海南幾種大型綠藻18S rRNA基因的克隆與序列分析

姜芳燕+黃海+楊寧+馬軍

摘 要 對(duì)海南沿岸采集到的團(tuán)集剛毛藻（Cladophora glomerata）、細(xì)毛橫絲藻（Acrochaete leptochaete）、石莼（Ulva reticulata）和長(zhǎng)莖葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察，采用18S rRNA通用引物，通過PCR技術(shù)，從這4種綠藻的基因組中擴(kuò)增到各自的18S rRNA基因序列，并測(cè)序。與Genebank中已收錄的6種綠藻18 S rRNA基因序列進(jìn)行比較分析，所得10種綠藻的18S rRNA基因長(zhǎng)度為727 bp，變異位點(diǎn)為266個(gè)，保守位點(diǎn)為453個(gè)。剛毛藻目與蕨藻目的遺傳距離最大，為0.376；剛毛藻屬內(nèi)的種間遺傳距離最小，為0.010。采用NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)顯示：細(xì)毛橫絲藻、葡枝橫絲藻、石莼、礁膜、羽狀尾孢藻和皺溪菜聚為一支；團(tuán)集剛毛藻與扭曲剛毛藻單獨(dú)聚為一支；長(zhǎng)莖葡萄蕨藻與總狀蕨藻聚為一支。說(shuō)明18S rRNA序列可以作為大型綠藻系統(tǒng)發(fā)育研究的分子標(biāo)記。

關(guān)鍵詞 團(tuán)集剛毛藻 ；細(xì)毛橫絲藻 ；石莼 ；長(zhǎng)莖葡萄蕨藻 ；18S rRNA

中圖分類號(hào) Q75 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.06.011

Cloning and Sequence Analysis of 18S rRNA Genes of

Several Large Green Algae in Hainan Province

JIANG Fangyan1） HUANG Hai1） YANG ning2） MA Jun1）

（1 Hainan Key Laboratory of Tropical Marine Fishery Resources Protection and Utilization，

Hainan Tropical Ocean University， Sanya， Hainan 572022；

2 Sanya Science & Technology Academy of Winter Breeding and Multiplication，

Sanya， Hainan 572000）

Abstract Large green algae Cladophora glomerata， Acrochaete leptochaete， Ulva reticulata， and Caulerpa lentillifera collected from the coast of Hainan province were observed morphologically. With 18S rRNA as universal primer， the genes from these 4 large green algae were amplified to 18 S rRNA gene sequence by PCR. A comparative analysis was made of 18S rRNA gene sequences among the 4 green algae selected and the 6 green algae from the Genebank. The results showed that the 18S rRNA gene sequences of these 10 green algae were 727 bp in length with 266 variable sites and 453 conserved sites. The maximum genetic distance between Cladophrales and Codiales was 0.376. The genetic distance among the species of genus Cladophora was 0.010， the shortest. The topology of phylogenetic tree constructed by NJ method suggested that A. leptochaete， A. repens， U. reticulata， M. nitidum， U. penicilliformis， and P. crispa were clustered into one group； C. glomerata and C. coelothrixwere into another group； C. lentillifera and C. racemosa into another group. This indicated that 18S rRNA sequence could be used as a molecular marker for phylogenetic research of large green algae.

Keywords Cladophora glomerata ； Acrochaete leptochaete ； Ulva reticulata ； Caulerpa lentillifera ； 18S rRNA.

大型海藻是一類重要的海洋生物資源，是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在海洋生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和維持海洋生態(tài)平衡中發(fā)揮著重要作用[1]。丁蘭平等[2]在對(duì)中國(guó)南海多個(gè)地區(qū)開展野外調(diào)查的基礎(chǔ)上，通過研究與歷史資料整理發(fā)現(xiàn)，中國(guó)目前綠藻門海藻共計(jì)有11目21科48屬211個(gè)種及變種，其中南海綠藻門有9目16科41屬180種及變種、變型，其綠藻多樣性占全國(guó)的85.31%，表明南海是中國(guó)綠藻多樣性最豐富的地區(qū)。由于生長(zhǎng)環(huán)境的不同，大型綠藻的藻體形態(tài)及結(jié)構(gòu)存在著廣泛的變異，因此，單從傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)分類有一定的局限性。尤其是石莼目（Ulvales）礁膜科（Monostromaceae）的礁膜屬（Monostroma）、石莼科（Ulvaceae）的石莼屬（Ulva）和滸苔屬（Enteromorpha）3個(gè)屬[3]，相關(guān)的物種分類一直存在諸多觀點(diǎn)[4]。

20世紀(jì)90年代以來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于海洋藻類的分子鑒定和分子進(jìn)化研究[5]。楊君等[6]采用RAPD技術(shù)對(duì)滸苔屬藻類進(jìn)行了初步的分子系統(tǒng)學(xué)研究，結(jié)果表明，緣管滸苔（Enteromorpha linza）與石莼屬有較近的親緣關(guān)系，應(yīng)深入探究其分類地位。沈頌東和張勁[4]通過對(duì)綠藻5.8 S rRNA基因序列擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析，表明相對(duì)于滸苔屬的其他物種，滸苔與孔石莼的親緣關(guān)系更近。張耀東等[7]利用18S rRNA序列探討8種綠藻分子系統(tǒng)發(fā)育，研究發(fā)現(xiàn)在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，滸苔與石莼屬物種聚為一類，表現(xiàn)出與石莼屬物種更近的親緣關(guān)系。劉巖等[8]利用ITS、rbcL等基因序列以及質(zhì)體藍(lán)素氨基酸序列，進(jìn)一步分析了石莼科10種綠藻的序列結(jié)構(gòu)特征和分子系統(tǒng)學(xué)關(guān)系。研究顯示，石莼科滸苔屬和石莼屬綠藻rbcL和ITS序列差異，未體現(xiàn)出屬間分化的差異，顯示出在分子進(jìn)化水平上較為一致的結(jié)果。本研究對(duì)海南沿岸采集到團(tuán)集剛毛藻（Cladophora glomerata）、細(xì)毛橫絲藻（Acrochaete leptochaete）、石莼（Ulva reticulata）和長(zhǎng)莖葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并對(duì)這4種綠藻的18S rRNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序。然后，選取Genebank收錄的6種綠藻的18S rRNA基因序列，以研究這一序列的基本特征，評(píng)估其種間變異程度，并探討這一序列在種類鑒定和分子系統(tǒng)發(fā)育等研究中的應(yīng)用價(jià)值，以期為它們的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣本從海南省三亞市沿海潮間帶采集，選擇形態(tài)有一定差異且形態(tài)完整的藻體進(jìn)行采集，然后帶回實(shí)驗(yàn)室洗凈泥沙，編號(hào)封存。經(jīng)形態(tài)學(xué)特征初步鑒定，所采集的藻樣有團(tuán)集剛毛藻、細(xì)毛橫絲藻、石莼、長(zhǎng)莖葡萄蕨藻。選取GenBank收錄的6種常見大型綠藻的18S rRNA基因序列（見表1）。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集后處理

將采集回來(lái)的藻樣分別裝進(jìn)1 000 mL大燒杯里，并進(jìn)行編號(hào)。先用高壓滅菌過的海水進(jìn)行清洗，然后用小刷子把藻上多余的雜質(zhì)進(jìn)行刷洗，再用高壓滅菌的雙蒸水漂洗除去鹽離子。其中，用于形態(tài)特征觀察的藻樣放在消毒滅菌的平板上，用SONY照相機(jī)對(duì)藻體的整體外觀形態(tài)進(jìn)行拍照。用于DNA提取的藻樣，自然晾干后，用干凈的封口袋封存，置于-20℃冰箱里備用。

1.2.2 主要分子操作

藻類總DNA提取和PCR產(chǎn)物回收等分子操作參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。18S rRNA通用引物為18S-F（CCAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA）和18S-R（CCTTGTTAACGACTTCACCTTCCTCT）。以4種綠藻基因組為模板，采用通用引物18S-F和18S-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增獲得的DNA保守片段，送往深圳華大基因有限公司測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

用Clustal X1.83軟件對(duì)團(tuán)集剛毛藻（C. glomerata）、細(xì)毛橫絲藻（A. leptochaete）、石莼（U. reticulata）、長(zhǎng)莖葡萄蕨藻（C. lentillifera）以及從Genebank下載的羽狀尾孢藻（U. penicilliformis）、礁膜（M. nitidum）、皺溪菜（P. crispa）、香蕉菜（B. forbesii）、總狀蕨藻（C. racemosa）、盾葉蕨藻（C. peltata）的18S rRNA基因序列進(jìn)行排序，然后用MEGA 7.0軟件中的Pairwisedistance工具計(jì)算其相對(duì)遺傳距離，并采用鄰接法（Neighbour-Joining，NJ）構(gòu)建分子進(jìn)化樹，置信度用Bootstrap工具循環(huán)1 000次表示檢驗(yàn)分子系統(tǒng)樹[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種綠藻的形態(tài)學(xué)特征

根據(jù)觀察所采集藻樣的形態(tài)特征，并查閱相關(guān)藻類文獻(xiàn)和圖片資料，結(jié)果表明，所采集的4種藻樣分別鑒定為團(tuán)集剛毛藻、細(xì)毛橫絲藻、石莼和長(zhǎng)莖葡萄蕨藻（圖1）。

團(tuán)集剛毛藻（Cladophora glomerata）屬綠藻門（Chlorophyta），剛毛藻目（Cladophrales），剛毛藻科（Cladophoraceae），剛毛藻屬（Cladophora）。觀察其外觀是比較粗糙，分枝規(guī)則的絲狀體被橫隔壁分成多核的節(jié)段，常生成簇狀或球狀，長(zhǎng)可達(dá)10 cm以上（圖1-A）。其基部細(xì)胞有假根、或呈假根狀，其他細(xì)胞呈柱狀；植物體呈多細(xì)胞分枝的絲狀體，在基質(zhì)上附著生長(zhǎng)。

細(xì)毛橫絲藻（Acrochaete leptochaete）屬綠藻門（Chlorophyta），膠毛藻目（Chaetophorales），膠毛藻科（Chaetophoraceae），橫絲藻屬（Acrochaete）。細(xì)毛橫絲藻外觀深綠色，絲狀，藻體呈鮮綠或暗綠色（圖1-B），質(zhì)軟，為不分枝的絲狀體，外形很像一叢綠絨毛，絲徑10～25 μm。藻體是由圓筒狀細(xì)胞之間相連而成的單列、不分枝的絲狀體。大多數(shù)都生長(zhǎng)在流動(dòng)的淡水域中，有少數(shù)生長(zhǎng)在較急的水流中，有小部分種類分布于海水中。

石莼（Ulva reticulata）屬綠藻門（Chlorophyta），石莼目（Ulvales），石莼科（Ulvaceae），石莼屬（Ulva）。藻體寬而薄，呈片狀，顏色呈鮮綠色或黃綠色（圖1-C），是由兩層細(xì)胞構(gòu)成的綠色膜狀體，其長(zhǎng)度可達(dá)40 cm以上。借基部多細(xì)胞的固著器固著在巖石上。

長(zhǎng)莖葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）屬綠藻門（Chlorophyta），蕨藻目（Codiales），蕨藻科（Caulerpaceae），蕨藻屬（Caulerpa）。藻體呈鮮綠色，匍匐蔓生，有直立莖及匍匐莖之分化，直立莖高約3～8 cm，長(zhǎng)出許多密生的小枝，小枝頂端膨大成圓球形，直徑約0.1～0.15 cm。匍匐莖圓柱狀，平滑，向下長(zhǎng)出須狀假根。匍匐莖圓柱狀，平滑，約0.6～1.0 mm寬，向下長(zhǎng)出須狀假根（圖1-D）。藻體假根必須附著于一定的基質(zhì)[11]。

2.2 18S rRNA基因序列分析

團(tuán)集剛毛藻、細(xì)毛橫絲藻、石莼和長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的18S rRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。測(cè)序結(jié)果顯示，其基因序列長(zhǎng)度約為750 bp。選取Genebank收錄的6種綠藻18S rRNA基因序列，對(duì)比分析它們之間的親緣關(guān)系。利用MEGA 7.0軟件對(duì)基因序列間保守位點(diǎn)，變異位點(diǎn)，堿基A、T、C、G的平均含量，遺傳距離進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明：比對(duì)后的10種基因長(zhǎng)度為727 bp，共檢測(cè)到266個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)，保守位點(diǎn)為453個(gè)，其中簡(jiǎn)約性信息位點(diǎn)為250個(gè)。堿基組成T為25.3%，C為20.9%，A為25.9%，G為27.9%，A+T的含量為51.2%，C+G的含量為48.8%，說(shuō)明堿基組成沒有明顯的偏向性。

基于Kimura 2-Parameter模型利用MEGA 7.0軟件計(jì)算出各種之間的遺傳距離見（表2）。在這10種藻類中，其中遺傳距離最小的是團(tuán)集剛毛藻與扭曲剛毛藻，為0.010；其次是羽狀尾孢藻與礁膜，為0.016，在序列中只有幾個(gè)堿基的差異。而團(tuán)集剛毛藻與總狀蕨藻的遺傳距離最大，其遺傳距離為0.376，其次是扭曲剛毛藻與總狀蕨藻，其遺傳距離為0.374。剛毛藻屬內(nèi)的種間遺傳距離最小，為0.010。橫絲藻屬內(nèi)的種間遺傳距離為0.019，蕨藻屬內(nèi)的種間遺傳距離為0.025。石莼目中的石莼和礁膜之間的遺傳距離為0.071，而礁膜與頂管藻目中羽狀尾孢藻的遺傳距離為0.016，礁膜與溪菜目中皺溪菜的遺傳距離為0.068，均低于石莼和礁膜之間的遺傳距離，說(shuō)明18 S rRNA分析結(jié)果與傳統(tǒng)分類結(jié)果（表1）仍有一定的分歧。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

基于所得的18S rRNA基因部分序列，采用NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖3所示。其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)顯示，10種藻類利用NJ法所構(gòu)建的進(jìn)化樹大致形成三分支。細(xì)毛橫絲藻、葡枝橫絲藻、石莼、礁膜、羽狀尾孢藻和皺溪菜聚為一支；團(tuán)集剛毛藻與扭曲剛毛藻單獨(dú)聚為一支；長(zhǎng)莖葡萄蕨藻與總狀蕨藻聚為一支。其中，第一分支結(jié)果顯示，石莼目中的礁膜與頂管藻目的羽狀尾孢藻的親緣關(guān)系較近，單獨(dú)聚為一小分支，而同為石莼目的石莼和礁膜并沒有聚為一小分支，相對(duì)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；與核苷酸序列間Kimura雙參數(shù)距離（表2）結(jié)果較一致。大部分的節(jié)點(diǎn)自檢支持率較高，較清楚地揭示出他們的分化順序及遺傳距離關(guān)系。

3 討論

本研究所涉及的剛毛藻目海藻藻體結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，易受環(huán)境影響，難以通過形態(tài)特征加以鑒定。滕林宏[12]通過對(duì)31個(gè)不同樣品的形態(tài)觀察比較，鑒定了中國(guó)海產(chǎn)剛毛藻目3屬16個(gè)物種。然而，其利用具有高度變異性的ITS序列及相對(duì)保守的18 S rDNA序列對(duì)上述31個(gè)藻樣進(jìn)行分子鑒定，確認(rèn)了它們應(yīng)劃分為14種及1變種，說(shuō)明傳統(tǒng)的形態(tài)特征分類與分子鑒定有一定的分歧。目前對(duì)淡水剛毛藻的生態(tài)方面有比較全面的研究，而對(duì)海產(chǎn)剛毛藻的研究報(bào)道較少[12]。本研究的團(tuán)集剛毛藻，從海南省三亞市沿海潮間帶采集獲得，其外觀較粗糙，分枝規(guī)則，基部細(xì)胞有假根或呈假根狀，單從形態(tài)特征鑒定易與其它種混淆。Gubelit[13]調(diào)查通過俄羅斯涅瓦海灣的底棲和漂浮的團(tuán)集剛毛藻的生物量和初級(jí)生產(chǎn)力，發(fā)現(xiàn)其漂浮種占70%。而傳統(tǒng)分類學(xué)認(rèn)為團(tuán)集剛毛藻（C. glomerata）應(yīng)為底棲，而脆弱剛毛藻（C. fracta）則為漂浮。但是，Marks和Cummings研究發(fā)現(xiàn)，團(tuán)集剛毛藻和脆弱剛毛藻有非常相似的ITS序列。因此，僅通過觀察形態(tài)特征和生活方式，區(qū)分難度大，有必要結(jié)合其他方法輔助形態(tài)鑒定。

細(xì)毛橫絲藻（Acrochaete leptochaete），1892年最早由Huber發(fā)現(xiàn)命名。長(zhǎng)期以來(lái)，有關(guān)該藻的分類一直沒有定論。先后將細(xì)毛橫絲藻劃分至內(nèi)皮藻屬（Endoderma）、褐友藻屬（Phaeophila）、橫絲藻屬（Acrochaete）和內(nèi)枝藻屬（Entocladia）[15]。直至2007年，Brodie等[16]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)枝藻屬與橫絲藻屬系同物異名，因此仍沿用Acrochaete leptochaete為其命名。細(xì)毛橫絲藻常見寄生于剛毛藻屬和硬毛藻屬物種的細(xì)胞外壁，主要生長(zhǎng)在海濱地區(qū)或是近海地區(qū)。目前已報(bào)道在歐洲、非洲和印度發(fā)現(xiàn)。鄧蘊(yùn)彥[15]在研究硬毛藻及其附生藻的實(shí)驗(yàn)分類學(xué)時(shí)發(fā)現(xiàn)，硬毛藻的附生藻為細(xì)毛橫絲藻，是中國(guó)的新記錄種，該藻樣由山東榮成采集獲得。本文研究的細(xì)毛橫絲藻從海南省三亞市沿海潮間帶采集獲得，并首次報(bào)道了中國(guó)南海海域存在細(xì)毛橫絲藻，但是否為新種還有待進(jìn)一步研究。

本文通過對(duì)幾種常見的18 S rRNA基因序列進(jìn)行分析，從而確定綠藻藻種分類的可信度。根據(jù)所建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹，說(shuō)明18 S rRNA序列適合作為大型綠藻系統(tǒng)發(fā)育研究的分子標(biāo)記。

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