異常漢遜酵母和植物乳桿菌菌液濃度與光密度值的關(guān)系研究

江月 何松貴 周世水

摘要[目的]探索一種快速測(cè)定異常漢遜酵母和植物乳桿菌菌液濃度的方法。[方法]采用分光光度法測(cè)定菌液的光密度值（OD值），平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定異常漢遜酵母和植物乳桿菌的菌液濃度，并研究?jī)烧叩南嚓P(guān)關(guān)系。[結(jié)果]異常漢遜酵母在YEPD培養(yǎng)基中指數(shù)期的菌液濃度與光密度值呈現(xiàn)極顯著的線(xiàn)性相關(guān)關(guān)系，菌液濃度（y）與光密度值（x）線(xiàn)性回歸方程：y = 2.246x-0.030（R2=0.998 6） 。植物乳桿菌在MRS肉湯培養(yǎng)基中指數(shù)期菌液濃度的對(duì)數(shù)值與光密度值呈現(xiàn)極顯著的線(xiàn)性相關(guān)關(guān)系，菌液濃度的對(duì)數(shù)值（y）與光密度值（x）線(xiàn)性回歸方程：y=0.172 4x+8.432 1（R2=0.996 6）。[結(jié)論]分光光度法可用于快速測(cè)定異常漢遜酵母和植物乳桿菌菌液濃度。

關(guān)鍵詞異常漢遜酵母；植物乳桿菌；菌液濃度；光密度值；回歸方程

中圖分類(lèi)號(hào)TS201.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）19-0099-02

Research on the Relationship between Bacteria Concentration and Optical Density of Hansenula anomala and Lactobacillus plantarum

JIANG Yue1， HE Songgui2， ZHOU Shishui1*

（1.College of Biological Science and Engineering， South China University of Technology， Guangzhou， Guangdong 510006； 2.Guangdong Jiujiang Distillery Co. Ltd.， Foshan， Guangdong 528205）

Abstract[Objective] To explore a rapid measurement for bacteria concentration of Hansenula anomala and Lactobacillus plantarum. [Method] Spectrophotometry and plate counting were used to determine the optical density （OD） and bacteria fluid concentration respectively， investigate the correlations between them. [Result] The correlations of the optical density with bacteria concentration were well. Bacterial concentration（y） and optical density （x） linear regression equation was established of Hansenula anomala YEPD medium in logarithmic phase： y = 2.246x-0.030 （R2 =0.998 6）. The logarithm of bacterial concentration （y） and optical density （x） linear regression equation was established of Lactobacillus plantarum MRS medium in logarithmic phase： y= 0.172 4x+8.432 1（R2 = 0.996 6）. [Conclusion] Spectrophotometric method can be used for rapid determination of Hansenula anomala and Lactobacillus plantarum bacteria fluid concentration.

Key wordsHansenula anomala；Lactobacillus plantarum；Bacteria fluid concentration；Optical density；Regression equation

作者簡(jiǎn)介江月（1992—），女，湖北隨州人，碩士研究生，研究方向：麥芽飲料發(fā)酵工藝。*通訊作者，副教授，博士，從事發(fā)酵工程方面的研究。

收稿日期2017-04-28

酵母菌和乳酸菌是發(fā)酵飲料釀造過(guò)程中的重要菌種，對(duì)產(chǎn)品的風(fēng)味和質(zhì)量的穩(wěn)定性具有重要影響。因此，發(fā)酵工藝中酵母菌和乳酸菌菌液的接種量對(duì)終產(chǎn)品的品質(zhì)具有重要意義。一般意義上理解，接種量是指接入種子液的體積占接種后培養(yǎng)液體積的百分比。但是標(biāo)準(zhǔn)工藝中或科研中，需要對(duì)工藝進(jìn)行精確控制，此時(shí)接種量一般是指所使用菌種濃度[1]。

菌液濃度一般采取2種測(cè)定方法[2-3]。一為平板菌落計(jì)數(shù)法，這種方法可以比較準(zhǔn)確地測(cè)定菌液濃度，但是時(shí)間上有明顯的滯后性。二為比濁法，該方法可以迅速地判斷菌液濃度，但是誤差較大，準(zhǔn)確性不高。

該研究擬采用分光光度法測(cè)定菌液的光密度值（OD值），平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定異常漢遜酵母和植物乳桿菌的菌液濃度，并研究?jī)烧叩南嚓P(guān)關(guān)系，探索一種快速測(cè)定異常漢遜酵母和植物乳桿菌菌液濃度的方法，為發(fā)酵飲料確定菌種濃度提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。異常漢遜酵母（Hansenula anomala）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）均為華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.1.2培養(yǎng)基。

YEPD培養(yǎng)基：酵母浸膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0，115 ℃高壓滅菌20 min。YPD培養(yǎng)基：在YEPD培養(yǎng)基中加入20 g/L瓊脂粉，115 ℃滅菌20 min。

MRS肉湯培養(yǎng)基：稱(chēng)取本品 52.4 g，蒸餾水 1 000 mL，115 ℃高壓滅菌20 min。配制固體培養(yǎng)基則再加入20 g/L瓊脂粉，115 ℃滅菌20 min。

1.1.3主要儀器。搖床，太倉(cāng)市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；生化培養(yǎng)箱，重慶市永生實(shí)驗(yàn)儀器廠；752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1種子液制備。酵母菌種子液的培養(yǎng)：接種一環(huán)斜面酵母菌于100 mL YEPD 培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)13 h，經(jīng) 2～3 次傳代與擴(kuò)大培養(yǎng)后制成酵母菌種子液，冷藏備用。

乳酸菌種子液的培養(yǎng)：接種一環(huán)活化后的斜面植物乳桿菌于100 mL MRS培養(yǎng)基中，35 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)13 h，經(jīng) 2～3 次傳代與擴(kuò)大培養(yǎng)后制成乳酸菌種子液，冷藏備用。

1.2.2培養(yǎng)液收集。向裝有100 mL YEPD培養(yǎng)基的三角瓶中接入2 mL酵母種子液，混勻后搖床培養(yǎng)（30 ℃，180 r/min），每隔2 h 取樣。

向裝有100 mL MRS液體培養(yǎng)基的三角瓶中接入2 mL乳酸菌種子液，混勻后搖床培養(yǎng)（35 ℃，180 r/min），前期每2 h取樣，后期每1 h取樣。

1.2.3光密度值測(cè)定。以未接種的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，采用分光光度計(jì)（λ=600 nm）測(cè)定培養(yǎng)期間菌液的光密度值（OD600值），每份樣品做3個(gè)平行。若菌懸液太濃，應(yīng)用未接種的培養(yǎng)基適度稀釋?zhuān)筄D600 值在0.2～0.8范圍內(nèi)。

1.2.4

平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)菌液濃度。無(wú)菌操作把培養(yǎng)液樣品搖勻后進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)ㄏ♂尪纫话銥?0-4、10-5、10-6），分別吸取100 μL 稀釋液涂平板（3個(gè)平行），恒溫（30±1）℃培養(yǎng) 24～36 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1酵母菌和乳酸菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

該試驗(yàn)得出異常漢遜酵母和植物乳桿菌培養(yǎng)期間培養(yǎng)液的OD600值，并以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，分別繪制酵母菌和乳酸菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。

2.2異常漢遜酵母指數(shù)期菌液濃度與光密度值的關(guān)系

以O(shè)D600值為橫坐標(biāo)，菌液濃度為縱坐標(biāo)，運(yùn)用Stata13軟件，繪制 XY 散點(diǎn)圖，線(xiàn)性擬合得出兩者的回歸曲線(xiàn)（圖3）?；貧w方程為y=2.246x-0.030（R2=0.998 6），顯著性檢驗(yàn)結(jié)果（F=8 356.11，P=0<0.01）表明兩者之間呈現(xiàn)極顯著的線(xiàn)性相關(guān)關(guān)系，這與馬勇等[4-5]的研究發(fā)現(xiàn)一致。

2.3植物乳桿菌指數(shù)期菌液濃度與光密度值的關(guān)系

以O(shè)D600值為橫坐標(biāo)，菌液濃度的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，運(yùn)用Stata13軟件繪制 XY 散點(diǎn)圖，線(xiàn)性擬合得出兩者的回歸曲線(xiàn)（圖4）?；貧w方程為y=0.172 4x+8.432 1（R2=0.996 6），顯著性檢驗(yàn)結(jié)果（F=281.83，P=0<0.01）表明兩者之間呈現(xiàn)極顯著的線(xiàn)性相關(guān)關(guān)系。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，以O(shè)D600值為橫坐標(biāo)，對(duì)數(shù)期的菌液濃度為縱坐標(biāo)，回歸方程不顯著，這與嚴(yán)佩峰等[6]的研究結(jié)果有所不同。

3結(jié)論與討論

該試驗(yàn)探索了一種快速測(cè)定異常漢遜酵母和植物乳桿菌菌液濃度的方法。通過(guò)對(duì)異常漢遜酵母和植物乳桿菌培養(yǎng)過(guò)程中光密度值（OD600值）的測(cè)定，結(jié)合平板菌落計(jì)數(shù)得到菌液濃度，建立了兩者的相關(guān)關(guān)系：異常漢遜酵母指數(shù)期菌液濃度（y）與光密度值（x）的回歸方程y = 2.246x-0.030（R2=0.998 6），植物乳桿菌指數(shù)期菌液濃度的對(duì)數(shù)值（y）與光密度值（x）的回歸方程y = 0.172 4x+8.432 1（R2=0.996 6）。通過(guò)分光光度法測(cè)定菌液的OD600值可以判斷菌體是否進(jìn)入指數(shù)期，同時(shí)可以實(shí)時(shí)準(zhǔn)確地掌握菌液濃度。

參考文獻(xiàn)

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