烘烤期煙葉霉?fàn)€病的侵染源與防治

王永棟 顧鋼 肖順 王鵬 徐茜 林勇 張紹升

摘要[目的]明確烘烤期煙葉霉?fàn)€病的癥狀、病因、侵染源和防治措施。[方法]通過病原形態(tài)學(xué)觀察、生物學(xué)特性觀察和ITS-PCR檢測分析，對烘烤期煙葉霉?fàn)€病的病原進行鑒定，并用二氧化氯和三氯異氰脲酸對煙柄噴霧或熏蒸裝煙后的烤房，研究其對烘烤期煙葉霉?fàn)€病的防治效果。[結(jié)果]烘烤期煙葉霉?fàn)€病的病原鑒定為米根霉（Rhizopus oryzae）。利用PSA平板采集烤房內(nèi)外及煙葉表面的微生物，米根霉廣泛存在于烤房內(nèi)外的環(huán)境中，能在烤房內(nèi)存活和積累成為重要侵染源。用二氧化氯和三氯異氰脲酸對煙柄噴霧或熏蒸裝煙后的烤房，結(jié)果顯示熏蒸法對烘烤期煙葉霉?fàn)€病的防治效果在62.62%～69.57%。[結(jié)論]為煙葉霉?fàn)€病的有效防治提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞煙葉霉?fàn)€??；二氧化氯；三氯異氰脲酸；防治

中圖分類號S432文獻標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）19-0138-05

Control and Infection Source of Tobacco Leaf Mildew Rot during Fluecuring Period

WANG Yongdong1， GU Gang2， XIAO Shun1， ZHANG Shaosheng1* et al

（1.College of Plant Protection， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002；2.Fujian Institute of Tobacco Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003）

Abstract[Objective] The aim was to explore the symptoms， causes， infection source and control ways of tobacco leaf mildew rot disease. [Method] The pathogen of tobacco leaf mildew rot disease was identified by the ITSPCR sequence analysis combined the morphological characters and biologic characters. The disinfectants chlorine dioxide and trichloroisocyanuric acid were used to control the disease by spraying to tobacco stalks and fumigation in curing barns. [Result] The pathogen was identified as Rhizopus oryzae. The microbial flora in the curing surroundings and tobacco leaf were isolated and analyzed by PSA plate culture， the results showed Rhizopus oryzae was widespread in the curing barns and their surroundings， the fungi could accumulate in the curing barns and were the important infection sources. The disinfectants chlorine dioxide and trichloroisocyanuric acid were used to control the disease by spraying to tobacco stalks and fumigation in curing barns， the disinfectants fumigation could effectively control the disease， and the control effect were up to 62.62%-69.57%. [Conclusion] The results provide theoretical basis for the control of tobacco leaf mildew rot disease.

Key wordsTobacco leaf mildew rot disease；Chlorine dioxide；Trichloroisocyanuric acid；Control

煙葉烘烤過程中常常發(fā)生烤壞煙。烤壞煙的種類多樣，常見類型有烤青煙、蒸片煙、黑糟煙、掛灰煙、洇筋洇片煙、烤紅煙；烤壞煙的主要原因與煙葉的成熟度、含水量以及烤房烘烤期間溫度和濕度失調(diào)等物理因素有關(guān)[1-2]。由微生物引起的煙葉霉?fàn)€主要發(fā)生于倉儲期，病原菌主要是曲霉（Aspergillus spp.）、青霉（Penicillium spp.）、根霉（Rhizopus spp.）、毛霉（Mucor spp.），發(fā)病條件是環(huán)境濕度和煙葉含水量過高[3-5]。2010年云南省報道在大多數(shù)紅花大金元種植煙區(qū)，煙葉烘烤過程中葉柄發(fā)霉造成很大損失[6]。近幾年在福建省紅花大金元烤煙生產(chǎn)區(qū)的煙葉在烘烤變黃階段發(fā)生霉變爛葉現(xiàn)象，不少烤房損失嚴(yán)重。曾婷英等[7]對福建省烘烤期煙葉霉?fàn)€的病原菌進行鑒定，首次確認(rèn)烘烤期煙葉霉?fàn)€是由米根霉（Rhizopus oryzae Went et Geerligs）引起的侵染性病害，將該病害命名為煙葉霉?fàn)€病。據(jù)調(diào)查烘烤期煙葉霉?fàn)€病在其他煙區(qū)也常發(fā)生，為了有效防治病害，筆者對煙葉霉?fàn)€病的侵染來源和發(fā)病條件進行了調(diào)查，并結(jié)合實際生產(chǎn)開展了病害防治技術(shù)研究。

1材料與方法

1.1材料

供試消毒劑：二氧化氯（10%食品級）、三氯異氰脲酸（有效氯含量50%）。

1.2方法

1.2.1不同烘烤方式的煙葉霉?fàn)€病調(diào)查。

調(diào)查地點：福建省政和縣楊源鄉(xiāng)密集型烤房?？緹熎贩N：紅花大金元。烘烤方式：①掛竿密集烘烤；②散葉烘烤。根據(jù)肉眼觀察結(jié)果記述不同烘烤方式發(fā)生的煙葉霉?fàn)€病，描述病害癥狀。

1.2.2煙葉霉?fàn)€病的侵染源調(diào)查與鑒定。

1.2.2.1煙葉帶菌調(diào)查。

切取待烤的紅花大金元的健康煙葉葉柄和變黑壞死的煙葉葉柄，各取20根樣本，取上部3～5 cm葉柄，用滅菌水表面沖洗3次，置于水瓊脂平板上30 ℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，定期觀察，待長出菌絲時鏡檢。

1.2.2.2烘烤前后烤房內(nèi)外環(huán)境帶菌收集。采用PDA平板（馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板）捕捉和收集空氣中的孢子。烤房內(nèi)將PDA平板置于烘烤架的上、中、下不同高度，每種高度放5皿。烤房外將PDA平板置于烤房門外、過道、煙堆、煙堆旁邊，每處各放5皿。將PDA平板暴露于空氣中15 min后，蓋好培養(yǎng)皿并用膠帶封口帶回實驗室置于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，24～48 h計數(shù)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)并經(jīng)顯微鏡檢查。

1.2.2.3侵染源鑒定。

（1）形態(tài)學(xué)鑒定。用解剖針挑取烤房內(nèi)PDA平板收集的根霉菌霉層置于載玻片的乳酚油中，制成臨時玻片標(biāo)本，于光學(xué)顯微鏡下觀察病原菌形態(tài)特征，根據(jù)參考文獻[8]進行病原菌種類鑒定。

（2）分子生物學(xué)鑒定。采用SDS法提取病原菌DNA[9]，采用真菌rDNA通用引物ITS1、ITS4對菌絲體的ITS區(qū)進行PCR擴增。ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。120 V電泳30 min，確定擴增到產(chǎn)物后，將PCR產(chǎn)物送至生物技術(shù)公司測序，采用計算機分析軟件MEGA 3.1及NCBI核酸數(shù)據(jù)庫，將所得rDNA-ITS區(qū)序列進行拼接，進行對比分析。

1.2.3病害防治研究。

1.2.3.1藥劑防治方法。

①消毒劑地面潑灑熏蒸處理。開烤前8 h使用消毒劑80倍液對烤房四周內(nèi)壁進行噴霧，用藥量0.5 g/m3；待煙葉掛竿安裝上烤后，用消毒劑50倍液潑灑于烤房地面，地面用藥量為12.0 g/m2，密閉裝煙室30 min后按操作規(guī)程開烤。

②消毒劑煙霧熏蒸處理。即烘烤前8 h將盛有100 g消毒劑鋁制容器置于煤炭爐上加熱，迅速關(guān)好門窗并進行密閉處理，熏蒸5 h后透氣，按規(guī)程裝煙開烤。

③煙葉葉柄藥劑處理?？厩皩σ牙墥旄偷臒熑~于葉柄上噴施消毒劑，消毒劑稀釋50倍，使用量為1.2 g/m3，晾干1 h后上架按規(guī)程開烤。

④對照。處理或噴清水處理。

1.2.3.2防治效果調(diào)查。

烘烤結(jié)束時調(diào)查發(fā)病情況，根據(jù)分級標(biāo)準(zhǔn)計算病情指數(shù)和防治效果。試驗數(shù)據(jù)采用Excel、SPSS軟件進行統(tǒng)計和分析。

煙葉霉?fàn)€病分級標(biāo)準(zhǔn)：

0級，正常煙葉；

1級，葉柄發(fā)霉小于1 cm，葉片不發(fā)病；

2級，葉柄發(fā)霉大于1 cm，葉片不發(fā)?。?/p>

3級，葉柄發(fā)霉且葉片發(fā)霉面積在1%～25%；

4級，葉柄發(fā)霉且葉片發(fā)霉面積在26%～50%；

5級，葉柄發(fā)霉且葉片發(fā)霉面積在50%以上。

病情指數(shù)=（各級病葉數(shù)×相應(yīng)級數(shù)）調(diào)查總?cè)~數(shù)×5×100

防治效果=對照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)對照區(qū)病情指數(shù)×100%

2結(jié)果與分析

2.1煙葉霉?fàn)€類型

根據(jù)調(diào)查結(jié)果分析，煙葉變黃排濕過程中煙葉霉?fàn)€與煙葉表面濕度、含水量及傷口有關(guān)?？緹煵煌婵痉绞狡涿?fàn)€癥狀有2種類型：①葉柄霉?fàn)€型。俗稱“霉頭”，發(fā)生于煙葉扎把掛竿烘烤的烤房。霉變從含水量高的葉柄采摘傷口開始發(fā)生，沿著葉柄逐漸向葉片主脈、側(cè)脈及葉片擴展，導(dǎo)致葉片大面積發(fā)霉腐爛（圖1-A、B）。②葉片霉?fàn)€型。發(fā)生于煙葉散葉插簽裝煙密集烘烤的烤房。由于密集疊放葉片中央濕度大且排濕不暢，霉變從插簽的傷口處開始發(fā)生，向傷口四周及上下葉片擴展，導(dǎo)致成堆葉片霉?fàn)€（圖1-C、D）。

2.2煙葉霉?fàn)€病的侵染源

2.2.1煙葉攜帶根霉菌調(diào)查結(jié)果。

將待烤的煙葉的葉柄樣本置于水瓊脂中30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，4～7 d未攜帶病原菌的健康葉柄依舊保持著新鮮的綠色（圖2-A），未攜帶病原菌的腐爛煙葉柄長出許多細(xì)菌和部分雜菌（圖2-C）。攜帶有病原菌的健康煙柄和腐爛煙柄均長出灰黑色菌絲和孢子囊，孢子囊初期為乳白色到后期變?yōu)楹诤稚▓D2-B、D）。健康葉柄根霉菌帶菌率為20%～30%，腐爛葉柄根霉菌帶菌率為10%～20%（表1）。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2017年

2.2.2烤房及烤房周邊空氣中根霉菌調(diào)查結(jié)果。

開烤前后用PDA平板捕捉烤房內(nèi)外空氣中的根霉菌（圖2-E）。分離結(jié)果表明，烤房內(nèi)外空氣中均存在根霉菌?？痉績?nèi)根霉菌廣泛分布于不同高度的空間中；烤房外根霉菌存在于較高處的空間?？痉績?nèi)烘烤后的根霉菌的數(shù)量顯著多于烘烤前，烤房周圍的根霉數(shù)量也較烘烤前多，說明在烘烤后煙葉大量發(fā)生霉?fàn)€，增加了烤房內(nèi)外環(huán)境中根霉菌的種群密度（表2）。

2.2.3根霉菌種類鑒定。

對烤房內(nèi)捕捉分離的根霉菌進行形態(tài)學(xué)鑒定和生物學(xué)測定，結(jié)合前期的鑒定結(jié)果[7]，確定為米根霉（Rhizopus oryzae Went et Geerligs）。

用真菌rDNA通用引物ITS1、ITS4對煙葉上根霉菌菌株的ITS區(qū)進行PCR擴增，得到1條約600 bp的產(chǎn)物（圖3）。通過測序、拼接及比對及分析，該序列與Genbank上的AY21368等菌株劃在同一個分枝，同屬于米根霉（圖4）。

2.3煙葉霉?fàn)€病的防治

試驗結(jié)果表明，二氧化氯和三氯異氰脲酸能有效防治烘烤期煙葉霉?fàn)€病，明顯降低病害的嚴(yán)重程度（表3和圖5）?？痉垦籼幚硇Ч麅?yōu)于煙草葉柄噴霧消毒處理；用二氧化氯和三氯異氰脲酸于開烤前烤房噴霧消毒，裝煙后烤房地面潑灑熏蒸可以得到較好的防治效果；三氯異氰脲酸煙霧熏蒸效果優(yōu)于潑灑熏蒸。

3討論

煙葉烘烤期霉?fàn)€病是由米根霉侵染引起的一種新的侵染性病害，是煙葉烘烤期的重要病害，對烤煙的產(chǎn)量和質(zhì)量構(gòu)成重大損失。過去將煙葉烘烤期霉?fàn)€稱為“霉頭”，指葉柄頭部發(fā)霉。研究結(jié)果表明，烘烤期的高溫、煙葉表面的高濕度和煙葉組織內(nèi)較高含水量、煙葉創(chuàng)傷和采摘傷口是誘發(fā)煙葉霉變腐爛的重要條件，因此，煙葉烘烤期霉?fàn)€癥狀與煙葉烘烤方式有關(guān)。掛竿烘烤煙葉病害先從葉柄開始發(fā)生，其癥狀為“葉柄霉?fàn)€型”，散葉烘烤煙葉病害從葉面簽插傷口處開始發(fā)生，其癥狀為“葉片霉?fàn)€型”。病害癥狀的系統(tǒng)觀察和描述為病害診斷提供了依據(jù)。

迄今為止，煙葉烘烤期霉?fàn)€病僅在紅花

大金元烤煙品種上發(fā)生，其他烤煙品種鮮見該病的報道，

煙葉烘烤期霉?fàn)€病在烤房內(nèi)高溫高濕的條件下發(fā)生，烤煙又是供人們吸品的特殊作物，必須防止化學(xué)藥物對產(chǎn)品造成殘留和污染。因此，需要研制安全高效和適用的防治技術(shù)。利用二氧化氯和三氯異氰脲酸熏蒸烤房和掛竿煙葉，對煙葉霉?fàn)€病具有很好的防治效果。二氧化氯為聯(lián)合國世界衛(wèi)生組織（WHO）確認(rèn)的 A1 級殺菌消毒劑；三氯異氰尿酸廣泛用于飲食、醫(yī)療衛(wèi)生、水處理等行業(yè)[10-12]。這2種消毒劑在煙草上使用具有無毒無殘留、安全高效等特點，建議在煙草生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。該防治試驗僅在掛竿烘烤的烤房進行，計劃進一步開展熏蒸技術(shù)（藥劑掛袋熏蒸，煙霧熏蒸）和其他烘烤方式（如散葉烘烤）防治技術(shù)研究。

4結(jié)論

煙葉霉?fàn)€病病原菌米根霉 （Rhizopus oryzae）廣泛分布于煙葉表面和烤房內(nèi)外的環(huán)境及空氣中，是病害的初侵染源。米根霉是高溫菌，可在烘烤后的烤房內(nèi)存活和積累?？痉績?nèi)煙葉霉變后產(chǎn)生的病原菌可以成為后烤煙葉的再侵染菌源。

采用二氧化氯和三氯異氰脲酸在煙葉烘烤前期（開烤第1天）熏蒸處理烤房和掛竿煙葉，對煙葉霉?fàn)€病的防治效果在62.62%～69.57%，效果顯著。

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