海南三亞豇豆枯萎病病原菌鑒定及室內(nèi)藥劑篩選

李秋潔+符啟位+王爽+黃國(guó)宋+劉勇+葉其宏+吳乾興+孔祥義

摘 要 通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、致病性測(cè)定和 ITS 序列分析對(duì)海南三亞地區(qū)采集的豇豆枯萎病病原菌進(jìn)行鑒定，將豇豆枯萎病病原鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。進(jìn)行10種常用藥劑對(duì)病原菌的毒力測(cè)定試驗(yàn)，結(jié)果表明：乙蒜素、甲基硫菌靈、代森錳鋅3種藥劑對(duì)豇豆枯萎病具有較好抑制作用，其EC50值分別為47.42、33.58、74.26 μg/mL；EC90值分別為196.69、325.26和581.06 μg/mL；a值分別為2.074 4、1.299 6和1.434 4，表明豇豆枯萎病病原菌對(duì)該3種藥劑較為敏感。

關(guān)鍵詞 豇豆 ；枯萎病 ；病原鑒定 ；藥劑篩選

中圖分類號(hào) S643.4；S436.43 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.06.009

Pathogenic Identification and Indoor Screening of Cowpea Fusarium

Wilt in Sanya， Hainan Province

LI Qiujie FU Qiwei WANG Shuang HUANG Guosong

LIU Yong YE Qihong WU Qianxing KING Xiangyi

（Sanya Science and Technology Academy for Crop Winter Multiplication， Sanya， Hainan 572000）

Abstract Isolatesstrains of cowpea fusarium wilt collected from cowpea in Sanya were identified by using the morphological description， pathogenicity testing in vivo and ITS sequence analysis. These isolates were identified to be Fusarium oxysporum. The toxicity of 10 fungicides against the isolateswas tested. The results showed that ethylicin， thiophanate methyl and mancozeb had better inhibiting effect on fusarium wilt with their EC50 values being 47.42， 33.58， 74.26 μg/mL， respectively， and their EC90 values being 196.69， 325.26， 581.06 μg/mL， respectively， as well as their a values being 2.074 4， 1.299 6 and 1.434 4， respectively. This indicated that the isolates were sensitive to these three fungicides.

Keywords cowpea ； Fusarium wilt ； pathogenic identification ； screening of fungicides

豇豆?fàn)I養(yǎng)豐富，口感好，是大眾餐桌上常見的蔬菜品種。其種植范圍廣泛，在中國(guó)湖北、福建、廣西、海南等地均有大面積種植，尤其在海南三亞地區(qū)，豇豆種植面積已達(dá)5 340 hm2，出島產(chǎn)量達(dá) 15 萬(wàn)t[1]，成為該地冬種北運(yùn)的主角，對(duì)該地的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展起到積極的促進(jìn)作用。但隨著三亞豇豆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，病蟲害成為阻礙豇豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素，尤其是豇豆枯萎病，嚴(yán)重影響了豇豆的產(chǎn)量與品質(zhì)。近年來(lái)，由于多年連作，土壤條件惡化，三亞市豇豆枯萎病大面積流行，造成豇豆大量減產(chǎn)。

枯萎病是一種毀滅性土傳病害，植株一旦發(fā)病，往往造成整株枯萎死亡。目前，已有多個(gè)研究報(bào)道香蕉、大豆、黃瓜、甜瓜、西瓜、甘藍(lán)等多種經(jīng)濟(jì)作物均可發(fā)生枯萎病，枯萎病的病原主要為尖孢鐮刀菌，不同作物的枯萎病病原?；筒煌彝N作物下病原菌存在小種分化現(xiàn)象[2]。2012年，吳仁鋒對(duì)武漢市豇豆枯萎病分離后鑒定為尖孢鐮刀菌[3]。2015年肖敏將海南樂(lè)東地區(qū)的豇豆枯萎病病原鑒定為尖孢鐮刀菌菜豆?；停‵usarium oxysporum f. sp. phaseolus）[4]。本研究對(duì)海南三亞豇豆主產(chǎn)區(qū)采集到的病原菌分離物進(jìn)行鑒定，并開展室內(nèi)藥劑篩選試驗(yàn)，以確定病原菌種類，并比較分析這些殺菌劑對(duì)該病菌生長(zhǎng)的影響，以期為生產(chǎn)中防治豇豆枯萎病提供指導(dǎo)與參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

供試菌株于2016 年12月從海南省三亞市崖州區(qū)豇豆地枯萎病發(fā)病樣本上采集分離到，經(jīng)病健交界處組織分離和純化培養(yǎng)后，純化菌株于無(wú)菌水中常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試藥劑

供試藥劑詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離及其形態(tài)觀察

選取新發(fā)病植株的根莖部位，在病健交界處，剪取5 mm大小的組織，參照文獻(xiàn)[5]中有關(guān)病原真菌的分離方法，進(jìn)行常規(guī)組織分離，經(jīng)劃線分離純化獲得單孢菌株。在PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后，觀察菌落形態(tài)及分生孢子形態(tài)。

1.2.2 病原菌致病性測(cè)定

病原菌在PDB培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)7 d后，過(guò)濾獲得孢子懸浮液，將濃度調(diào)至108個(gè)/mL。采用傷根接種法接種植株。取長(zhǎng)勢(shì)一致，長(zhǎng)出3～4片真葉的豇豆幼苗，用無(wú)菌水將根部表面沖洗干凈，用消毒的剪刀剪掉少許根尖，然后使根完全浸在孢子懸浮液中30 min，最后將植株定植于椰糠基質(zhì)的花盆中，剩余懸浮液澆灌幼苗根部。每個(gè)菌株接種6株苗，設(shè)置2次重復(fù)，以無(wú)菌水為對(duì)照。正常栽培管理，10 d后觀察發(fā)病情況。發(fā)病后，從病株再次分離病原菌，確認(rèn)致病菌。

1.2.3 病原菌ITS序列分析鑒定

（1）菌絲收集 病原菌在PDA平板培養(yǎng)4 d后，用滅菌藥匙刮取菌絲，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）DNA提取 CTAB法提取病原菌DNA，將50 mg菌絲體放入已滅菌的2 mL離心管內(nèi)，每一離心管中加入600 μL 2×CTAB提取緩沖液（0.7 mol/L NaCl，100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；20 mmol/L EDTA；20 g/L CTAB），用電鉆將菌絲磨碎后，渦旋混勻，65℃水浴鍋中溫浴30 min，期間顛倒混勻3次。每管加入600 μL氯仿/異戊醇（體積比24∶1）抽提液，充分混勻后，于12 000 r/min離心15 min。吸取上清液至干凈離心管中，加等體積氯仿/異戊醇再抽提1次。將上清轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，加2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀20 min，12 000 r/min離心10 min，去上清，沉淀用70%冰乙醇沖洗2遍。將離心管置于37℃溫箱中干燥后用TE溶解沉淀，經(jīng)1%脂糖凝膠電泳檢測(cè)后-20℃冰箱保存，備用。

（3）ITS特異序列擴(kuò)增 用真核生物核糖體DNA通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其序列為，ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

PCR反應(yīng)條件 PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL，反應(yīng)液組分：10×PCR Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl2 24 μL，10 mmol/L d NTP 2 μL，5 U/μL Taq酶0.3 μL，模板DNA 10 ng，引物ITS1和 ITS4 （25 μmol/L）各1 μL，用dd H2O使總體積達(dá)到50 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min；56℃退火1 min；72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物委托深圳華大基因公司純化和測(cè)序。

（4）ITS序列分析 將測(cè)序所得ITS序列與GenBank 中核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的ITS區(qū)相關(guān)序列進(jìn)行同源性比較。

1.2.4 供試藥劑對(duì)病原菌的毒力測(cè)定

在預(yù)備試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇各藥劑對(duì)豇豆枯萎病病菌菌絲體生長(zhǎng)具有一定抑制作用的4～5個(gè)濃度，作為各藥劑的供試濃度。供試藥劑用無(wú)菌水稀釋成不同濃度的藥液，將PDA培養(yǎng)基熔化，冷卻至50℃左右，按照各藥劑所需濃度加入適量的藥液，倒入滅菌培養(yǎng)皿制成含藥平板。每種藥劑每個(gè)濃度設(shè)置3次重復(fù)，以加無(wú)菌水PDA培養(yǎng)基作空白對(duì)照。用直徑為5 mm的打孔器打取生長(zhǎng)一致的菌餅，置于含藥平板中央，28℃恒溫培養(yǎng)，待對(duì)照菌絲體直徑至少 4 cm 以上但不長(zhǎng)滿皿時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量每個(gè)處理的菌落直徑，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率，分析不同殺菌劑對(duì)供試病菌菌絲生長(zhǎng)的影響。其中，生長(zhǎng)抑制率=[（對(duì)照菌落直徑-0.5）-（處理菌落直徑-0.5）]/（對(duì)照菌落直徑-0.5）×100%。再根據(jù)生物統(tǒng)計(jì)幾率值換算表，將抑制百分率換算成抑制幾率值。以試驗(yàn)中設(shè)定的濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制幾率值為縱坐標(biāo)，計(jì)算不同殺菌劑對(duì)相應(yīng)菌株的劑量反應(yīng)回歸方程y=ax+b，并由回歸方程計(jì)算各藥劑對(duì)相應(yīng)菌株的抑制中濃度EC50、EC90及相關(guān)系數(shù)r值與斜率a值。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離與菌落形態(tài)

病原菌在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)6～7 d后，菌落呈規(guī)則圓形，邊緣白色，中間淡紫色，氣生菌絲茂盛，絨毛狀，背面淺紫色，可見同心圓環(huán)。挑取菌絲在顯微鏡下觀察可見大量分生孢子，存在2種分生孢子：大型分生孢子、小型分生孢子。大型孢子頂細(xì)胞漸尖并彎曲成喙?fàn)?，基?xì)胞足狀，多數(shù)為3隔，大小為20.25 μm×4.2 μm；小型孢子數(shù)量多，單胞，橢圓形或腎型，大小為8.25 μm×3.01 μm，分生孢子梗在菌絲上直接長(zhǎng)出，單瓶梗。厚垣孢子在生長(zhǎng)后期出現(xiàn)，球形，間生或頂生。通過(guò)對(duì)菌落形態(tài)、孢子形態(tài)等觀察，初步鑒定病原菌為尖孢鐮刀菌，見圖1。

2.2 病原菌致病性測(cè)定

接種病原菌孢子懸浮液的豇豆幼苗，植株長(zhǎng)勢(shì)瘦弱，接種10 d，葉片開始變黃萎蔫，13 d 后，葉片皺縮陸續(xù)掉落，植株萎蔫枯死，莖基部及根部切面變褐。15 d后，殘留的發(fā)病殘株莖基部可見粉色孢子堆。對(duì)照無(wú)此癥狀。對(duì)發(fā)病植株進(jìn)行鏡檢和再次組織分離，獲得的菌株與接種的菌株形態(tài)一致，證明分離物即為豇豆枯萎病病原，見圖2。

2.3 病原菌ITS序列分析鑒定

利用真核通用引物ITS1和ITS4引物進(jìn)行ITS特異序列擴(kuò)增，擴(kuò)增條帶位于500～750 bp，約600 bp。測(cè)得的序列大小為518 bp在 NCBI 網(wǎng)站比對(duì)發(fā)現(xiàn)：該 序 列 與Genbank中 的Fusarium oxysporum（登錄號(hào)為：KX009490.1，GQ121287.1）的相應(yīng)片段同源性最高，同源性為99%。根據(jù)比對(duì)結(jié)果及形態(tài)觀察，將該菌鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum. Schl）

2.4 不同供試藥劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

采用10種常用藥劑對(duì)海南三亞地區(qū)的豇豆枯萎病病原菌進(jìn)行毒力測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果表明，10種藥劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)均有一定的抑制作用，其中，甲基硫菌靈、乙蒜素、苗迎春3種藥劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制作用明顯，其EC50分別為33.58、47.42、51.90 μg/mL。 根美、代森錳鋅、百菌清對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用也較明顯，EC50值分別為53.53、74.26、83.86 μg/mL。為進(jìn)一步確定供試藥劑對(duì)豇豆枯萎病病菌的抑制作用，對(duì)10種藥劑的EC90進(jìn)行分析比較。其中，EC90值小于500 μg/mL的有2種藥劑，分別為乙蒜素、甲基硫菌靈，其EC90值為196.69、325.26 μg/mL。EC90值大于500 μg/mL小于1 000 μg/mL的有代森錳鋅、苗迎春，其EC90值為581.06、669.59 μg/mL。

毒力回歸曲線的斜率（a值）越大，病原菌對(duì)殺菌劑越敏感[6]。10種藥劑的毒力回歸方程a值范圍在0.461 7～2.074 4，a值最大的供試藥劑為乙蒜素，a值為2.074 4；其次是代森錳鋅，a值為1.434 4；然后是甲基硫菌靈，a值為1.299 6。

綜合比較EC50、EC90、a值發(fā)現(xiàn)，乙蒜素、甲基硫菌靈、代森錳鋅EC50值、EC90值均較小，對(duì)豇豆枯萎病病原菌抑制作用較強(qiáng)。而且，a值相對(duì)較大，豇豆枯萎病病原菌對(duì)該3種藥劑較為敏感，見表2。

3 討論

豇豆枯萎病是豇豆生產(chǎn)常見的土傳病害，在海南三亞市豇豆主產(chǎn)區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，田間發(fā)病率一般在 5%～20%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)30%以上，甚至絕收。本研究從病原菌形態(tài)、致病力測(cè)定、ITS序列分析將海南三亞地區(qū)的豇豆枯萎病病原菌鑒定為尖孢鐮刀菌菌，與吳仁鋒等[3]、肖敏等[4]的研究結(jié)果一致。但尚未能確定病原菌的?；头N類，有待下一步研究。

枯萎病作為一種嚴(yán)重的土傳病害，曾造成多種經(jīng)濟(jì)作物的大量減產(chǎn)，目前多數(shù)研究對(duì)于枯萎病的防治傾向于抗病育種研究，但由于抗病育種需要時(shí)間長(zhǎng)，且抗病品種容易喪失抗性，因此，在生產(chǎn)實(shí)踐上，化學(xué)防治仍然處于不可代替的地位，生物藥劑協(xié)同化學(xué)藥劑防治病蟲害也是另一個(gè)新的思路。本研究開展了10種常見藥劑對(duì)豇豆枯萎病的毒力測(cè)定試驗(yàn)，結(jié)果表明：乙蒜素、甲基硫菌靈、代森錳鋅3種藥劑對(duì)豇豆枯萎病具有較好抑制作用，其EC50值分別為47.42、33.58、74.26 μg/mL；EC90值分別為196.69、325.26、581.06 μg/mL；a值分別為2.074 4、1.299 6、1.434 4，表明豇豆枯萎病病原菌對(duì)該3種藥劑較為敏感。乙蒜素是大蒜提取物，作為一種仿生植物農(nóng)藥，既對(duì)環(huán)境友好，又能壯根壯苗，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，光譜高效，對(duì)多種植物病原菌具有較強(qiáng)抑制作用。張博等[7]發(fā)現(xiàn)，乙蒜素在室內(nèi)或田間條件下對(duì)馬鈴薯致病疫霉菌均具用抑制效果。本研究中，甲基硫菌靈對(duì)豇豆枯萎病表現(xiàn)出較強(qiáng)抑制作用，甲基硫菌靈是一種苯并咪唑類殺菌劑，有研究表明，長(zhǎng)期單一使用同一種苯并咪唑類殺菌劑，容易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗性[8]。因此，在生產(chǎn)中不宜長(zhǎng)期單一使用甲基硫菌靈防治豇豆枯萎病。

根據(jù)本研究結(jié)果，在生產(chǎn)實(shí)踐中防治豇豆枯萎病建議使用乙蒜素、甲基硫菌靈、代森錳鋅輪換使用，可達(dá)到良好的防治效果，同時(shí)避免產(chǎn)生抗藥性。

參考文獻(xiàn)

[1] 黃國(guó)宋，李秋潔，劉 勇，等. 三亞市冬種豇豆品種比較試驗(yàn)[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，37（1）：53-59.

[2] 徐偉慧，周 巖，吳鳳芝. 西瓜枯萎病的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)蔬菜，2013（8）：4-11.

[3]吳仁鋒，楊紹麗，萬(wàn) 鵬，等. 豇豆枯萎病病原分離鑒定[J]. 湖北大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，34（1）：100-104.

[4] 肖 敏，曾向萍，嚴(yán)婉榮，等. 海南豇豆枯萎病病原鑒定及生物學(xué)特性初步研究[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2015，34（2）：345-349.

[5] 方中達(dá). 植病研究方法第3版[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998：122-125

[6] 吳偉懷，王彩霞，梁艷瓊，等. 11種殺菌劑對(duì)甘蔗赤腐病菌的毒力測(cè)定[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，35（6）：37-42.

[7] 張 博，馬立國(guó)，張悅麗，等. 幾種生物制劑對(duì)致病疫霉的毒力測(cè)定[J]. 農(nóng)藥，2017，56（2）：138-140.

[8] 葉 佳，張傳清. 葡萄炭疽病菌對(duì)甲基硫菌靈、戊唑醇和醚菌酯的敏感性檢測(cè)[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012，14（1）：111-114.