一株枯草芽孢桿菌的生長特性及抑藻效果研究

程新 李昆太 黃林

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，南昌 330045）

一株枯草芽孢桿菌的生長特性及抑藻效果研究

程新 李昆太 黃林

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，南昌 330045）

溶藻微生物能引起水華藍(lán)藻的快速消亡，從而達(dá)到控制水華之目的。為了探討枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）對銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）及小球藻（Chlorell）的抑制效果，在實(shí)驗(yàn)室條件下研究了枯草芽孢桿菌對兩種藻類生長的影響、抑制藻類生長的作用方式以及發(fā)酵液處理下銅綠微囊藻丙二醛（MDA）及谷胱甘肽（GSH）含量、超氧化物歧化酶（SOD）及過氧化氫酶（CAT）活性。試驗(yàn)結(jié)果表明，篩選出的菌株具有較好的環(huán)境適應(yīng)性和抑制藻類生長的能力，其抑制效果是通過分泌胞外物質(zhì)實(shí)現(xiàn)的。經(jīng)過枯草芽孢桿菌處理后，銅綠微囊藻的葉綠素a及藻體蛋白含量均顯著低于對照組，而胞內(nèi)MDA及GSH含量顯著升高，SOD及CAT活性也有增高的趨勢。

枯草芽孢桿菌；藻類；抑制；生長特性

水體的富營養(yǎng)化已成為世界各地水污染治理中普遍遇到的環(huán)境問題， 而因此產(chǎn)生的藻類過度繁殖進(jìn)而引起水華是導(dǎo)致水環(huán)境惡化的關(guān)鍵因子之一［1］。除了造成水體生物化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變和水體功能下降之外，部分藻類還會向水體釋放的有毒次生代謝物質(zhì)，嚴(yán)重危害到人類和動物的健康［2］。如何控制和消除富營養(yǎng)化水體中有害藻類的暴發(fā)性增長是生態(tài)學(xué)和環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的重要研究課題。

與化學(xué)和物理控藻方法相比，生物控藻技術(shù)具有成本低、持續(xù)周期長等特點(diǎn)，近年來成為研究的熱點(diǎn)［3］，已有大量研究表明采用溶藻細(xì)菌、水生植物分泌的化感物質(zhì)、食藻微小動物和魚類等生物控制技術(shù)防治藻類爆發(fā)，都具有較好的效果［4］。但綜合現(xiàn)有的研究報(bào)道來看，篩選得到的溶藻生物除藻能力低、生長速度慢、治理成本高等缺點(diǎn)仍然是制約生物除藻的關(guān)鍵因素［5］，而枯草芽孢桿菌由于具備菌體密度高、培養(yǎng)及運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)，在水體污染治理方面具有巨大的應(yīng)用潛力［6］。本研究以銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）和小球藻（Chlorella）為目標(biāo)藻體，篩選對其具有較好抑制作用的枯草芽孢桿菌，并對其生長特性和溶藻方式進(jìn)行研究，以期為富營養(yǎng)化水體處理及生物控藻提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）及小球藻（Chlorella）均為課題組自行保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基采用LB固體培養(yǎng)基［7］，115℃滅菌25 min；藻種培養(yǎng)采用BG11培養(yǎng)基［8］，115℃滅菌25 min。

1.2 方法

1.2.1 溶藻菌的篩選 將銅綠微囊藻及小球藻菌種接至BG11培養(yǎng)基，課題組自行保存的枯草芽孢桿菌采用LB培養(yǎng)基活化8 h（菌細(xì)胞濃度大約為1.0×108cells/mL）后按1∶9的比例接入BG11培養(yǎng)基，28℃，光照4.8±0.2 klx（日光燈源）培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)空白對照，培養(yǎng)4 d 后分別測定葉綠素a 濃度和藻體蛋白含量，計(jì)算溶藻菌對葉綠素a及藻體蛋白合成的抑制率。葉綠素a測定采用丙酮提取法，具體測定及計(jì)算方法見參考文獻(xiàn)［9］。蛋白質(zhì)含量測定參照文獻(xiàn)［5］進(jìn)行，略有改動。培養(yǎng)4 d后，分別取培養(yǎng)液2 000 r/min 離心10 min，用無菌水進(jìn)行洗滌，重復(fù)上述操作4次，最終獲得藻泥，然后用細(xì)胞破碎儀對藻泥進(jìn)行細(xì)胞破碎，破碎液在4℃下10 000 r/min離心15 min，收集上清液，采用紫外線測定其中蛋白質(zhì)濃度，測定波長為280 nm和260 nm，蛋白質(zhì)含量（g/L）計(jì)算公式如下：蛋白質(zhì)含量（g/L）=1.55×OD280-0.76×OD260。

1.2.2 菌株及共培養(yǎng)生長曲線測定 將保存在固體培養(yǎng)基上的5#菌株接種到裝有15 mL滅菌LB液體培養(yǎng)基試管中，經(jīng)過8 h 培養(yǎng)活化后用無菌移液槍按1.0%的接種量接種到裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于28℃，150 r/min進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣，在721分光光度計(jì)上測OD600值。共培養(yǎng)生長曲線方法如下：將生長對數(shù)期的5#菌培養(yǎng)液

（菌細(xì)胞濃度大約為1.0×108cells/mL），按體積比1 :9 加入到藻培養(yǎng)液中進(jìn)行共培養(yǎng)。菌藻共培養(yǎng)條件為28℃，光照4.8±0.2 klx（日光燈源），每隔48 h取藻菌培養(yǎng)液，對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)方法采用直接計(jì)數(shù)法，以藻單獨(dú)培養(yǎng)液做對照。藻細(xì)胞計(jì)數(shù)參照文獻(xiàn)進(jìn)行，將藻培養(yǎng)液用力振蕩混勻，然后于無菌操作臺取1 mL加入到2.5 mL EP 管中，再加入1滴KI-I2溶液，染色15 min。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，將染色后液體滴入藻細(xì)胞計(jì)數(shù)板，于光學(xué)顯微鏡（100×）觀察并計(jì)數(shù)，每樣計(jì)數(shù)10次，計(jì)算平均數(shù)。1.2.3 環(huán)境條件對溶藻菌生長的影響 設(shè)置不同溫度、pH 值及鹽度條件研究5#菌株對環(huán)境條件的耐受能力。采用LB 液體培養(yǎng)基于28℃、150 r/min條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，24 h后測定發(fā)酵液OD600值。

1.2.4 銨及磷酸鹽對溶藻菌生長的影響 向基礎(chǔ)LB培養(yǎng)基中添加不同濃度的NH4Cl及KH2PO4，28℃，150 r/min進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，24 h后測定發(fā)酵液OD600值。1.2.5 丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）含量及相關(guān)酶活測定 藻細(xì)胞裂解液的制備同1.2.1。各種物質(zhì)含量及酶活測定均采用南京建成生物工程公司生產(chǎn)的測定試劑盒進(jìn)行，方法參照說明書。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 除特別說明外，每個(gè)試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)對照。數(shù)據(jù)處理及繪圖采用ORIGIN 8.1進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 枯草芽孢桿菌對藻葉綠素a及藻體蛋白合成的抑制

以課題組保存的5株枯草芽孢桿菌為篩選對象，研究其生長性能及其對兩種藻類葉綠素a及藻體蛋白合成的抑制效果，結(jié)果（圖1）顯示，5株枯草芽孢桿菌對兩種藻類都具有一定的抑制效果，其中以對銅綠微囊藻的抑制效果較好。5#菌株對兩種藻類葉綠素a的抑制率最高，而1#和5#菌株對兩種藻類蛋白抑制率最佳。從生長能力來看，2#菌株的生長速度最快，24 h后OD600可達(dá)2.8以上，而5#和1#菌株的生長能力次之。綜上，選擇枯草芽孢桿菌5#作為代表菌株來進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 5#菌株的生長曲線及其對藻生長的影響

分別研究了5#菌株的生長曲線及其對藻類生長的影響，結(jié)果如圖2所示。從圖2-A可以看出，5#菌株的遲緩期較短，而對數(shù)增長期繁殖速度較快，當(dāng)培養(yǎng)到15 h左右時(shí)，5#菌株的生長量達(dá)到最大，經(jīng)平板計(jì)數(shù)其最大生物量可達(dá)1.0×1010cells/mL以上，隨培養(yǎng)時(shí)間延長菌體生物量略有降低。從圖2-B中可以看出，5#菌株與兩種藻類共培養(yǎng)過程中，銅綠微囊藻和小球藻的生長均受到一定的抑制，其中以銅綠微囊藻所受影響最為顯著。

2.3 環(huán)境因子對枯草芽孢桿菌生長的影響

5#菌株在不同溫度、pH及NaCl濃度條件下的生長情況（圖3）顯示，其在低溫條件下生長會受到一定的抑制，而在30-37℃條件下生長最為良好。從酸堿適應(yīng)情況來看，該菌株在中性條件下生長最為良好，過酸或過堿的條件均會對其生長 造成不利影響，而高濃度的鹽也會對其生長造成不利的影響。

2.4 銨及磷酸鹽對枯草芽孢桿菌生長的影響

從圖4的結(jié)果可以看出，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上適當(dāng)增加氮、磷的含量，能夠提高5#菌株的生長能力，但當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)繼續(xù)升高時(shí)，菌體的生長能力受到一定的抑制。

2.5 枯草芽孢桿菌溶藻方式的研究

不同處理?xiàng)l件下的發(fā)酵液對藻類生長的抑制效果（圖5）可以看出，去除發(fā)酵液后重新懸浮的單一細(xì)胞對于銅綠微囊藻和小球藻只有很小的抑制能力，而無菌濾 液的抑制能力則高達(dá)60%以上，與未過濾的原菌株菌液的溶藻活性相當(dāng)，這表明菌株的溶藻活性主要來源于發(fā)酵后的濾液，并不需要細(xì)菌細(xì)胞與藻細(xì)胞直接接觸，即菌株對于藻類的抑制效應(yīng)并不是通過直接溶藻方式，而是通過產(chǎn)生溶藻活性物質(zhì)到濾液中以間接溶藻方式實(shí)現(xiàn)的。

圖1 不同菌株的生長能力（A）及其對葉綠素a（B）及藻體蛋白（C）的去除率

圖2 5#菌株的生長曲線（A）及其對藻類生長的影響（B）

2.6 枯草芽孢桿菌對藻細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的影響

選擇銅綠微囊藻為目標(biāo)藻種，研究在細(xì)菌溶藻過程中細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)（MDA、GSH、SOD和CAT）含量（活性）的變化，結(jié)果如圖6所示。加入溶藻細(xì)菌后，銅綠微囊藻的MDA含量從第1天便開始上升，這可能與此時(shí)藻細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重?fù)p傷有關(guān)，而對照組MDA的測定值一直維持在較低水平，說明其脂膜過氧化水平很低。而GSH含量、SOD及CAT活性的變化也有類似的趨勢。說明加入溶藻細(xì)菌后，藻細(xì)胞受到氧化脅迫，其抗氧化系統(tǒng)啟動以保護(hù)自身細(xì)胞不受損害。

圖3 溫度（A）、pH（B）及NaCl濃度（C）對5#菌株生長的影響

圖4（A）及（B）對5#菌株生長的影響

圖5 菌株5#對藻類生長的影響

3 討論

工農(nóng)業(yè)和生活污染排放等因素所導(dǎo)致的水體富營養(yǎng)化和浮游藻類污染目前有日益加劇的趨勢［10］，目前已引起研究人員的廣泛關(guān)注［11］。通過溶藻病毒、溶藻細(xì)菌、溶藻真菌、放線菌等微生物來控制藻體的水華已成為近年來研究的熱點(diǎn)，其中最為常見的是利用溶藻細(xì)菌的作用來抑制藻類生長［12］。惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）［13］、熒光假單胞菌（Pseudomonas. fluorescens）、噬胞菌（Cytophaga）等微生物均對藻類有一定抑制作用［14］，但這些從水體等環(huán)境中直接篩選得到的微生物雖然有較好的溶藻特性，但普遍存在生長速度緩慢、環(huán)境適應(yīng)性差等缺點(diǎn)，且部分菌株為條件致病菌，在水體治理領(lǐng)域容易造成二次污染，不能大規(guī)模使用?？莶菅挎邨U菌在自然界廣泛存在，具有生產(chǎn)成本低、生長速度快、易形成芽孢方便運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，在水質(zhì)凈化、動物飼料添加等方面有廣泛的應(yīng)用。尤為重要的是，枯草芽孢桿菌具有良好的生物安全性，不會造成環(huán)境的二次污染，因此我國《飼料添加劑品種目錄（2013）》及美國食品藥品監(jiān)督管理局《可直接飼用微生物目錄（1989）》中均將其列入其中［15］。本研究以課題組保存的枯草芽孢桿菌為篩選對象，不僅考慮其溶藻特性，同時(shí)兼顧生物安全性和應(yīng)用潛力。

目前利用微生物進(jìn)行藻類控制的研究可以分為兩大類型，一是利用微生物的次級代謝產(chǎn)物抑制藻類生長，目前已有較多報(bào)道［16］。張化俊等［14］發(fā)現(xiàn)溶藻細(xì)菌BS01所產(chǎn)得二異丁氧基苯基胺能夠通過引起藻細(xì)胞內(nèi)部氧化損傷的方式引起藻細(xì)胞的死亡，同時(shí)該化合物僅針對少數(shù)幾種藻類具有殺藻效果，在赤潮的治理方面具有較好的應(yīng)用前景；孔赟等［17］發(fā)現(xiàn)橄欖網(wǎng)狀鏈霉菌SG-001的活性物質(zhì)能夠強(qiáng)烈抑制銅綠微囊藻的生長，但對小球藻的生長具有明顯的促進(jìn)作用；Sakata等［18］從日本海域中分離得到1株P(guān)seudomonas sp. C55a-2，對角毛藻、海洋卡盾藻等藻類均具有較好的抑制作用，經(jīng)過鑒定其主要活性成分為2，3-二氫吲哚二酮（2，3-indolinedione）。另外一類則是研究直接添加菌體對藻類的抑制效果［19，20］。從使用的角度來說，直接施用發(fā)酵菌體顯然成本更低，更具備規(guī)模化使用的潛力。

圖6 菌株5#對銅綠微囊藻MDA（A）、GSH（B）含量及CAT（C）、SOD（D）活性的影響

枯草芽孢桿菌在藻類控制等領(lǐng)域的研究尚處于起步階段［21-24］，本研究所得菌株不僅具有較好的抑制藻類生長特性，同時(shí)在溫度、pH及鹽濃度等方面具有較好的環(huán)境適應(yīng)性，特別是在中溫（30-37℃）、pH接近中性的水體中生長性能最為良好，可以考慮以直投式菌劑的形式應(yīng)用于富營養(yǎng)化的水體，具備一定的開發(fā)的潛力。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)篩選得到一株對銅綠微囊藻和小球藻均具有較好抑制作用的枯草芽孢桿菌，其代謝產(chǎn)物對兩種藻類均有較好的抑制作用，且菌株具有較好的環(huán)境適應(yīng)性。將枯草芽孢桿菌與銅綠微囊藻共培養(yǎng)后，可引起藻體抗氧化系統(tǒng)的應(yīng)激反應(yīng)。

［1］Torres MA, Barros MP, et al. Biochemical biomarkers in algae and marine pollution：a review［J］. Ecotoxicol Environ Saf, 2008, 71（1）：1-15.

［2］ 張翀, 趙亮, 張瑩, 等. 藻類爆發(fā)危害及其控制技術(shù)研究進(jìn)展［J］. 環(huán)境保護(hù)科學(xué), 2015, 3：107-112.

［3］ Zhang H, Lv J, et al. Cell death in a harmful algal bloom causing species Alexandr ium tamarense upon an algicidal bacterium induction［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98（18）：7949-7958.

［4］ 王紅強(qiáng), 李寶宏, 張東令, 等. 藻類的生物控制技術(shù)研究進(jìn)展［J］. 安全與環(huán)境工程, 2013, 20（5）：38-41.

［5］陸洪省, 劉文君, 張瑤, 等. 溶藻菌R1的分離鑒定以及對柵藻共處代謝的影響［J］. 微生物學(xué)通報(bào), 2016, 43（3）：495-503.

［6］張睿, 王廣軍, 李志斐, 等. 枯草芽孢桿菌對銅綠微囊藻抑制效果的 研究［J］. 中國環(huán)境科學(xué), 2015, 35（6）：1814-1821.

［7］周德慶. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程［M］. 第3版. 北京：高等教育出版社, 2013.

［8］ Mu RM, Fan ZQ, Pei HY, et al. Isolation and algae-lysing characteristics of the algicida l bacterium B5［J］. J Environ Sci, 2007, 19（11）：1336-1340.

［9］李文利, 劉征宇, 等. 蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化及其溶藻方式的研究［J］. 環(huán)境污染與防治, 2016, 38（8）： 20-24.

［10］ Cong-Cong YU, Chen WU, et al. Pollutions by algae and microcystins in surface water in Shenqiu County in Huaihe River basin［J］. Journal of Environ ment & Health, 2013, 30（11）：967-971.

［11］ Hettiarachchi IU, et al. Contamin ation status of algae toxins microcystins in some selected water bodies in sri lanka［C］. Proceedings of International Forestry & Environment Symposium, 2014.

［12］倪兆林, 申元英. 溶藻微生物凈化富營養(yǎng)化水體的作用［J］.微生物學(xué) 通報(bào), 2014, 41（1）：156-160.

［13］Shim H, Yang ST. A continuous fibrous-bed bioreactor for BTEX biodegradation by a co-culture of Pseudomonas putida and Pseudomonas fluorescens［J］. Advances in Environmental Research, 2002, 7（1）：203-216.

［14］ 張化俊, 等. 溶藻細(xì)菌BS01產(chǎn)二異丁氧基苯基對塔瑪亞歷山大藻生長的影響［J］. 微生物學(xué)報(bào), 201 5, 55（7）：834-842.

［15］ 張新雄, 彭鋒, 毛光平, 等. 飼用芽孢桿菌研究與應(yīng)用進(jìn)展［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2013, 19（5）：891-897.

［16］Zhang Y, Xi Y, Wu G. Advances on algicidal substances produced by algicidal bacteria［J］. Microbiology, 2004, 31（ 1）：127-131.

［17］孔赟, 繆禮鴻, 等. 溶藻放線菌對銅綠微囊藻和小球藻競爭生長的影響［J］. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 2010, 19（11）：2657-2662.

［18］Sakata T, Yoshikawa T, et al. Algicidal activity and identification of an algicidal substance produced by marine Pseudomonas sp. C55a-2［J］. Fisheries Science, 2011, 77（3）：397-402.

［19］劉征宇, 寧喜斌, 等. 3株太湖溶藻細(xì)菌的分離及溶藻特性的初步研究［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2016, 42（2）：59-64.

［20］馬迪迪, 趙耕毛, 等. 2株溶藻菌培養(yǎng)條件優(yōu)化及溶藻特性研究［J］. 煙臺大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)與工程版, 2015, 1：24-29.

［21］Kim HS, Ahn CY, Joung SH, et al. Growth inhibition of Microcystis aeruginosa by a glycolipid-type compound from Bacillus subtilis C1［J］. J Microbiol Biotechnol, 2010, 20（8）：1240-1242.

［22］Gumbo JR, Cloete TE, Zyl GJJV, et al. The viability assessment of Microcystis aeruginosa cells after co-culturing with Bacillus mycoides B16 usin g flow cytometry［J］. Physics & Chemistry of the Earth Parts A/b/c, 2014, 72-75：24-33.

［23］ Guan C, Guo X, et al. Novel algicidal evidence of a bacterium Bacillus sp. LP-10 killing Phaeocystis globosa , a harmful algal bloom causing species［J］. Biological Control, 2014, 76（3）：79-86.

［24］Zhao L, Chen L, Yin P. Algicidal metabolites produced by Bacillus sp. strain B1 against Phaeocystis globosa［J］. Journal of Industrial Microbiology, 2 014, 41（3）：593-599.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research on Growth Characteristics and Algicidal Effects of Bacillus subtilis

CHE NG Xin LI Kun-tai HUANG Lin
（College of Biological Science and Engineering，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045）

Algicidal microorganisms rapidly kill cyanobacteria，and subseq uently the purpose of controlling algal bloom in water bodies is achieved. To investigate the inhibition of Bacillus subtilis against Microcystis aeruginosa and Chlorell，the Bacillus subtilis cultures were used to study its inhibition and mode of action against these two kinds of algae. The MDA，GSH，SOD and CAT activity in M. aeruginosa when cultured with B. subtilis were measured. The results showed that B. subtilis had a solid adaptability to environment and inhibited the growth of the algae by secreting extracellular substances. The chlorophyll a and protein contents of M. aeruginosa in treated groups were significantly lower than that in the control group，while the MDA and GSH contents as well as the SOD and CAT activity increased obviously when M. aeruginosa was cultured with B. Subtilis.

Bacillus subtilis；algae；inhibition；growth characteristics

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0013

2017-01-16

江西省科技支撐計(jì)劃（20111BBF60031），江西省教育廳科技項(xiàng)目（GJJ11089）

程新，男，博士，副教授，研究方向：資源微生物學(xué)；E-mail：jx_chengxin@hotmail.com

李昆太，男，博士，教授，研究方向：微生物次級代謝；E-mail：atai78@sina.com