進(jìn)境百合種球中鐮刀菌的分離鑒定

李敏 宋蘊(yùn)哲 虞赟 陳智明 劉國(guó)坤 沈建國(guó)

摘要 [目的]從日本進(jìn)境百合種球中發(fā)現(xiàn)帶有褐色、不規(guī)則病斑的種球，對(duì)其進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)，以明確其病原種類(lèi)及分類(lèi)地位。[方法]通過(guò)菌落形態(tài)特征觀(guān)察、ITS序列分析、致病性測(cè)定對(duì)該分離物進(jìn)行鑒定。[結(jié)果]該分離物接種百合種苗引起枯萎反應(yīng)，ITS序列和層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）的序列相似性為100%，結(jié)合分離物的菌落特征和孢子特征將病原菌鑒定為層出鐮刀菌。[結(jié)論]引起百合種球病斑的病原菌為層出鐮刀菌。

關(guān)鍵詞 百合；種球；層出鐮刀菌；鑒定

中圖分類(lèi)號(hào) S41；S436.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）04-0008-03

Identification of Fusarium proliferatum in Introduced Lily Bulbs

LI Min1， SONG Yun-zhe2， YU Yun1， SHEN Jian-guo1* et al

（1.Inspection and Quarantine Technology Center， Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Fuzhou， Fujian 350000；2.College of Plant Protection， Fujian Agriculture and Forest University， Fuzhou， Fujian 350002）

Abstract [Objective] The pathogene was isolated and cultured from the lily bulbs introduced from Japan which had brown and irregular disease spot， so as to determine its taxonomic status. [Method] The pathogene were identified by pathogenicity determination，morphology observation and ITS sequence analysis. [Result] The ITS sequence of the pathogen causing wilt in lily identity of 100% with Fusarium proliferatum published in GenBank. [Conclusion] The results indicated that the pathogene isolated from the lily bulbs with black brown and irregular disease spot were F. proliferatum.

Key words Lily；Bulbs；F. proliferatum；Identify

鐮刀菌可引起百合枯萎病，是影響百合生產(chǎn)的重要病害之一[1]。該病原菌主要侵染百合肉質(zhì)根或鱗莖盤(pán)基部，引起肉質(zhì)根和盤(pán)基變褐腐爛，并可向上發(fā)展導(dǎo)致鱗片出現(xiàn)褐色凹陷病斑，后期鱗片從盤(pán)基散開(kāi)并剝落。罹病鱗莖的植株明顯矮化，葉片由上而下黃化，最后枯萎而死[2]。2016年福建出入境檢驗(yàn)檢疫局從日本進(jìn)境的百合種球中發(fā)現(xiàn)帶有褐色、不規(guī)則病斑的種球，對(duì)其進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)，利用菌落形態(tài)特征觀(guān)察、ITS序列分析、致病性測(cè)定對(duì)該分離物進(jìn)行了鑒定，旨在為百合枯萎病的研究與防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為日本進(jìn)境百合種球，進(jìn)境時(shí)間為2016年3月。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離。

選取有病斑的感病種球進(jìn)行病原菌分離。種球病斑部位用70%乙醇表面消毒，切取病健交界處的組織，置入5% NaClO消毒3 min，無(wú)菌水漂洗3次后，將組織切成小塊接種于PDA培養(yǎng)基平板上，25 ℃培養(yǎng)。取菌落邊緣的菌絲進(jìn)行純化3次后用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 致病性測(cè)試。

將培養(yǎng)基上的分離物用滅菌水稀釋后制成懸浮液，以孢子懸浮液作為接種體，采用灌根接種法接種百合幼苗植株。接種后用塑料袋罩好，置于25 ℃生化培養(yǎng)中保濕48 h。去掉塑料袋，將植株移至溫室正常生長(zhǎng)，以滅菌水為對(duì)照，觀(guān)察植株的發(fā)病情況。

1.2.3 形態(tài)學(xué)鑒定。

觀(guān)察菌落在PDA培養(yǎng)基上的顏色和形態(tài)，在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察病原菌的分生孢子梗、分生孢子、分生孢子器的形狀和顏色，測(cè)量其大小，并顯微拍攝。根據(jù)病原菌的形態(tài)特征，進(jìn)行病原菌種類(lèi)的鑒定，以明確病原菌的分類(lèi)地位。

1.2.4 分子生物學(xué)方法鑒定。

1.2.4.1 總DNA提取。

將PDA培養(yǎng)基上的菌絲挑至1.5 mL分離管中，采用植物基因組提取試劑盒（TIANGEN公司，DP305-02）提取病原菌總DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 ITS區(qū)PCR擴(kuò)增。

采用真菌通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）/ ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

擴(kuò)增體系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 pmol/L）各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O補(bǔ)至25.0 μL。反應(yīng)循環(huán)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 延伸10 min。

取10.0 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠1×TAE緩沖液中電泳，核酸染料染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析。擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，所得序列經(jīng)Contig軟件進(jìn)行正反向拼接、人工校對(duì)后提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast，與GenBank中的核酸序列進(jìn)行比對(duì)與同源性分析，確定菌株類(lèi)別。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)特征

從百合種球的褐色、不規(guī)則病斑中分離出1株分離物（圖1），編號(hào)為bh-1，PDA培養(yǎng)基上菌落白色，圓形，菌絲疏松如絮狀，基底粉色，略帶紫色（圖2）。分生孢子梗瓶頸狀（圖3）。小型分生孢子較多，卵圓形至長(zhǎng)圓形，有0～1個(gè)分隔，大小為（4.7～12.1） μm×（1.4～3.9） μm，著生于分生孢子梗上，常在瓶梗頂端聚成球團(tuán)；大型分生孢子較少，紡錘形或鐮刀形，較粗壯，稍彎曲，有3～5個(gè)分隔，大小為（17.3～ 40.7） μm×（2.1～4.8） μm（圖4）。

2.2 致病性測(cè)試

將孢子懸浮液接種到健康百合幼苗植株上，7 d后葉片頂部黃化，隨后葉片由上而下黃化、萎蔫，15 d后枯萎而死。從接種發(fā)病的病株上分離獲得一致的病原菌，無(wú)菌水對(duì)照植株未出現(xiàn)癥狀（圖5）。

2.3 序列分析

利用真菌通用引物ITS/I4TS5對(duì)分離物bh-1提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCP擴(kuò)增產(chǎn)物雙向測(cè)序后拼接得到557 bp的序列（圖6）。將該序列提交到NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，分離物bh-1與GenBank中Fusarium proliferatum（登錄號(hào)：KJ767073、EU151484、FJ040179）的ITS區(qū)序列同源性均達(dá)100%。結(jié)合菌落、分生孢子、培養(yǎng)性狀等形態(tài)學(xué)特征和ITS區(qū)的DNA序列分析，確定分離物bh-1為層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）。

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)，隨著物質(zhì)文化生活水平的不斷提高，人們對(duì)各種苗木、花卉和盆栽等景觀(guān)植物的需求不斷增長(zhǎng)，越來(lái)越多的游客在進(jìn)境或郵寄包裹時(shí)攜帶花卉種子、種球及植株等。鐮刀菌屬是進(jìn)境水果、種苗等植物產(chǎn)品中經(jīng)常截獲的有害生物，而長(zhǎng)期以來(lái)該屬病原菌的命名較混亂，加之其病原菌種類(lèi)較多，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法為真菌分類(lèi)研究提供了必要前提，但存在外界因素和人為因素的局限性，尤其分離培養(yǎng)物的培養(yǎng)性狀不典型或者不產(chǎn)孢時(shí)，為該菌的口岸檢疫鑒定工作增加了一定困難。

鐮刀菌屬真菌可侵染農(nóng)作物、觀(guān)賞植物等100余種，引起植物根腐、莖腐、穗腐等多種病害，導(dǎo)致植物萎蔫死亡[3]。層出鐮刀菌又稱(chēng)層生鐮刀菌或再育鐮刀菌，該菌寄主廣泛，可侵染玉米、向日葵、大蒜、瓜類(lèi)等多種作物及觀(guān)賞植物[4-7]。國(guó)內(nèi)對(duì)百合病害的研究中少有報(bào)道該菌，前人報(bào)道了云南百合、龍牙百合、甘肅百合、江西百合枯萎病的主要致病菌均為尖孢鐮刀菌[1，8-10]；李誠(chéng)等[11]報(bào)道蘭州百合枯萎病病原為尖孢鐮刀菌、串珠鐮刀菌（F.rnoniliforme）和茄腐皮鐮刀菌（F.solani）。在國(guó)外研究中，Prados-ligero等[12]報(bào)道了 Fusarium proliferatum引起西班牙百合枯萎病。該研究采用真菌利用ITS通用引物，擴(kuò)增百合種球中分離物bh-1的DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，所得序列與GenBank中的核酸序列進(jìn)行比對(duì)，初步確定病原菌種類(lèi)，結(jié)合菌落、分生孢子、培養(yǎng)性狀等形態(tài)學(xué)特征，查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，確定分離物bh-1為層出鐮刀菌（F.proliferatum），這與Prados-ligero等[12]的研究結(jié)論一致。該研究將傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，可以快速地對(duì)層出鐮刀菌進(jìn)行鑒定，兼顧鑒定檢疫的效率和質(zhì)量，為層出鐮刀菌的鑒定和進(jìn)境口岸檢疫提供理論依據(jù)。

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