植物是相似的，間接芽器官發(fā)生的隨機擴增多態(tài)性DNA指紋圖譜顯示出低的變異率[40]。相關(guān)序列擴增多態(tài)性是簡單的有效地生產(chǎn)高再生性和多功能性的全組基因片段。在人參懸浮細胞培養(yǎng)中，通過隨機擴增多態(tài)性DNA方法在懸浮細胞與幼苗之間比較基因穩(wěn)定性，結(jié)果顯示懸浮細胞的基因和幼苗是相似的[43]。在擬南芥懸浮細胞培養(yǎng)中，通過簡單重復(fù)序列方法來比較懸浮細胞和擬南芥植株的基因穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)懸浮細胞的基因和幼苗是相似的[44]。

3 道地藥材

道地性歸根結(jié)底是道地藥材所擁有的基因型受到特定生境（道地產(chǎn)區(qū)）中環(huán)境因子誘導(dǎo)后表達的產(chǎn)物。因此，基因表達是道地藥材研究的重要環(huán)節(jié)，而功能基因表達的調(diào)控是道地藥材研究的目標之一[45]。揭示道地藥材和非道地藥材在基因表達方面的差異是道地藥材功能基因研究的重要內(nèi)容。由于基因表達對研究所用RNA材料的要求較高，且通常需要通過對比實驗來完成，造成道地藥材基因表達及調(diào)控實驗?zāi)壳爸饕性趯嶒炇抑小Ｓ捎诩毎囵B(yǎng)和組織培養(yǎng)周期較短，材料易于獲得，均勻性較好，因此道地藥材功能基因表達與調(diào)控研究多是在植物組織和細胞中開展[46]。

例如，黃新等[47]利用mRNA差異顯示技術(shù)研究茉莉酸甲酯對紅豆杉細胞mRNA表達的差異。李娟等[48]考察了碳源、氮源、有機成分對HBsAg轉(zhuǎn)基因人參細胞生長和HBsAg表達量的影響。劉峻等[49]研究了真菌誘導(dǎo)子影響人參毛狀根總皂苷的合成量。以上研究，雖然距離真正的實現(xiàn)道地藥材功能基因的表達和調(diào)控尚有一段距離，但為道地藥材功能基因表達和調(diào)控研究積累了思路和方法。

4 誘導(dǎo)子作用機制及其應(yīng)用

4.1 誘導(dǎo)子的作用機制

誘導(dǎo)子被植物細胞膜或細胞質(zhì)中的接受體識別后，細胞膜便開始去極化，引起離子通道的開閉，如Ca²⁺從環(huán)境中流入細胞質(zhì)，K⁺和Cl^-流出，或者通過 G 蛋白偶聯(lián)，激活第二信使系統(tǒng)，進一步的擴大這種效應(yīng)，產(chǎn)生植物防御分子，如鈣離子（Ca²⁺）、活性氧（ROS）、水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）、一氧化氮（NO）、乙烯（ET）等，進而引起下游防衛(wèi)基因的表達，改變相關(guān)酶的活性，并最終導(dǎo)致次級代謝產(chǎn)物的積累，見圖1[50]。

4.1.1 細胞內(nèi)信號分子和作用機制 植物細胞信號分子主要作用偶合各種胞內(nèi)外刺激，包括生物或者非生物刺激，再通過細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)使得刺激和細胞間信號級聯(lián)放大，最終導(dǎo)致相關(guān)酶活性的改變，進而引起一系列生理生化反應(yīng)。例如，誘導(dǎo)子刺激后，細胞質(zhì)中鈣離子（Ca²⁺） 濃度的升高、一氧化氮合成、活性氧迸發(fā)、茉莉酸合成途徑激活等，誘導(dǎo)防御基因的開啟，刺激代謝途徑中關(guān)鍵酶的合成，最終促進植物次級代謝產(chǎn)物的合成[51]。

鈣離子：誘導(dǎo)子刺激后，植物細胞在短時間內(nèi)出現(xiàn)離子流，如Ca²⁺和H⁺從環(huán)境中流入細胞質(zhì)，K⁺和Cl^-流出等。這些Ca²⁺可以驅(qū)動鈣離子受體鈣調(diào)蛋白（CaM）的反應(yīng)，一旦鈣調(diào)蛋白激活后，可以進一步激活與鈣調(diào)蛋白相關(guān)的蛋白激酶，從而引發(fā)蛋白的磷酸化，進而引起防御基因的表達[90]。例如，Ca²⁺含量迅速上升后，激活鈣調(diào)蛋白，會使大量的NAD（P）H氧化酶被激活，NADPH氧化酶可以催化過氧化物的產(chǎn)生和積累，從而進一步引起并下游一系列的反應(yīng)，刺激次級代謝物的積累[52]。Ca²⁺內(nèi)流以后，可作為信號分子激活磷脂酸 C，進而使磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）水解產(chǎn)生 2 個第二信使： IP3（三磷酸肌醇）和 DAG（甘油二酯）。其中，DAG 可以與蛋白激酶結(jié)合，激活蛋白激酶 C，從而觸發(fā)蛋白磷酸化信號級聯(lián)，引起細胞內(nèi)代謝物的積累。IP3 可以與細胞內(nèi)鈣庫（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、葉綠體、液泡等）上的鈣離子通道受體結(jié)合，進而動員細胞內(nèi)鈣庫中鈣離子的釋放。IP3-Ca²⁺信號途徑被認為是誘導(dǎo)植物抗毒素產(chǎn)生的調(diào)節(jié)物質(zhì)[53]。在長春花懸浮細胞過程中加入真菌粗提物作為誘導(dǎo)子時，IP3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被激活，從而進一步使長春花細胞中生物堿的含量提高[54]。

活性氧：植物防御早期的另一個重要變化是活性氧的迸發(fā)現(xiàn)象?；钚匝鯘舛壬呖梢宰鳛榈诙攀挂l(fā)胞內(nèi)一系列抗性反應(yīng)，如可以促進結(jié)構(gòu)蛋白和木質(zhì)素的合成使細胞壁增厚，細胞超敏死亡等，另外，活性氧介導(dǎo)的脂質(zhì)氧化可以刺激茉莉酸及相關(guān)化合物的合成，誘導(dǎo)次級代謝防御基因和次生代謝物合成基因的表達，進而誘導(dǎo)次級代謝[55]。在紅豆杉細胞培養(yǎng)過程中，經(jīng)尖孢鐮刀菌的細胞壁粗提物誘導(dǎo)后，紅豆杉細胞中活性氧大量積累，最終會導(dǎo)致細胞中紫杉醇的含量顯著上升，與對照相比提高了近4倍[56]。但是高濃度的活性氧，如 O^2-，H₂O₂，OH^-，1O₂會損傷細胞內(nèi)的成分?？寡趸阁w系，如超氧化物歧化酶 （SOD）、過氧化物酶 （POD）以及過氧化氫酶 （CAT）等，會被激活，從而減輕活性氧的毒性作用，增強植物的耐受性[57]。在丹參細胞培養(yǎng)過程中，Dong等[58]發(fā)現(xiàn)在丹參細胞培養(yǎng)基中加入水楊酸，酚類化合物的含量會顯著增加，同時抗氧化物酶SOD，POD，CAT 的活性也會增加。

茉莉酸類：在許多的植物細胞培養(yǎng)體系中，誘導(dǎo)子都可以誘導(dǎo)內(nèi)源的茉莉酸類物質(zhì)的合成，其可作為細胞內(nèi)和細胞間的信號分子，與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，進而調(diào)節(jié)防御基因的表達，最終導(dǎo)致次生代謝物質(zhì)的合成[59]。茉莉酸類也可以刺激次級代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的基因的表達，從而促進一系列次級代謝產(chǎn)物的合成，包括萜類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)、生物堿和苯丙烷類物質(zhì)[50]。在貫葉連翹細胞懸浮培養(yǎng)過程中，在培養(yǎng)基中加入黑曲霉細胞壁的粗提物作為誘導(dǎo)子時，茉莉酸的合成量迅速增加，同時細胞中金絲桃素的含量也迅速增加，而加入茉莉酸合成抑制劑后，細胞中金絲桃素的含量顯著下降[57]。

一氧化氮和水楊酸：在自然界中，水楊酸（SA）是植物與病原菌相互作用的誘導(dǎo)物，它能夠誘導(dǎo)發(fā)病機制相關(guān) （PR） 基因的表達及和致病相關(guān)蛋白的產(chǎn)生，但是，水楊酸不是存在于所有植物防御代謝中[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在部分植物的細胞中，水楊酸的迅速合成，可以誘導(dǎo)一些與代謝相關(guān)基因的表達，促使一些次生代謝產(chǎn)物的積累，例如，在茜草的培養(yǎng)過程中，SA可以增加細胞中蒽醌類物質(zhì)的積累[60]。一氧化氮（NO）作為信號化合物，近年來才逐漸被認識。在植物體內(nèi)，NO可以通過一氧化氮合成酶（NOS）、硝酸鹽還原酶（NR）或者非酶促反應(yīng)來合成[59]。轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果表明，NO處理后，可以引起植物細胞內(nèi)與壓力和抗病性相關(guān)的基因的表達，說明了NO信號途徑可能與細胞內(nèi)的次生代謝相關(guān)[61]。另外，NO還可以作用于水楊酸（SA）等信號分子的上游，參與和調(diào)控植物細胞中SA等信號分子的生物合成[62]。

其他信號分子：除了上述信號分子外，乙烯和脫落酸都是植物的內(nèi)源性激素，參與調(diào)節(jié)植物細胞內(nèi)生長和發(fā)育的多種生理活動，如生長、衰老、植物應(yīng)激反應(yīng)等[50]。此外，乙烯、脫落酸等也在誘導(dǎo)子誘導(dǎo)的抗性反應(yīng)中起重要作用，在不同濃度下它們從抑制和促進兩方面影響次生代謝產(chǎn)物的積累[53]。例如，在加拿大紅豆杉的培養(yǎng)過程中，乙烯可以促進低聚糖和茉莉酸甲酯對紅豆杉細胞的誘導(dǎo)作用，增加紫杉醇的積累[63]。但是在丹參毛狀根培養(yǎng)中，加入乙烯的抑制劑，反而會促進細胞中3種丹參酮的合成[64]。

4.1.2 轉(zhuǎn)錄因子 轉(zhuǎn)錄因子也稱為反式作用因子，是指能夠與真核基因啟動子區(qū)域中順式作用因子特異性結(jié)合的 DNA 結(jié)合蛋白。通過蛋白與基因之間以及蛋白與蛋白之間的相互作用，激活或抑制轉(zhuǎn)錄[65]。

誘導(dǎo)子刺激植物以后，往往是多種信號途徑構(gòu)成一個相互交錯的工作網(wǎng)共同起作用，它們通過相互協(xié)調(diào)，刺激次生代謝物質(zhì)的合成。其中，轉(zhuǎn)錄因子可以對多個信號途徑進行整合，激活防御基因，使得宿主關(guān)閉一些基因表達而開啟另一些基因表達的信號傳遞和調(diào)控，產(chǎn)生特定的次級代謝產(chǎn)物[66]。例如，真菌誘導(dǎo)子或者茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后，可以引起細胞中AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的轉(zhuǎn)錄因子的迅速積累，然后AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子識別的順式元件GCCbox，從而激活乙烯響應(yīng)基因的表達，進而激活下游異胡豆苷合酶的基因和生物堿合成相關(guān)的基因的表達，最終促進生物堿的積累[67]。

4.1.3 抗性基因的表達 誘導(dǎo)子與植物受體的相互識別后，第二信使的形成，會使抗性相關(guān)基因激活，從而相應(yīng)的mRNA累積及相應(yīng)酶的才會增加，最后促進次級代謝物質(zhì)的產(chǎn)生。

目前研究得比較多并且己經(jīng)得到克隆的抗性基因主要有：病程相關(guān)蛋白P（R）的基因如幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶等基因； 木質(zhì)素合成相關(guān)酶的基因如PAL，PO等的基因； 富含輕脯氨酸糖蛋白和富含甘氨酸糖蛋白的基因； 鈣離子依賴蛋白激酶的基因；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因等。研究發(fā)現(xiàn)，許多植物防御反應(yīng)基因都是誘導(dǎo)表達的[68]。例如，在草莓的培養(yǎng)過程中，Landi等[69]考察了殼聚糖、苯并噻二唑和有機酸對草莓細胞中抗性相關(guān)基因表達量的影響，結(jié)果表明，3種誘導(dǎo)子都可以激活與鉀離子通道、聚半乳糖醛酸酶、β-1，3-葡聚糖酶相關(guān)的抗性基因的表達，另外，苯并噻二唑也可以上調(diào)與鈣離子依賴蛋白激酶、β-1，4-葡聚糖酶、抗壞血酸過氧化酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶相關(guān)的抗性基因的表達量。

4.2 誘導(dǎo)子在組織培養(yǎng)中的應(yīng)用

4.2.1 誘導(dǎo)子的定義與分類 從植物病理學(xué)方面來講，誘導(dǎo)子是一種可以引起植物自身產(chǎn)生抗病反應(yīng)以產(chǎn)生抗毒素（植保素）和過敏反應(yīng)來保護自己的化學(xué)物質(zhì)或生物因子；從植物組織培養(yǎng)方面來講，誘導(dǎo)子是一種能促進植物細胞產(chǎn)生目標代謝物以及能引起某一組織內(nèi)生理變化的化學(xué)物質(zhì)或生物因子[70]。根據(jù)來源，誘導(dǎo)子可分為生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子。生物誘導(dǎo)子主要包括真菌、細菌、病毒的滅活菌體，細胞粗提物以及某種成分、菌體分泌物以及當病原體或害蟲侵染植物時植物的分泌物等。非生物誘導(dǎo)子主要包括金屬離子、植物內(nèi)源激素（茉莉酸、水楊酸、茉莉酸甲酯、脫落酸等）、化合物、理化因素（紫外光、溫度、超聲、水分、pH、鹽強等）、氣體（臭氧、一氧化氮、過氧化氫、二氧化碳、乙烯等）。

利用誘導(dǎo)子來提高次級代謝產(chǎn)物含量是目前在藥用植物組織培養(yǎng)上常用的方法。其中最常用的是生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子[70]。

4.2.2 生物誘導(dǎo)子在植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用 生物誘導(dǎo)子中研究最多與最廣泛的為真菌誘導(dǎo)子。1968年，Crutckshand等發(fā)現(xiàn)首個真菌誘導(dǎo)子Monilinia fructicola（褐腐病菌）菌絲體中的一種小分子多肽Monilicolin A能促進菜豆內(nèi)表皮的形成與菜豆素的積累[71]。從此真菌誘導(dǎo)子受到越來越多的關(guān)注。

真菌誘導(dǎo)子主要包括真菌滅活菌體、真菌活菌、真菌菌體成分、真菌分泌物（培養(yǎng)液）等。在化學(xué)成分上主要包括多糖、低聚糖、多肽、蛋白、不飽和脂肪酸等。

真菌滅活菌體誘導(dǎo)子是指將真菌的菌絲體或孢子收獲后，用蒸餾水清洗干凈，放入烘箱烘干后，用研缽研成粉末，加入適量蒸餾水后放入滅菌鍋中121 ℃滅菌25 min。菌絲體或孢子發(fā)生降解或部分降解。一般將滅活菌體溶液在一定時間加入植物培養(yǎng)物培養(yǎng)基，處理一定時間來誘導(dǎo)植物培養(yǎng)物的生長以及次級代謝產(chǎn)物的積累。真菌滅活菌體作為誘導(dǎo)子在植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用，見表2。

真菌活菌作為誘導(dǎo)子是指將一定數(shù)目的真菌孢子加入植物組織培養(yǎng)物中。Awad等[86]認為，體外培養(yǎng)植物與栽培植物相比，體外培養(yǎng)通常是無菌環(huán)境，缺少與植物共生和非共生的土壤微生物，這可能造成體外培養(yǎng)植物細胞中次級代謝產(chǎn)物含量低的原因。因此，在Taverniera cuneifolia的培養(yǎng)過程中，考察了用5種真菌（黑曲霉、曲霉、青霉、串珠鐮刀霉和凍土毛霉）和5種細菌（噬胺芽孢桿菌、發(fā)根農(nóng)桿菌、致瘤農(nóng)桿菌、蠟樣芽孢桿菌和豆科根瘤菌）活菌為誘導(dǎo)子，對不定根中的甘草酸含量的積累，結(jié)果表明所有誘導(dǎo)子都可以提高不定根中甘草酸的含量，其中加入凍土毛霉后，甘草酸質(zhì)量分數(shù)為4.90 mg·g^-1，加入致瘤農(nóng)桿菌后，甘草酸達到了6.37 mg·g^-1，均高于空白組（1.46 mg·g^-1）和茉莉酸甲酯（2.57 mg·g^-1）處理組。

真菌菌體成分作為誘導(dǎo)子是指菌體中的某一成分作為誘導(dǎo)子加入植物組織培養(yǎng)物中。周立剛等考查了Fusarium oxysporium Dzf17菌低聚糖對盾葉薯蕷懸浮細胞的影響。首先考察了胞外多糖（EPS），水提菌絲體多糖（WPS）、氫氧化鈉提取的菌絲體多糖（SPS）的添加時間以及多糖濃度對盾葉薯蕷懸浮細胞生長以及細胞中薯蕷皂苷元含量的影響。結(jié)果顯示，WPS的效果最好，在細胞培養(yǎng)第25天時加入20 mg·L^-1的WPS可以使細胞生物量、薯蕷皂苷元的含量和產(chǎn)量分別達到空白組的1.34，2.85，3.83倍[87]。接著周立剛等又考察了WPS中低聚糖DP4，DP7，DP10的的添加時間、多糖濃度以及添加次數(shù)對盾葉薯蕷懸浮細胞中薯蕷皂苷元含量的影響。結(jié)果顯示，在細胞培養(yǎng)分別在第24，26天時連續(xù)加入6 mg·L^-1 DP7，在第30天時收獲，薯蕷皂苷元的含量和產(chǎn)量分別為空白組的9.19，12.38倍比單次加入刺激的效果好[88]。此外周立剛等還考察了分別來自于EPS，WPS，SPS的低聚糖EOS，WOS，SOS作用不同時間段對盾葉薯蕷懸浮細胞中防御相關(guān)酶（PAL，POD，PPO）活性的影響，結(jié)果顯示EOS，WOS都能顯著增加防御相關(guān)酶的活性，說明內(nèi)生菌F. oxysporium Dzf17中的低聚糖可能激活和增強盾葉薯蕷懸浮細胞的防御機制[89]。真菌菌體成分作為誘導(dǎo)子在植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用見表3。

真菌分泌物誘導(dǎo)子是指將真菌的發(fā)酵液收集后，用4層紗布進行過濾，1萬×g 離心20 min后，用0.4 μm的濾膜進行過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀把過濾后的發(fā)酵液濃縮到一定體積，放入滅菌鍋中121 ℃滅菌25 min。一般將滅活菌體發(fā)酵液在一定時間加入植物培養(yǎng)物培養(yǎng)基，處理一定時間來誘導(dǎo)植物培養(yǎng)物的生長以及次級代謝產(chǎn)物的積累。真菌分泌物體作為誘導(dǎo)子在植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用，見表4。

4.2.3 非生物誘導(dǎo)子在植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用 水楊酸（SA）和茉莉酸類化合物 [茉莉酸（JA），茉莉酸甲酯（MJ）]由于可以通過誘導(dǎo)多種植物次級代謝產(chǎn)物合成途徑中基因的表達來促進次級代謝產(chǎn)物含量的增加而廣為人知。除此之外，由于他們可以在低濃度誘導(dǎo)遠離他們合成部分的細胞反應(yīng)，又被成為植物激素。其中，茉莉酸甲酯類應(yīng)用最廣泛，目前已經(jīng)成功應(yīng)用于人參、柴胡、百部、甘草、西洋參、匙羹藤、柴胡、紫錐菊、雷公藤、睡茄、刺五加、苦艾和積雪草等植物組織培養(yǎng)中來提高細胞中次級代謝物的含量。

在苦艾懸浮細胞培養(yǎng)中，添加1.0 mg·L^-1的茉莉酸以及茉莉酸甲酯可以使其總酚，總黃酮的含量增加，另外，可以提高自由基清除能力[97]。加入10 mg·L^-1的茉莉酸甲酯到人參不定根的培養(yǎng)液中，人參皂苷約32 mg·g^-1是空白組的4.76倍[98]。

化學(xué)合成誘導(dǎo)子一般指的是對已知的誘導(dǎo)子進行改造，通過化學(xué)合成，在誘導(dǎo)子分子結(jié)構(gòu)上加入一些官能團等，來提高誘導(dǎo)子的誘導(dǎo)能力，增加藥用植物細胞中次級代謝物的積累。其中，最常見的是對茉莉酸甲酯的改造。例如，在三七懸浮細胞的培養(yǎng)過程中加入五氟丙基茉莉酸甲酯、2-羥乙基茉莉酸甲酯以及2-羥基乙氧基乙基，結(jié)果發(fā)現(xiàn)他們都能顯著增加人參皂苷的含量[99]。Qian等[100]考察了2-羥乙基茉莉酸甲酯和三氟乙基茉莉酸甲酯對紅豆杉細胞中次級代謝產(chǎn)物的誘導(dǎo)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2-羥乙基茉莉酸甲酯和三氟乙基茉莉酸甲酯能顯著提高紅豆杉細胞中紫杉烷C的含量，質(zhì)量分數(shù)分別達到44.3，39.7 mg·g^-1，均高于對照組（茉莉酸甲酯處理組）的含量（質(zhì)量分數(shù)分別為14.0，32.4 mg·g^-1）。

除了常用的上述這些化合物外，還有一些物理因子如紫外光、溫度、超聲，金屬離子，水分，pH，鹽強，氣體如臭氧、一氧化氮、過氧化氫、二氧化碳、乙烯等都能提高次級代謝產(chǎn)物的含量。

5 生物合成生產(chǎn)藥用植物活性成分

由于生長受到自然環(huán)境的影響，許多藥用植物生長緩慢或栽培機制復(fù)雜。中藥材中的活性成分存在含量低、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、不穩(wěn)定、很難化學(xué)合成或產(chǎn)率地下等缺點。利用生物技術(shù)生產(chǎn)活性成分有許多優(yōu)點：包括生長周期短、生產(chǎn)標準化、質(zhì)量穩(wěn)定等，為中藥資源保護提供了新的途徑。隨著生物合成技術(shù)在青蒿素、紫杉醇，丹參酮和人參皂苷生物合成研究中的應(yīng)用，預(yù)測生物合成技術(shù)將成為中藥可持續(xù)利用的重要途徑之一。近年來利用生物合成來生產(chǎn)活性成分的例子見表5。

藥用植物有效成分的生物合成是在基因組學(xué)的研究基礎(chǔ)上，通過在細胞中構(gòu)建有效成分的生物合成途徑和代謝網(wǎng)絡(luò)，從而實現(xiàn)藥用有效成分的定向、高效的合成，以解決藥用有效成分的生產(chǎn)及藥物研發(fā)等一系列問題[52]。植物組織培養(yǎng)在生物合成中的應(yīng)用包括功能基因的挖掘和基因功能體內(nèi)驗證。

基因功能基因的挖掘主要是通過轉(zhuǎn)錄組測序來實現(xiàn)的。Subramaniyam等[101]對MJ處理不同時間的人參不定根進行了轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)30個轉(zhuǎn)錄因子，11個GT與人參皂苷合成有關(guān)。Nuruzzaman等[102]對MJ處理過的人參不定根以及未處理過的不定根進行測序，發(fā)現(xiàn)48個轉(zhuǎn)錄因子與人參皂苷的合成相關(guān)。Jayakodi等[103]對2種人參材料誘導(dǎo)出的不定根以及栽培人參進行了轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)不定根中90%的基因與數(shù)據(jù)庫得到一致，17%的基因是栽培品中所沒有的，此外還發(fā)現(xiàn)了一些與人參皂苷合成相關(guān)的候選功能基因。

基因功能的體內(nèi)驗證主要是通過在植物組織培養(yǎng)器官體內(nèi)進行基因沉默以及過表達來實現(xiàn)的。Park等[104]通過把CYP716A53v2基因在PCR 8.0中進行克隆，然后與pH2WG連接構(gòu)建過表達載體，然后導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，侵染人參胚狀體，經(jīng)過篩選得到CYP716A53v2過表達根系；另一方面，把CYP716A53v2基因進行沉默，構(gòu)建相應(yīng)的沉默載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中繼而侵染人參胚狀體，經(jīng)過篩選得到CYP716A53v2沉默根系。研究發(fā)現(xiàn)，過表達根系中CYP716A53v2基因的表達以及原人參三醇類皂苷含量高于正常根系，沉默根系中CYP716A53v2基因的表達以及原人參三醇類皂苷含量低于正常根系，說明CYP716A53v2基因的功能是轉(zhuǎn)化原人參二醇為原人參三醇。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]