萬壽菊對煙草根結(jié)線蟲的殺線活性

李曉飛 王云民 徐成龍 張加建

摘要[目的]探究萬壽菊不同組織粗體物和α-三聯(lián)噻吩的殺線活性。[方法]以線蟲拮抗植物萬壽菊為試驗(yàn)材料，煙草根結(jié)線蟲為靶標(biāo)，分別測定和比較了不同濃度萬壽菊各部分組織粗提物的殺線活性、萬壽菊各部分組織粗提物中α-三聯(lián)噻吩的含量以及α-三聯(lián)噻吩標(biāo)準(zhǔn)品的殺線活性。[結(jié)果]萬壽菊的各部分組織粗提物中，葉和花的殺線活性較高；萬壽菊中起主要?dú)⒕€作用的活性物質(zhì)不是α-三聯(lián)噻吩。[結(jié)論]試驗(yàn)結(jié)果為尋找煙田中環(huán)境友好型殺線蟲劑的研究與應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞萬壽菊；煙草；根結(jié)線蟲；殺線活性；α-三聯(lián)噻吩

中圖分類號S435.72文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）19-0136-02

Nematicidal Activity of Marigold against Tobacco Rootknot Nematode

LI Xiaofei， WANG Yunmin， XU Chenglong et al

（Xiangyun Branch of Dali Tobacco Company in Yunnan Province， Xiangyun， Yunnan 672100）

Abstract[Objective] The aim was to explore the nematicidal activity of the extracts from the different organs of marigold and αterthienyl. [Method] Based marigold as experiment material and tobacco rootknot nematode on targets， we determined the nematicidal activity of extracts from the different organs of marigold， the content of αterthienyl from the different organs of marigold and the nematicidal activity of αterthienyl nematodes， respectively. [Result] The extracts from the leaves and flowers of marigold had higher nematicidal activities， and αterthienyl was not the main nematicides substance of marigold. [Conclusion] The results provide theoretical basis for the research and application of environmental friendly nematicides.

Key wordsMarigold；Tobacco；Rootknot nematode；Nematicidal activity；αterthienyl

據(jù)報(bào)道，目前云南省已有多個(gè)地方發(fā)生煙草根結(jié)線蟲病害，且造成了嚴(yán)重?fù)p失[1-4]。根結(jié)線蟲種群增長迅速、防治困難，且其危害多、易傳播、多寄主、頑固且隱蔽，故其造成的危害已日趨嚴(yán)重，對煙草也構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[5]?；瘜W(xué)防治一直是被應(yīng)用較廣泛的一種防治根結(jié)線蟲病害的方法，雖然其具有很好的殺線效果，但由于其毒性高，既影響人類健康，又會帶來一系列副作用，如破壞生態(tài)平衡、造成次要病害猖撅、藥劑殘留造成水土污染、引起人畜中毒、抗性喪失等，所以尋求高效、無公害、可持續(xù)的方法逐漸成為根結(jié)線蟲綜合防治的熱點(diǎn)[6-8]。

很多研究表明，利用抗線蟲植物，將其與易感病植物進(jìn)行輪作或者間作等其他方法，能夠很有效地對根結(jié)線蟲病害進(jìn)行防控[9]。目前，已有多種作物被報(bào)道具有抗線或殺線作用，如菊科類的萬壽菊等[10-11]。有研究表明，將番茄和萬壽菊進(jìn)行輪作，番茄的產(chǎn)量可以提高50%以上[12]。筆者通過對萬壽菊殺線活性的研究探討了煙草根結(jié)線蟲病的生物防治，以期為尋找煙田中環(huán)境友好型殺線蟲劑的研究與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試植物萬壽菊（Tagete erecta）采自云南省大理州祥云縣農(nóng)田，在生長茂盛時(shí)采集，烘干粉碎備用。

供試線蟲為煙草根結(jié)線蟲，采自云南省祥云縣感病煙草根部，經(jīng)分離鑒定為爪哇根結(jié)線蟲（M.javanica）。

1.2方法

1.2.1根結(jié)線蟲的培養(yǎng)。

選取感病嚴(yán)重的煙草根，洗凈，打碎，過200目和500目篩，得線蟲卵塊懸浮液，置于溫箱中25～30 ℃下培養(yǎng)4～5 d，得爪哇根結(jié)線蟲2齡幼蟲，用于試驗(yàn)。

線蟲死亡鑒別：線蟲死亡時(shí)，身體通常呈僵直、螺旋形或彎曲呈弓狀，而活線蟲通常會扭動(dòng)或彎曲。線蟲偶爾也會有假死現(xiàn)象，要完全確定或判斷線蟲死亡有困難時(shí)，可以將線蟲置于清水或2%氯化鈉溶液中，2 min后再觀察。

1.2.2萬壽菊各部分組織粗提物的提取。

分別取萬壽菊根莖葉花的干燥粉末500 g，用10倍體積的75%乙醇重復(fù)超聲提取3次，每次48 h，合并提取液并蒸干，取一定量萬壽菊根莖葉花的粗提物分別配制成濃度為50、25、10 mg/mL的溶液進(jìn)行殺線活性測定，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)對照，另設(shè)無菌水作為空白對照，每個(gè)樣品溶液和對照溶液中分別都加入含100條左右線蟲的懸浮液。36 h后統(tǒng)計(jì)線蟲死亡率。

1.2.3α-三聯(lián)噻吩標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。

稱取α-三聯(lián)噻吩晶體0.1 g，用氯仿稀釋成0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，另設(shè)空白對照。在紫外分光光度計(jì)上于352 nm波長處測定其吸光度，以溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=94.343x+0.266 2，R=0.999 2，樣品溶液的濃度在0.01～1.00 μg/mL時(shí)與吸光度成良好的線性關(guān)系。

1.2.4萬壽菊根莖葉花粗提物中α-三聯(lián)噻吩含量的測定。

分別稱取1 g萬壽菊根、莖、葉、花的粗提物，用氯仿配制成相關(guān)溶液后稀釋30倍，于紫外分光光度計(jì)上352 nm波長處測定其吸光度，再根據(jù)α-三聯(lián)噻吩標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算各部分組織粗提物中α-三聯(lián)噻吩的含量。

1.2.5α-三聯(lián)噻吩標(biāo)準(zhǔn)品的殺線活性測定。

試驗(yàn)分為兩大組：一組是經(jīng)過太陽光活化的α-三聯(lián)噻吩對線蟲的活性測定；一組是未經(jīng)光活化的α-三聯(lián)噻吩對線蟲活性影響的測定。2組試驗(yàn)的步驟設(shè)計(jì)相同，步驟如下：稱取α-三聯(lián)噻吩標(biāo)準(zhǔn)品0.03 g溶于10 mL 95%乙醇，加600 μL Tween-20助溶，此時(shí)α-三聯(lián)噻吩的濃度為0.003 g/mL，取該濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液5 mL裝于有蓋的塑料瓶中，置于太陽光下活化，其余5 mL避光保存。4 h后，分別從經(jīng)過光活化和未經(jīng)光活化的溶液中取500、250、100、75、50、25 μL，置于盛有2 500、2 750、2 900、2 925、2 950、2 975 μL無菌水的培養(yǎng)皿中，光活化和未經(jīng)光活化的試驗(yàn)組每個(gè)濃度分別設(shè)置3個(gè)重復(fù)，則此時(shí)三聯(lián)噻吩的濃度為500、250、100、75、50、25 μg/mL，另設(shè)含有500 μg/mL樣品中等濃度乙醇和Tween-20的無菌水作為對照組，無菌水作為空白對照，最后在每個(gè)培養(yǎng)皿中加入線蟲100條左右，36 h后統(tǒng)計(jì)線蟲死亡率。未經(jīng)光活化的α-三聯(lián)噻吩的殺線活性測定過程皆在避光環(huán)境中進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1萬壽菊不同組織的殺線活性

同一植物不同部位所含物質(zhì)的種類以及同一物質(zhì)含量的不同都會導(dǎo)致不同部位的提取物具有不同的藥理活性或者生物活性。試驗(yàn)結(jié)果顯示，以萬壽菊不同組織不同濃度的粗提物溶液培養(yǎng)線蟲，36 h后統(tǒng)計(jì)線蟲死亡率發(fā)現(xiàn)，萬壽菊各部分組織粗提物對根結(jié)線蟲的毒殺活性大小順序?yàn)榛?、葉、根、莖，且在一定范圍內(nèi)，濃度越高，粗提物的殺線效果也越好，其中當(dāng)粗提物濃度為50 mg/mL時(shí)，花和葉的粗提物溶液中線蟲的校正死亡率分別在90%和80%以上，而根中線蟲的校正死亡率僅超過20%，莖中線蟲的校正死亡率則在10%以下（表1）。

2.2α-三聯(lián)噻吩的殺線活性及萬壽菊各組織粗提物中α-三聯(lián)噻吩的含量

萬壽菊在很早就被國內(nèi)外多名學(xué)者證實(shí)其組織提取物具有較好的殺線作用，α-三聯(lián)噻吩一直是其中爭議較大的一個(gè)物質(zhì)，有研究者證明α-三聯(lián)噻吩的殺線活性需要光的活化，故該研究分別測試了經(jīng)過光活化和未經(jīng)光活化的α-三聯(lián)噻吩的殺線活性。結(jié)果表明，光活化和未經(jīng)光活化的α-三聯(lián)噻吩對根結(jié)線蟲都有一定的生物活性，光活化確實(shí)能提高α-三聯(lián)噻吩的殺線效果，但效果并不明顯，其中光活化和未經(jīng)光活化的α-三聯(lián)噻吩對線蟲的致死中濃度分別為312.5和431.2 μg/mL（表2）。

萬壽菊各部分組織的殺線活性物質(zhì)是否是α-三聯(lián)噻吩，通過檢測各組織中α-三聯(lián)噻吩的含量即可驗(yàn)證，故該研究通過紫外分光光度法檢測萬壽菊各組織粗提物中α-三聯(lián)噻吩的含量。結(jié)果顯示，萬壽菊各部分組織粗提物中α-三聯(lián)噻吩含量大小依次為根（90.15 μg/g）、莖（50.23 μg/g）、葉（28.25 μg/g）、花（27.93 μg/g），這和萬壽菊各部分組織粗提物的殺線活性大小幾乎呈相反的趨勢，且通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濃度為50 mg/mL，對線蟲的致死率在80%以上時(shí)，花和葉的粗提物對應(yīng)試驗(yàn)濃度中所含有的α-三聯(lián)噻吩的量分別僅為1.40和1.41 μg/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于α-三聯(lián)噻吩標(biāo)準(zhǔn)品的致死中濃度，在該濃度下，α-三聯(lián)噻吩是幾乎沒有殺線效果的。故推測，α-三聯(lián)噻吩雖具有一定的殺線效果，但萬壽菊中起主要?dú)⒕€作用的物質(zhì)應(yīng)該不是α-三聯(lián)噻吩。

3結(jié)論與討論

萬壽菊的花一直被認(rèn)為對煙草根結(jié)線蟲病具有較好的殺線活性[13]，但實(shí)際生活中，萬壽菊花一般用于提取葉黃素，已經(jīng)得到了較好的應(yīng)用。該試驗(yàn)結(jié)果顯示，萬壽菊葉的粗提物和花的提取物幾乎具有同等的殺線效果，而實(shí)際應(yīng)用中，葉一般都會被同秸稈等一起焚燒，不僅污染環(huán)境，也造成了資源的極大浪費(fèi)，因此在煙田根結(jié)線蟲的生物防治中，充分利用萬壽菊葉的殺線活性也將具有很好的應(yīng)用前景。同時(shí)發(fā)現(xiàn)并研究萬壽菊葉中起主要作用的活性物質(zhì)及其作用機(jī)制，不僅能夠充分利用萬壽菊葉的殺線作用，同時(shí)也能夠?yàn)橄嚓P(guān)活性物質(zhì)的工業(yè)合成提供一定的理論依據(jù)。

萬壽菊一直是國內(nèi)外學(xué)者研究較多的具有較好殺線效果的植物。關(guān)于其中究竟哪一種物質(zhì)在起主要?dú)⒕€作用一直存在較大爭議[14-15]，一些研究者認(rèn)為α-三聯(lián)噻吩是其中的主要?dú)⒕€物質(zhì)，但該研究結(jié)果顯示，α-三聯(lián)噻吩并不是萬壽菊中起主要?dú)⒕€作用的活性物質(zhì)。在該研究中，通過多次活性試驗(yàn)測定發(fā)現(xiàn)，當(dāng)萬壽菊粗提物對線蟲的浸泡時(shí)間達(dá)36 h時(shí)，其對線蟲的作用效果已基本不會再增強(qiáng)，36 h時(shí)的線蟲死亡率已基本能夠說明粗提物對線蟲的毒殺效果，且由于線蟲的生活周期較短，一般從孵化后7 d其活性就會逐漸降低，故該研究將線蟲死亡率統(tǒng)計(jì)時(shí)間定為浸泡36 h，而認(rèn)為α-三聯(lián)噻吩是萬壽菊中的主要?dú)⒕€物質(zhì)的Uhlcnbrock在研究中對線蟲的死亡率統(tǒng)計(jì)時(shí)間持續(xù)了6 d，且其統(tǒng)計(jì)方法闡述較為模糊，其并未說明統(tǒng)計(jì)的是線蟲的校正死亡率還是總死亡率，所以其統(tǒng)計(jì)的線蟲死亡原因究竟是由于提取物所致，還是時(shí)間的影響，有待進(jìn)一步研究。實(shí)際萬壽菊在起殺線作用時(shí)，其中的α-三聯(lián)噻吩是否很好地受到了光的活化而發(fā)揮了殺線效果，也無法得到驗(yàn)證。楊秀娟等[14]研究表明，以乙醇、水等大極性溶劑作為提取溶劑所得粗提物的殺線活性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于小極性溶劑提取物，而α-三聯(lián)噻吩等噻吩類物質(zhì)多為小極性物質(zhì)，是很難溶于乙醇等大極性溶劑的，且萬壽菊組織中，α-三聯(lián)噻吩在花和葉中的含量是很少的，根中含量最高，而萬壽菊花的殺線效果最好，這在該研究中也得到了驗(yàn)證，所以這和一些研究者認(rèn)為萬壽菊中起主要?dú)⒕€作用的活性物質(zhì)是α-三聯(lián)噻吩相矛盾。

后續(xù)研究需對萬壽菊中的主要?dú)⒕€活性物質(zhì)進(jìn)行分離和鑒定，以其為模板進(jìn)行人工合成。

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